專利名稱::一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法
技術領域:
:本發(fā)明涉及種提高植物愈傷組織繁殖系數的方法,具體涉及一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法。
背景技術:
:甘蔗組織培養(yǎng)是一種高效的繁殖技術,可以加速甘蔗良種的快速繁殖,解決甘蔗生產上因用種量大而消耗大量原料蔗的問題。采用組織培養(yǎng)的方法,周年規(guī)模化生產性狀整齊一致的種苗供生產上應用,是解決相關地區(qū)甘蔗良種苗短缺的重要途徑。然而,不同作物品種對同一種培養(yǎng)基的反應不同,存在品種特異性問題,有的培養(yǎng)效果很好,而有的則繁殖系數很低,特異性強的品種甚至無法完成再生過程。從植物細胞組織培養(yǎng)過程可以發(fā)現,不同物種的愈傷組織培養(yǎng)條件差異很大,部分物種愈傷組織的誘導、分化和生根的某個階段存在技術瓶頸,尚不能形成完整的再生體系,從而限制了組織培養(yǎng)技術在植物快繁和遺傳改良(如轉基因等)上的應用,甘蔗也是如此。針對這些問題,早在上世紀就有人做過在培養(yǎng)基中附加天然提取物的試驗以改善培養(yǎng)效果,且有一定的收效,如上世紀40年代VanOverbeek使用椰乳(CW)培養(yǎng)曼陀羅的心形胚獲得較好的培養(yǎng)效果;陳發(fā)菊等通過活性碳和椰乳對文心蘭離體芽尖培養(yǎng)的影響研究,結果表明細胞分裂素是存在于椰乳中主要的活性物質,并對文心蘭叢生芽的分化具明顯的促進作用;鄭啟發(fā)等通過利用IH交設計試驗法研究了椰乳在誘導階段對龍眼和荔枝的幼胚愈傷組織產生的影響,結果表明適當CW濃度(10e/。)可提高龍眼愈傷組織的產量,而荔枝愈傷組織的產生并不需要cw。劉曉燕等人通過添加有機物(椰乳,香蕉,馬鈴薯,蘋果)對影響蝴蝶蘭原球莖(/^Woco/ot-eto-k,簡稱PLB)增殖效果進行了研究,發(fā)現使用有機添加物對PLB增殖有影響,其中以椰乳增殖效果最好。中山大學生命科學院對椰乳在植物中的作用也進行了研究,他們通過設計椰乳的梯度(0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%),在香蕉的薄片外植體的愈傷組織誘導中,隨著梯度的增加,誘導Mi的愈傷組織透明度增加、致密,'質量較好。椰乳作為添加物在多種植物組織培養(yǎng)中對提高愈傷組織的質量、產量和促進愈傷組織的分化具有明顯的作用??梢?,椰乳可以作為完善植物組織培養(yǎng)再生體系的添加劑使用。但是,以往的研究并沒有系統(tǒng)研究添加椰乳的最佳體積,且也沒有確定在植物組織培養(yǎng)中的那個階段有明顯的促進作用
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法,重點是提高甘蔗愈傷組織的分化率。本發(fā)明的一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法,由以下步驟組成-(1)材料選擇。選擇甘蔗栽培品種誘導愈傷組織,培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基配方。取入選甘蔗種莖的蔗稍,保留帶部分心葉包裹的莖尖2530公分,在接種間超凈工作臺上用75%酒精浸泡30秒,再用0.1%HgCl溶液處理,15分鐘滅菌,用無菌蒸餾水沖洗45次后晾十備用;所述MS培養(yǎng)基為1962年,Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基配方。3(2)誘導培養(yǎng)。在無菌條件下,小心剝去材料外部包裹的葉片,露出幼嫩的心葉,用解剖刀將生長點以上0~5cm的心葉橫切成厚25rara左右的均勻小圓片,接到誘導培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng);在2728t;的暗室內培養(yǎng)3(K40天;所述誘導培養(yǎng)基為MS+3.Omg/L2,4-D+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂粉。(3)繼代培養(yǎng)。愈傷組織產生后,選取生長良好、金黃、致密的愈傷組織轉移到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。在2728。C的暗室內培養(yǎng),每15天繼代一次;所述繼代培養(yǎng)基為MS+2.Omg/L2,4D+308幾蔗糖+6.(^/1瓊脂粉。(4)分化培養(yǎng)。從繼代的愈傷組織中選取生長良好、金黃、致密的愈傷組織,取直徑5mm、大小一致的愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)。