專利名稱：一種芽孢乳桿菌及其生產(chǎn)的活菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的一種芽孢乳桿菌S1及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，是利用通過調(diào)整動(dòng)物腸道微生態(tài)的方法來降低仔豬的腹瀉率，提高仔豬的生長速度，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害畜產(chǎn)品的生產(chǎn)。
二、技術(shù)背景自上世紀(jì)50年代，美國食品與藥物管理局(FDA)首次批準(zhǔn)抗生素可用作飼料添加劑后，世界各國先后進(jìn)行抗生素的飼養(yǎng)試驗(yàn)，并用于生產(chǎn)。無容置疑，抗生素用作促生長類飼料添加劑，在預(yù)防動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長方面起到過積極作用。但隨著時(shí)間的推移和科學(xué)的進(jìn)步，人們認(rèn)識(shí)到，在飼養(yǎng)中使用飼用抗生素等抗菌藥物可產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)。主要表現(xiàn)為病原菌等微生物的抗藥性增加，抗菌藥物失去應(yīng)有效果，一些疾病給人和動(dòng)物帶來嚴(yán)重威脅，正常菌群平衡失調(diào)，人、動(dòng)物免疫力降低等。因此，一些發(fā)達(dá)國家在飼養(yǎng)中禁用和限用抗生素等抗菌藥物。在我國，安全問題是限制我國畜產(chǎn)品出口的一個(gè)瓶頸，隨著我國加入WTO，環(huán)保型飼料的生產(chǎn)愈顯重要。因此，尋找抗生素的替代品是國內(nèi)、國際飼料產(chǎn)業(yè)研究的熱點(diǎn)問題。
益生素是一類通過調(diào)控動(dòng)物腸道微生物區(qū)系平衡而有效地促進(jìn)宿主動(dòng)物健康和生長的微生物活菌制劑，因此也常稱微生物活菌制劑。當(dāng)生理和環(huán)境條件變更時(shí)，幼畜腸道中有害病原菌常迅速繁殖，造成腸道性疾病如腹瀉的發(fā)生。益生素的應(yīng)用可通過微生物拮抗、競(jìng)爭(zhēng)排斥以及免疫刺激改善腸道微生物區(qū)系的平衡，從而減少疾病的發(fā)生。作為益生素的微生物通常是來自動(dòng)物自身腸道或來自其它生態(tài)環(huán)境的有益微生物，對(duì)動(dòng)物和人無毒副作用，因此被認(rèn)為是一類具有廣闊開發(fā)和應(yīng)用前景的抗生素替代品，這一方面的研究也成為當(dāng)今國際上畜牧獸醫(yī)學(xué)科的一個(gè)前沿研究領(lǐng)域。
在動(dòng)物營養(yǎng)中用作益生素的微生物主要有乳酸菌(包括芽孢桿菌Bacillus spp.、腸球菌Enterococcus spp.、乳酸桿菌Lactobacillus spp.、雙歧桿菌Bifidobacterium spp.等)、酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae)等。但有關(guān)其應(yīng)用效果的報(bào)道很不一致，原因可能與下述因素有關(guān)(1)菌株來源。目前所用的益生菌大多為體外篩選而得，由于體內(nèi)外環(huán)境差異極大，外源微生物必須經(jīng)過定植、競(jìng)爭(zhēng)和排斥才能在動(dòng)物腸道中生存，因而許多學(xué)者認(rèn)為，理想的益生素菌種最好來自動(dòng)物腸道。(2)益生菌株的作用機(jī)理不清楚，特別是其在動(dòng)物腸道中的活動(dòng)規(guī)律仍不十分清楚。(3)益生素在體內(nèi)的存活條件不清楚。目前生產(chǎn)中所用的不少益生菌株是通過體外微生物平板實(shí)驗(yàn)篩選出來的。但是益生素被飼用后，必須適應(yīng)或耐受腸道中的生理和生活環(huán)境，必須能附著在腸道壁上，必須能夠與其它腸道微生物競(jìng)爭(zhēng)并達(dá)到可控制有害微生物繁殖所需的數(shù)量和存活率。這些是益生素能否發(fā)揮其作用的先決條件。
目前國外已有研究室開展尋找內(nèi)源性乳酸菌作為仔豬益生菌的研究工作，但有關(guān)其作用機(jī)理和將其應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際中的報(bào)道甚少。一些國內(nèi)學(xué)者在此方面也做了很多工作，但多限于菌株的分離、單一菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)等方面的研究，有關(guān)深入探討乳酸菌的作用機(jī)理的研究尚少。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的芽孢乳桿菌益生菌劑，使用本菌劑可較大程度的降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的生長速度，降低仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。同時(shí)生產(chǎn)和使用成本較低。該菌劑可以在仔豬正常飼養(yǎng)過程中使用，符合綠色飼料添加劑要求。
