專利名稱：：蠟狀芽孢桿菌微生物制劑和該制劑處理含氮廢水的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株具有脫氮性能的蠟狀芽孢桿菌，及由該菌株制備的微生物制劑和利用該微生物制劑處理含氮廢水的方法，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的廢水脫氮方法中，氨氮需經(jīng)過硝化菌轉(zhuǎn)變?yōu)橄趸?，再通過反硝化菌將水中的硝基氮還原成氣態(tài)，從水中排除。但是近年來，有不少文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一些反硝化菌同時(shí)兼具硝化性能，這種菌可以將氨氮直接轉(zhuǎn)變成氮的氣態(tài)形式將氮從水體中直接排出。這種菌具有很高的利用價(jià)值，在廢水脫氮中可以減少脫氮步驟，節(jié)省時(shí)間，提高處理效率。發(fā)明人早期專利"具有好氧反硝化性能的戴爾福特菌及其處理廢水的方法"ZL200610140872.3，該專利是一種涉及采用戴爾福特(Delftiatsurahatensis)WXZ-9CGMCCNo.l797菌株在好氧條件下進(jìn)行生物脫氮處理廢水的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的睪丸酮叢毛單胞菌及其處理廢水的方法"ZL200610140870.4，該專利是一種涉及采用睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)WXZ-18CGMCCNo.1800菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的惡臭假單胞菌及其處理廢水的方法"ZL200610140871.9，該專利是一種涉及采用惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)WXZ-4CGMCCNo.l798菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的草螺菌及其處理廢水的方法"ZL200610140869.1，該專利是一種涉及采用草螺菌(Herbaspirillumhuttiense)WXZ-14CGMCCNo.1799菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。這四項(xiàng)專利所涉及的這些菌株具有優(yōu)異的好氧反硝化性能，可以去除廢水中的硝基氮和亞硝基氮。異養(yǎng)硝化作用(heterotrophicnitrification)是異養(yǎng)微生物參與無機(jī)氮氧化的生物化學(xué)過程，它的底物是無機(jī)態(tài)氨氮。近年來，有研究者提出更為嚴(yán)格的異養(yǎng)硝化作用的定義為(Papen，1998):異養(yǎng)微生物在好氧條件下將氨/銨或是有機(jī)態(tài)氮氧化到羥胺，亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程，即細(xì)3/細(xì)/RNH2NH2OH4叫~>NO;目前國(guó)外的研究報(bào)道中尚未見芽孢桿菌異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的報(bào)道，但國(guó)內(nèi)已有了相關(guān)的研究。郝桂玉研究了SBR中芽孢桿菌的異養(yǎng)硝化作用，指出SBR周期連續(xù)運(yùn)行后，污泥濃度會(huì)相對(duì)穩(wěn)定，芽孢桿菌能很好適應(yīng)好氧與缺氧環(huán)境，成為污泥中的優(yōu)勢(shì)菌種。但在馴化過程中，進(jìn)水氨氮濃度在20mg/L左右，且最大氨氮去除率低于60%，但未指出究竟是否有脫氮功能，因此不能判斷是否存在好氧反硝化性能。于愛茸從魚塘中分離到1株高效的有氧反硝化菌Bacillussp.W2，經(jīng)Biolog法細(xì)菌鑒定，初步鑒定為芽孢桿菌。該菌在硝基氮濃度為25mg/L，溶解氧達(dá)到2mg/L時(shí)，除氮率達(dá)到97%;溶解氧達(dá)到45mg/L時(shí)，除氮率為85%以上；同時(shí)在好氧條件下，菌體濃度為1000個(gè)/mL時(shí)，對(duì)自然水體中高達(dá)lmg/L亞硝酸濃度也能發(fā)揮高效的反硝化作用，但未見Bacillussp.W2菌株的異養(yǎng)硝化性能的相關(guān)研究報(bào)道。何霞等從膜生物反應(yīng)器中分離出來的1株異養(yǎng)硝3化細(xì)菌Bacillussp丄Y，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌。在氨氮濃度分別為40、80和120mg/L3種情況下，120h反應(yīng)后，氨氮的去除率分別是100%、85.7%、73.7%。該菌株的硝化作用啟動(dòng)慢，在120h才能達(dá)到較好的脫氮效果。并報(bào)道經(jīng)研究Bacillussp丄Y具有脫氮性能，但未指出總氮去除率。