所述分化培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.Og/L瓊脂粉+5%~20%體積椰乳;所述5%~20%體積椰乳,是指椰乳體積占培養(yǎng)基總休積的5%~20%。所述椰乳為鮮椰子汁,制備方法是選取不完全成熟的鮮椰子,取其中的鮮椰子汁,混合后等量分裝,-20^條件下保存?zhèn)溆谩R樽鳛橥晟浦参锝M織培養(yǎng)再生體系的添加劑,它可以在甘蔗愈傷組織分化階段起到顯著提高分化率、再生苗苗高和壯苗的作用。本發(fā)明經過了多次的試驗和統(tǒng)計分析,確定了在甘蔗組織培養(yǎng)的愈傷組織分化階段,往培養(yǎng)基中添加椰乳的體積在5%~20%范圍內均具有提高甘蔗愈傷組織分化率的作用,其中,添加15%體積的椰乳效果最佳,可以提高甘蔗愈傷組織分化率在100%以上,效果顯著。不同椰乳添加體積對不同廿蔗品種愈傷組織分化率和壯苗作用的多重比較結果見表l。表1不同椰乳添加體積對不同甘蔗品種愈傷組織分化率和壯苗作用的多重比較(SSR法)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表1采用字母標記的方法來表示多重比較結果,按照統(tǒng)計分析平均數多重比較標記字母法規(guī)定,用小寫拉丁字母a、b、c、d……表示差異顯著水平u=0.05,用大寫拉丁字母A、B、C、D……表示差異顯著水平a=0.01。先將各處理平均數由大到小排列,最大平均數后標記字母a或A,并將該平均數與以下各平均數依次相比,差異顯著的依次標記b或B,依次類推,不顯著的標記同一宇母。兩平均數之間凡有相同字母的即為差異不顯著,否則為差異顯著。從各均值可以直觀地看出總體上添加5%椰乳體積已經具有促進作用,15%以上具有極顯著的促進作用,可以使愈傷組織分化率平均提高100%以上,并且隨著椰乳添加體積的增加促進作用增強。從不同受試品種的角度,從多重比較的結果可以看出對于FN95-1702,添加10%椰乳體積對分化率和再生苗苗高的促進作用達到極顯著水平,而對苗粗則影響不大;對于FN99-2308,添加15%椰乳體積對分化率和苗高的促進作用均達到極顯著水平,對苗粗添加5%椰乳體積就能達到極顯著水平;對于FN99-20169,對分化率添加5%椰乳體積就能達到極顯著水平,而對苗高則要20%體積才達極顯著水平,對苗粗添加l(W達到極顯著水平。從總體上看,添加不同體積的椰乳處理對受試材料愈傷組織的分化率和芽高、苗粗均有促進作用。如表2所示,在愈傷組織分化率上,添加椰乳體積為5%的分化率就能極顯著高于對照,隨著椰乳添加體積的增加分化率提高;在不同椰乳添加體積對再生苗苗高影響的多重比較中,如表3所示,椰乳添加體積為10%時苗高才極顯著高于對照,隨著椰乳添加體積的增加苗卨增加;對于苗粗,添加5%體積的椰乳就有極顯著的促進作用,詳見表4不同椰乳添加體積對再生苗苗粗影響的多重比較,但品種之間存在差異。綜合椰乳的成本和對愈傷組織的作用,以15%作為添加椰乳的最適體積。表2不同椰乳添加體積對分化率影響的多重比較(SSR法)椰乳體積分化率均值(%)5%顯著水平1%極顯著水平20%64.46aA15%36.54bB10%30.93cC5%25,43dD0%18.02eE表2采用字,標記的方法來表示多重比較結果,字母標記的方法同表l。從表2可以看出,添加5%椰乳體積對所有參試品種分化率的促進作用就已達到極顯著水平,并且隨著椰乳添加體積的增加促進作用增強。表3不同椰乳添加體積對再牛:苗苗高影響的多重比較(SSR法)椰乳體積再生,苗,均值5%顯著水平1%極顯著水平(cm)20%80.17aA15%61.28bB10%55.67bBC5%44.83cCD0%37.83cD表3采用字母標記的力'法來表示多重比較結果,字母標記的方法同表1。從表3可以看出,添加10%椰乳體積對所有參試品種再生苗苗高的促進作用達到極顯著水平,并且隨著椰乳添加體積的增加促進作用增強。表4不同椰乳添加體積對再生苗苗粗影響的多重比較(SSR法)椰乳體積苗粗均值(mm)5%顯著水平1%極顯著水平20%1.74aA15%1.66aA10%1,47bB5%1.30cC0%1.01dD表4采用',:母標記的方法來表示多重比較結果,字母標記的方法同表1。從表4可以看出,添加5%椰乳體積對所有參試品種冉生苗苗粗的促進作用達到極顯著水平,并且隨著椰乳添加體積的增加促進作用增強。上述實驗證實了添加椰乳的體積在5%-20%范圍內均適合,從提高效率的效果和添加椰乳的成本考慮,添加15%體積的椰乳最佳。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)效率高應用本發(fā)明方法可以極顯著提高甘蔗愈傷組織分化率,可高達100%以上;(2)完善甘蔗組培再生體系不同物種的愈傷組織培養(yǎng)條件差異很大,部分物種愈傷組織的誘導、分化和生根的某個階段存在技術瓶頸,尚不能形成完整的再生體系。受試的甘蔗品種中FN95-1702分化困難,另外兩個品種是第一次進行組織培養(yǎng)。添加椰乳后分化率均極顯著高于對照,可見添加椰乳可以有效完善甘蔗組培再生體系;(3)培育壯苗添加椰乳可以培育壯苗;(4)操作簡便與以往的組織培養(yǎng)的歩驟只多出一個步驟,即只需在分化階段采用本發(fā)明優(yōu)6化的培養(yǎng)基,并向其中添力1115%體積的椰乳即可,培養(yǎng)基的配制也簡單;(5)推廣性好本發(fā)明實用性強,操作簡便,推廣性好。具體實施方式為了充分公開本發(fā)明的一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法,以下結合實施例加以說明。實施例一一種提高甘庶愈傷組織繁殖系數的方法,由以下步驟組成(1)選擇種性優(yōu)良但分化有一定困難的FN95-1702、FN99-20169和FN99-2308三個甘蔗品種的愈傷組織為材料。培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基配方(Murashige和Skoog,1962)。取入選甘蔗種莖的蔗稍,保留莖尖(帶部分新葉包裹)25公分,在接種間超凈工作臺上用75%酒精浸泡30秒,再用0.l%HgCl溶液處理15分鐘滅菌,用無菌蒸餾水沖洗5次后晾干待用。(2)在無菌條件下,小心剝去材料外部包裹的葉片,直到露出幼嫩的心葉為止,用解剖刀將生長點以上3cm的心葉橫切成厚3mm的均勻小圓片,接到誘導培養(yǎng)基上(MS+3.0mg/L2,4-D+308/1蔗糖+6.08幾瓊脂粉)進行誘導培養(yǎng)。在27'C的暗室內培養(yǎng)35天。(3)愈傷組織產生后,選取生長良好、金黃、致密的愈傷組織轉移到繼代培養(yǎng)基上(MS+2.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂粉)進行繼代培養(yǎng)。在28'C的暗室內培養(yǎng),每15天繼代一次。(4)從繼代的愈傷組織中選取生長良好、金黃、致密的愈傷組織,取直徑5mm、大小一致的愈傷組織分別轉入分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂粉+15%體積椰乳;所述15%體積椰乳,指椰乳體積占培養(yǎng)基總體積的15%。每個品種處理設椰乳水平為15%、6次重復,每瓶10塊愈傷組織塊(5mmX5mm),隨機排列,在28。C的光照培養(yǎng)室中分化培養(yǎng),15天轉接1次,轉接2次后,在甘蔗愈傷組織分化期間調查發(fā)芽率,出苗后調查芽高、苗粗;調査結果,FN95-1702、FN99-2308和FN99-20169三個甘蔗品種的愈傷組織分化率均值分別達44.92%(對照21.90%)、22.54%(對照11.43%)和42.17%(對照20.74%)。權利要求1、一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法,包括材料選擇、誘導培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和分化培養(yǎng),其特征在于分化培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂粉+5%~20%體積椰乳。2、根據權利要求1所述的一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數方法,其特征在于分化培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.Og/L瓊脂粉+15%體積椰乳。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高甘蔗愈傷組織繁殖系數的方法,具體是通過添加一定體積的椰乳大幅度提高甘蔗愈傷組織的分化率和培育壯苗。該發(fā)明的設計方案是將處理過的甘蔗莖尖心葉經過誘導產生愈傷組織后,在分化階段往培養(yǎng)基中添加5%~20%體積的椰乳,可以極顯著地提高愈傷組織分化率,一般比對照提高100%,并且培育壯苗。該方法解決了甘蔗組織培養(yǎng)中某些品種能夠正常誘導愈傷組織但分化困難的問題,有效完善了甘蔗組培再生體系,極顯著提高愈傷組織分化率,促進組織培養(yǎng)在良種快繁中的廣泛應用。文檔編號C12N5/04GK101560493SQ20091011189公開日2009年10月21日申請日期2009年6月3日優(yōu)先權日2009年6月3日發(fā)明者傅華英,林慶良,王恒波,許莉萍,陳如凱,陳嵐鳳,陳平華,陳由強,陳舜彬,黃國強申請人:福建農林大學