但是在實(shí)際工程中，實(shí)驗(yàn)室篩選的優(yōu)良菌株受運(yùn)輸及保存條件、保存時(shí)間等限制，影響廣泛使用。采用菌株固定化可以解決這一問題，菌株固定化是利用物理、化學(xué)等因素將菌種約束或限制在一定的空間介質(zhì)內(nèi)(上)，而菌種仍保留其催化活性，并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。固定化后的菌種只要通過常溫干燥保存可保存數(shù)月，并且運(yùn)輸方便，可以回收。綜上所述具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用的高效脫氮菌如做成菌劑產(chǎn)品，將對(duì)廢水脫氮市場(chǎng)產(chǎn)生重要意義?，F(xiàn)有菌劑的包埋材料主要為天然多糖類凝膠和有機(jī)合成高分子凝膠兩類。常見的天然高分子凝膠主要有海藻酸鈉、卡拉膠、瓊脂等；常見的有機(jī)高分子凝膠主要有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。兩類凝膠各有優(yōu)缺點(diǎn)，天然高分子凝膠其優(yōu)點(diǎn)是制作過程簡(jiǎn)單，易成球，包埋劑對(duì)微生物活性影響小，其缺點(diǎn)是抗微生物分解能力差，機(jī)械強(qiáng)度較低；有機(jī)合成高分子凝膠的優(yōu)點(diǎn)是，機(jī)械強(qiáng)度高，抗微生物分解能力強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是制作過程復(fù)雜，有些凝膠易粘連，且對(duì)微生物活性影響較大。因此，目前的研究表明，只有兩種或多種包埋劑聯(lián)合使用，才能發(fā)揮其各自的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)彼此的缺點(diǎn)。以發(fā)明人葉正方、李滄海、李三喜的"固定化微生物處理污水工藝"CN1405099A是關(guān)于利用改性泡沫吸附優(yōu)勢(shì)菌株的發(fā)明專利，并且此專利并沒有提到保存時(shí)間，且該發(fā)明只提到了氨氮的去除，并沒有提到總氮的去除。以發(fā)明人羅明芳、劉會(huì)洲等的"利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進(jìn)行油品脫硫的方法"CN1458229A是以海藻酸鈉為包埋劑的發(fā)明專利，以氯化鈣為交聯(lián)劑，將德氏假單胞菌固定化，但此法主要是用于油品脫硫菌的包埋方法。文獻(xiàn)"不同材料包埋固定化厭氧氨氧化混培物"報(bào)道了(朱剛利等，2008)分別采用羧甲基纖維素鈉(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉(SA)以及PVA-SA混合液，對(duì)ANAMMOX混培物進(jìn)行了包埋固定化和基本性能測(cè)試，四種包埋方法氨氮去除率均達(dá)到了90%以上，但均有硝酸鹽積累現(xiàn)象，積累值均達(dá)到25mg/L。文獻(xiàn)"亞硝酸鹽氧化細(xì)菌固定化方法的優(yōu)化研究"(崔華平等，2009)報(bào)道了采用聚乙烯醇和海藻酸鈉混合固定亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，得到最佳包埋條件為聚乙烯醇8%、海藻酸鈉1%、包埋菌液濃度26g/L、固定化小球交聯(lián)時(shí)間16h，lOd內(nèi)將亞硝酸鹽氮從1.210mg/L降至0.041mg/L。文獻(xiàn)"改性載體固定化微生物處理高氨氮廢水的研究"(李彥鋒等，2008)報(bào)道了采用改性聚氨酯泡沫體作為固定化高效微生物載體，在初始氨氮500mg/L條件下，氨氮去除率可達(dá)97.75%，但此文并沒有提到總氮去除率。文獻(xiàn)"聚乙烯醇作為固定化細(xì)胞包埋劑的研究"(李峰等，2000)報(bào)道了以聚乙烯醇為包埋劑對(duì)活性污泥進(jìn)行固定化，以固定化細(xì)胞的COD&去除率為包埋效果的主要指標(biāo)，并對(duì)固定化細(xì)胞的保存進(jìn)行了試驗(yàn)研究。利用合成廢水浸泡(4°C)保存十天后，經(jīng)過十天的活化其COD&仍不到70%。4迄今尚未見有關(guān)采用聚乙烯醇和瓊脂作混合包埋劑的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一株以硝酸鹽或氨氮為氮源進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株；并將其制成菌劑，菌劑的制作和干燥過程簡(jiǎn)單，接種于常規(guī)好氧污泥中，即可實(shí)現(xiàn)含氨氮廢水的直接脫氮作用?？梢越鉀Q傳統(tǒng)廢水處理中脫氮需要利用不同的硝化和反硝化菌群，更不需要反硝化在缺氧環(huán)境、硝化在好氧環(huán)境分段處理的問題；也解決了優(yōu)良菌株工程應(yīng)用不易保存、運(yùn)輸困難，菌劑生產(chǎn)過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本過高等諸多問題。本發(fā)明的發(fā)明思路是采用已篩選的具有天然生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，根據(jù)現(xiàn)有菌株包埋技術(shù)的缺陷，發(fā)明人利用瓊脂和聚乙烯醇的結(jié)合，在制作過程、包埋后微生物活性、以及傳質(zhì)效果等方面改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)在菌劑包埋方面的問題。將包埋菌劑接種于不同濃度的氨氮廢水中，并通過不同反應(yīng)條件試驗(yàn)(溶解氧，碳氮比，pH等)，證實(shí)菌劑在簡(jiǎn)單保存條件下有良好的活性，具有廣泛的應(yīng)用適應(yīng)性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案—株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，于2009年4月30日，保藏于"中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"，其保藏號(hào)為CGMCCNo.3047。上述的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047用于制備生物脫氮用微生物制劑的用途?！N用于處理含氮廢水的微生物制劑，所述微生物制劑包括蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047。上述微生物制劑的制備方法，其具體步驟為(l)配制瓊脂和聚乙烯醇的混合液，瓊脂和聚乙烯醇之間的質(zhì)量比是l:(26);與蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047菌液混合后終濃度為1%4%和2%8%，121°C條件下滅菌20min，待混合液冷卻至室溫；(2)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047菌懸液，菌懸液與混合液為1:50的體積百分比，菌懸液的菌體濃度為40%50%(質(zhì)量百分比)，再將混合液用針管滴入已滅菌飽和硼酸中，形成小球。此過程中，操作溫度需控制在3070°C;(3)將小球放入冰箱中05°C交聯(lián)832小時(shí)，用無菌水洗凈05°C保存待用；(4)把固定化好的小球放入干燥箱中，206(TC干燥540h取出，用自封袋包裝，放入CaC^作為干燥劑，菌劑制備完成。利用上述微生物制劑處理含氮廢水的方法，將菌劑(菌劑質(zhì)量含氮廢水質(zhì)量=1:(2001000))加入含氮廢水中，搖床振蕩培養(yǎng)4天，其條件是轉(zhuǎn)數(shù)為100200r/min、溫度2040。C、pH為79、C/N為1535。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是1、本發(fā)明蠟狀芽孢桿菌兼具異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能，異養(yǎng)硝化要比傳統(tǒng)自養(yǎng)硝化菌的硝化反應(yīng)速度快得多，在本案例中，甚至快于反硝化速度；好氧反硝化菌和傳統(tǒng)缺氧反硝化菌相比，可以和硝化同時(shí)進(jìn)行，在本案例中，單菌株就實(shí)現(xiàn)硝化和反硝化過程。2、本發(fā)明菌株除了具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能外，還具有特殊的生物N20控逸作用，在以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度二3(TC，C/N=25，pH=9.0，轉(zhuǎn)數(shù)=180r/min(DO=5.766.59mg/L)，NH4+-N初始濃度分別為100mg/L條件下，空氣密封培養(yǎng)96h后，NH4+-N和TN去除率分別達(dá)到96.3%和93.81%，產(chǎn)生的N20氣體為0.00945mg，N2為9.5005mg，僅占從水體中脫除的氮的0.047%;3、本發(fā)明制備的微生物制劑能實(shí)現(xiàn)含氮廢水的同步硝化反硝化，可以解決傳統(tǒng)廢水處理中脫氮需要采取缺氧反硝化，好氧硝化分段處理的問題。在溫度=2040°〇，C/N=1535，pH=79，轉(zhuǎn)數(shù)=100200r/min，初始NH4+-N和N03—-N濃度分別達(dá)到100mg/L和30mg/L條件下，NH4+-N和TN去除率分別達(dá)到93.7X禾P88.6%。4、本發(fā)明微生物制劑制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉、生物活性高、易保存、運(yùn)輸方便，容易回收。該微生物制劑在干燥密封的保存條件下可以至少保存三個(gè)月，且活性不受影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，本發(fā)明制備菌劑干燥保存90天的NH4+-N和TN去除率可分別達(dá)到89.1%和84.2%。此微生物制劑不僅適用于各種城市及生活廢水，也適用于高濃度氨氮工業(yè)廢水的治理。5、本發(fā)明的包埋材料選擇和包埋方法，使微生物制劑小球易于保存，在運(yùn)輸和使用過程中不易破碎，并且可以保證微生物的活性不受影響。圖1為干燥保存90天本發(fā)明微生物菌劑的總氮去除率；注以菌劑處理廢水氨氮去除率表示菌劑的活性。圖2為本發(fā)明菌劑圖片。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株的篩選該菌株來自于本實(shí)驗(yàn)室，以硝酸鹽為底物，高溶解氧條件馴化下的SBR曝氣反應(yīng)器A(總無機(jī)氮(TIN)去除率60.083.0%，COD去除率85.090.0%)中的活性污泥，保藏編號(hào)為CGMCCN0.3047。利用BTB培養(yǎng)基中所含的溴百里酚藍(lán)為產(chǎn)堿指示劑，遇堿變藍(lán)的特點(diǎn)，采用梯度稀釋及涂布法將本實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器A中的混合液均勻涂布于BTB培養(yǎng)基，3(TC恒溫好氧培養(yǎng)數(shù)天后，挑取周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色的暈圈并且菌落形態(tài)不相同的單菌落作為初篩的好氧反硝化菌，在平板上劃線進(jìn)行菌株的純化。劃線篩選得到的純菌株在試管中劃斜面保存。接著對(duì)菌株進(jìn)行反硝化性能測(cè)試(以硝基氮還原率和總氮去除率來衡量)，復(fù)篩出純的好氧反硝化菌。將篩選出的好氧反硝化菌株接種于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株的硝化性能(硝化性能以氨氮的去除率來衡量)，選取氨氮去除率60%以上的菌株，至此認(rèn)為篩選出具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能的菌株。實(shí)施例2:蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO.3047好氧反硝化培養(yǎng)方法為了防止模擬廢水中帶入雜菌，硝酸鹽模擬廢水在高溫滅菌鍋O.IMP中滅活20min。取菌劑lg菌劑接種到裝有200mL硝酸鹽模擬廢水的250mL錐形瓶中進(jìn)行反硝化、脫氮性能測(cè)定。每隔24小時(shí)，用裝有0.2ym混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品5mL，測(cè)定N(V-N和NC^-N濃度。通過計(jì)算NC^-N還原率和總氮(廢水中NH4+-N、N03—-N和N02—-N濃度之和)去除率分析菌株的N03—-N還原性能和脫氮性能。硝酸鹽模擬廢水(/L):琥珀酸鈉2.4g，KN03:0.722g，KH2P04:l.Og，MgS047H20:l.Og。實(shí)施例3:蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO.3047的好氧反硝化性能的測(cè)定方法廢水好氧反硝化條件為溶解氧濃度，通過控制不同轉(zhuǎn)速rpm實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速為lOOrpm，對(duì)應(yīng)溶解氧濃度為4.25.6mg/L;硝基氮濃度為63.8mg/L左右；碳氮比10，pH值為6.5。按照實(shí)施例2方法進(jìn)行反硝化性能測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果4天后N(V-N還原率78.0%，4天后TIN去除率為76.8%。實(shí)施例4:蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO.3047異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的測(cè)定方法為了防止模擬廢水中帶入雜菌，氨氮模擬廢水在高溫滅菌鍋O.IMP中滅活20min。將0.2g菌劑接種到裝有200ml氨氮模擬廢水II的250mL錐形瓶中進(jìn)行硝化、脫氮性能測(cè)定。每隔24小時(shí)，用裝有0.2ym混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品5mL，測(cè)定NH厶N(yùn)，N02—-N和N03—-N濃度。通過計(jì)算氨氮去除率和總氮(廢水中氨氮，硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度之和)的去除率分析菌株的硝化性能和脫氮性能。氨氮模擬廢水(/L):(NH4)2S04:0.47g，擰檬酸三鈉(C6H5Na3072H20):5.1g;碳源用量依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)COD/N比調(diào)節(jié)，維氏鹽溶液50ml;加水溶解，補(bǔ)充蒸餾水至1L，并同時(shí)調(diào)節(jié)初始pH值。其中維氏鹽溶液(/L):K2HP04:5.0g;FeS047H20:0.05g;NaCl:2.5g;MgS04'7H20:2.5g;MnS04'4H20:0.05g，溶解后加水定容至1L。實(shí)施例5:蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株CGMCCNO.3047的脫氮處理反應(yīng)條件通過試驗(yàn)優(yōu)選出該菌株的硝化、反硝化優(yōu)選培養(yǎng)條件為以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，NH4+-N初始濃度分別為100mg/L條件下，空氣密封培養(yǎng)，溫度為30°C、COD/N為25、初始pH值為9.0、轉(zhuǎn)速為180r/min(DO=5.766.59mg/L)。此條件下，蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)在16h時(shí)氨氮去除率達(dá)最大，為96.30%。該菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)生在最初24小時(shí)內(nèi)，菌體生長(zhǎng)量在第24小時(shí)達(dá)到最大，OD600值為1.094。TN的去除與NH4+-N的去除有著相同的趨勢(shì)，在第16小時(shí)TN去除率達(dá)93.81%，在整個(gè)硝化過程中僅有極少量的NCV-N、N02—-N的累積，菌株在硝化過程中將NH4+-N氧化為NCV-N、N02—-N，且通過好氧反硝化作用被去除。實(shí)施例6:空氣密封瓶培養(yǎng)條件下，以檸檬酸三鈉為碳源，硫酸銨為唯一氮源，對(duì)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO.3047異養(yǎng)硝化過程中N20的生物控逸技術(shù)為了防止模擬廢水中帶入雜菌，氨氮模擬廢水I和氨氮模擬廢水II均在高溫滅菌鍋O.lMPa中滅活20min。將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)CGMCCNO.3047接入氨氮模擬廢水I，置于氣浴恒溫?fù)u床，恒溫保持3(TC，搖床轉(zhuǎn)速120160r/min進(jìn)行菌株活化?；罨?216小時(shí)后，以5%的接種量接種到裝有200ml氨氮模擬廢水II的1L帶有密封橡膠塞的三角瓶中進(jìn)行硝化能力、脫氮產(chǎn)物&0氣體測(cè)定。在2040°C，，pH=7.09.0，轉(zhuǎn)速為90180r/min，COD/N為1530的條件下，用氣浴恒溫?fù)u床下進(jìn)行培養(yǎng)，分析測(cè)定。同樣條件下，空白廢水樣品(未接菌株的氨氮模擬廢水II)作為對(duì)比基準(zhǔn)試驗(yàn)。每隔24小時(shí)，用10ml鎖式進(jìn)樣器緩慢勻速抽取錐形瓶中逸出的氣體，直接分析檢測(cè)&0。同時(shí)用抽取液體樣品，測(cè)定NHZ-N，N02—-N和NCV-N濃度。通過計(jì)算氨氮去除率、總氮去除率以及&0的氣體產(chǎn)量分析菌株的硝化性能和脫氮性能。N20采用GC-ECD法測(cè)定，Varian3800氣相色譜儀；10mci63Ni電子捕獲檢測(cè)器(ECD);3mX3mm不銹鋼柱，填充固體PorapakQ柱，80/100目。選用的綜合色譜條件檢測(cè)器溫度(TD)(350°C)、分離柱溫度(Tc)(5(TC)、載氣流速(fc)(20mL/min)，在此條件下具有較高的靈敏度和精確度，重現(xiàn)性較好(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差C.V=1.05%，n=23)。如圖2所示，依據(jù)上述測(cè)試條件可以看出，02和&0分離度較大，說明氣體成分清楚，下述結(jié)果測(cè)量精準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在空氣密封培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)CGMCCNO.3047菌株在以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度=30"，COD/N=25，pH=8.0，轉(zhuǎn)速=160r/min，NH4+-N初始濃度為100mg/L，實(shí)驗(yàn)條件下，96h后NH卩-N去除率為90.52%，總氮去除率=91.54%，產(chǎn)生的N20為0.00945mg，占從水體中脫除的氮的0.047%。實(shí)施例7:純氧密封瓶培養(yǎng)條件下，以檸檬酸三鈉為碳源，硫酸銨為唯一氮源，對(duì)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO.3047異養(yǎng)硝化過程中N20的生物控逸技術(shù)與實(shí)施例11不同，本試驗(yàn)中將200ml氨氮模擬廢水II接入1L帶有雙孔密封橡膠塞的三角瓶中進(jìn)行硝化能力、脫氮產(chǎn)物N20氣體測(cè)定。如圖1所示，為實(shí)驗(yàn)中為測(cè)定&0所用特制雙孔培養(yǎng)搖瓶示意圖；其中該培養(yǎng)搖瓶包括雙孔橡膠塞l、氣體取樣口2、閥門3、液體取樣口4、出氣口5(帶有夾子的橡膠管另一端連著玻璃管)和進(jìn)氣口6(帶有夾子的橡膠管另一端連著玻璃管)。培養(yǎng)中，將99.999%的高純氧氣以相同流速注入到培養(yǎng)瓶中，充氧時(shí)間為60秒(注通過前期的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，40秒的充氧時(shí)間能夠保證1L瓶中含95^以上的氧氣)，立刻用夾子夾緊連著玻璃管的橡膠管，然后進(jìn)行搖床培養(yǎng)。每隔24小時(shí)，用10ml鎖式進(jìn)樣器緩慢勻速抽取錐形瓶中逸出的氣體，直接分析檢測(cè)&0。同時(shí)用抽取液體樣品，測(cè)定NH^-N，N02—-N和N(V-N濃度。通過計(jì)算氨氮去除率、總氮去除率以及N20的氣體產(chǎn)量分析菌株的硝化性能和脫氮性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株在以擰檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度二30。C，COD/N=25，pH=8.0，轉(zhuǎn)速二160r/min，NfC-N初始濃度為100mg/L實(shí)驗(yàn)條件下，96h后NfC-N去除率為91.45%，總氮去除率=92.49%，產(chǎn)生的N20為0.00425mg，占從水體中脫除的氮的0.024%。實(shí)施例8:本發(fā)明微生物制劑的制備1)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047的增殖。將營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)在12rC條件下滅菌20min，倒入培養(yǎng)皿中，營(yíng)養(yǎng)瓊脂的量可以根據(jù)菌體需要而定，本實(shí)施例中為10ml/g(營(yíng)養(yǎng)瓊脂體積8/菌體重量)，待瓊脂凝固后，將斜面中的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047劃入平板中，盡量將平板劃滿，劃線完成后，將培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中，3(TC下培養(yǎng)2天。2天后，平板培養(yǎng)基上蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047基本布滿平板，再將平板中的菌轉(zhuǎn)移到已滅菌的增殖培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)數(shù)為100r/min，30°C的條件下培養(yǎng)96h，再將液體增殖后的菌液在4000r/min下離心10min，將離心后的濕菌體用無菌水洗兩遍，放入4t:冰箱中待用。增殖培養(yǎng)基(1L):(NH4)2S04:0.47g;KH2P04:lg;FeCl2.6H20:1.25;CaCl2.7H20:0.2;MgSO丄.7H20:l.Og;擰檬酸三鈉5.1g。2)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047微生物制劑的制備配制瓊脂(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)和聚乙烯醇(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)的混合液，瓊脂和聚乙烯醇之間的質(zhì)量比是l:6;與菌液混合后終濃度為1%和6%，12rC條件下滅菌20min，待混合液冷卻后，將菌液加入混合液中，用玻璃棒攪勻，將混合液放入3(TC的水浴鍋中，再將混合液用針管滴入已滅菌飽和硼酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4t:交聯(lián)8小時(shí)，用無菌水洗凈4t:保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，2(TC干燥40h取出，用自封袋包裝，放入CaCl2作為干燥劑。菌劑制備完成。如圖2所示，本發(fā)明菌劑大小形狀均一，品質(zhì)好。按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行菌劑活性測(cè)定。其氨氮和總氮去除率分別為92.1%和86.7%。實(shí)施例9:本發(fā)明微生物制劑的制備1)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047的增殖。步驟同實(shí)施例8。2)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047微生物制劑的制備配制瓊脂(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)和聚乙烯醇(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)的混合液，瓊脂和聚乙烯醇之間的質(zhì)量比是l:2;與菌液混合后終濃度為4%和8%，12rC條件下滅菌20min，待混合液冷卻后，將菌液加入混合液中，用玻璃棒攪勻，將混合液放入7(TC的水浴鍋中，再將混合液用針管滴入已滅菌飽和硼酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4t:交聯(lián)32小時(shí)，用無菌水洗凈4t:保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，6(TC干燥5h取出，用自封袋包裝，放入CaC^作為干燥劑。菌劑制備完成。按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行菌劑活性測(cè)定。其氨氮和總氮去除率分別為91.4%和85.8%。實(shí)施例10:本發(fā)明微生物制劑的制備1)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047的增殖。將營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)在12rC條件下滅菌20min，倒入培養(yǎng)皿中，營(yíng)養(yǎng)瓊脂的量可以根據(jù)菌體需要而定，10ml/g(營(yíng)養(yǎng)瓊脂體積/菌體重量)，待瓊脂凝固后，將斜面中的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047劃入平板中，盡量將平板劃滿，劃線完成后，將培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中，3(TC下培養(yǎng)2天。2天后，平板培養(yǎng)基上蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047基本布滿平板，再將平板中的菌轉(zhuǎn)移到已滅菌的增殖培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)數(shù)為200r/min，30°C的條件下培養(yǎng)8h，再將液體增殖后的菌液在14000r/min下離心2min，將離心后的濕菌體用無菌水洗兩遍，放入4t:冰箱中待用。92)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047微生物制劑的制備配制瓊脂(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)和聚乙烯醇(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)的混合液，瓊脂和聚乙烯醇之間的質(zhì)量比是l:5;與菌液混合后終濃度為1%和5%，12rC條件下滅菌20min，待混合液冷卻后，將菌液加入混合液中，用玻璃棒攪勻，將混合液放入4(TC的水浴鍋中，再將混合液用針管滴入已滅菌飽和硼酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4t:交聯(lián)16小時(shí)，用無菌水洗凈4t:保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，4(TC干燥15h取出，用自封袋包裝，放入CaC^作為干燥劑。菌劑制備完成。按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行菌劑活性測(cè)定。其氨氮和總氮去除率分別為93.7%和88.6%。實(shí)施例11:本發(fā)明微生物制劑的制備1)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047的增殖。步驟同實(shí)施例82)蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047微生物制劑的制備配制瓊脂(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)和聚乙烯醇(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)的混合液，瓊脂和聚乙烯醇之間的質(zhì)量比是l:3;與菌液混合后終濃度為2%和6%，12rC條件下滅菌20min，待混合液冷卻后，將菌液加入混合液中，用玻璃棒攪勻，將混合液放入5(TC的水浴鍋中，再將混合液用針管滴入已滅菌飽和硼酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4t:交聯(lián)12小時(shí)，用無菌水洗凈4t:保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，3(TC干燥12h取出，用自封袋包裝，放入CaCl2作為干燥劑。菌劑制備完成。按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行菌劑活性測(cè)定。其氨氮和總氮去除率分別為93.1%和87.9%。實(shí)施例12-15:蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047菌劑干燥保存0天、30天、60天、SO天活性測(cè)定(含氨氮廢水培養(yǎng)的總氮去除率測(cè)定)根據(jù)實(shí)施例8的方法制作菌劑，將菌劑置于常溫下保存，分別取保存O天、30天、60天、90天的菌劑，按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行菌劑活性測(cè)定。編號(hào)保存時(shí)間/天氨氮去除率/%TN去除率/%實(shí)施例12093.788.6實(shí)施例133092.185.4實(shí)施例146090.284.7實(shí)施例159089.184.210<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)用于制備生物脫氮用微生物制劑的用途，其特征在于，所述蠟狀芽孢桿菌保藏編號(hào)為CGMCCNo.3047。2.—種用于處理含氮廢水的微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑包括蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047。3.權(quán)利要求2所述微生物制劑的制備方法，其特征在于，具體步驟為(1)配制瓊脂和聚乙烯醇的混合液，瓊脂和聚乙烯醇之間的質(zhì)量比是l:26;與蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047菌液混合后終濃度為質(zhì)量1%4%和2%8%;將混合液12rC條件下滅菌20min，待混合液冷卻至室溫；(2)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047菌懸液加入瓊脂和聚乙烯醇混合液中攪勻，菌懸液與混合液為l:50的體積百分比，菌懸液的菌體濃度為40%50%，再將混合液用針管型槍注入已滅菌飽和硼酸中，形成小球，此過程中，操作溫度需控制在3070°C;(3)將小球在05t:交聯(lián)8-32小時(shí)，用無菌水洗凈05t:保存待用；(4)把固定化好的小球放入干燥箱中，206(TC干燥540h取出，用自封袋包裝，放入CaC^作為干燥劑。4.權(quán)利要求3制備的微生物制劑處理含氮廢水的方法，其特征在于，將菌劑加入含氮廢水中，培養(yǎng)反應(yīng)4天，其條件是轉(zhuǎn)數(shù)為100200r/min;DO=4.26.7mg/L、溫度2040°C、pH為79、C/N為1535;菌劑質(zhì)量含氮廢水質(zhì)量=1:2001000。全文摘要本發(fā)明涉及蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)微生物制劑及其制備方法，所述蠟狀芽孢桿菌保藏編號(hào)為CGMCCNO.3047，其步驟如下利用瓊脂和聚乙烯醇將蠟狀芽孢桿菌CGMCCNo.3047進(jìn)行固定化，并通過20-60℃氣流干燥最終制成生物菌劑。該制備方法中瓊脂和聚乙烯醇的使用量少，生產(chǎn)成本低，制備方法簡(jiǎn)單；該方法制成的生物菌劑微生物活性高、易保存、運(yùn)輸方便，容易回收；利用此菌劑處理含氮廢水，在NH4+-N初始濃度在100mg/L、NO3--N初始濃度在30mg/L的條件下，NH4+-N的去除率達(dá)到93.7％，TN(廢水中NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度之和)的去除率達(dá)到88.6％；該法的另一特點(diǎn)是，該菌株可同時(shí)去除NH4+-N、NO3--N和NO2--N。因此，鑒于以上特點(diǎn)，此方法不僅適用于各種城市及生活廢水，也適用于高濃度氨氮工業(yè)廢水的脫氮治理。文檔編號(hào)C12N11/04GK101691569SQ20091009260公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年9月18日優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日發(fā)明者劉健楠,尹明銳,廖小紅,汪蘋,王磊申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)