技術(shù)方案本發(fā)明菌株是采用PCR/DGGE技術(shù)，并結(jié)合常規(guī)微生物學(xué)方法，分離仔豬腸道內(nèi)具益生作用的乳酸菌株，并通過活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)合體外培養(yǎng)、發(fā)酵技術(shù)，分析了腸道生理生化因素對(duì)所分離的外源乳酸菌的選擇性影響，最終篩選出可用作仔豬益生素生產(chǎn)的芽孢乳桿菌S1菌株，通過發(fā)酵生產(chǎn)、制成了益生菌劑。
下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容一種芽孢乳桿菌S1，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陽性的的菌株S1(2005年2月5日寄存于中國微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.1315)，經(jīng)鑒定為Sporolactobacillus sp.。主要生物學(xué)特性為G+，菌體細(xì)長桿狀，有分節(jié)，橢圓形芽孢，孔雀綠染色后芽孢明顯，兼性厭氧生長，葡萄糖、乳糖、纖維二糖、菊糖能氧化產(chǎn)酸，但不分解阿拉伯糖、木糖、淀粉。該菌耐低pH值(pH2.5)及高膽鹽濃度(0.1-0.2％)，對(duì)胃蛋白酶不敏感，80℃下2小時(shí)內(nèi)能生長，發(fā)酵菌液具有顯著的抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長效應(yīng)。仔豬生產(chǎn)中使用該菌劑后可較大程度的降低仔豬的腹瀉率，提高生長速度，減少仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
使用上述芽孢乳桿菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面菌種----搖瓶種子液----發(fā)酵罐------冷凍干燥----產(chǎn)品(包裝劑型凍干粉)。
本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施步驟為1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入10升發(fā)酵罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)基配方為蛋白胨1％；牛肉浸膏1％；酵母浸膏0.5％；葡萄糖2％；檸檬酸三銨0.2％；醋酸鈉0.5％；K2HPO40.5％；MgSO4.7H2O 0.05％；MnSO4.4H2O0.02％；吐溫-80 0.1％；番茄汁10％；pH5.5～6.2；培養(yǎng)溫度為37℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。
3)發(fā)酵罐中的菌液在3000×g，4℃下離心10分鐘后，所得菌泥添加無菌脫脂乳液，而后-70℃過夜，在冷凍干燥儀中冷凍干燥20h，制成凍干粉。
有益效果本發(fā)明提供了一種新型的芽孢乳桿菌益生菌劑，使用本菌劑可較大程度的降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的生長速度，降低仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。
使用該發(fā)明生產(chǎn)的芽孢乳桿菌益生菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，使用效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合個(gè)體養(yǎng)殖戶及規(guī)模化豬場(chǎng)大面積推廣使用。本發(fā)明對(duì)于降低仔豬的腹瀉率，保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要的意義。動(dòng)物試驗(yàn)表明，芽孢乳桿菌S1菌劑能使仔豬腹瀉率降低60％以上，可以大大降低豬生產(chǎn)過程中飼用抗生素的添加量，降低養(yǎng)豬成本，提高養(yǎng)豬生產(chǎn)效益。該益生菌劑可以與其他仔豬添加劑的同時(shí)使用，符合綠色飼料添加劑要求。并且該菌來源于仔豬腸道，屬有益微生物，對(duì)動(dòng)物無任何副作用。
四

圖1對(duì)大腸桿菌K99的抑菌效果圖2分子跟蹤S1菌在仔豬腸道中的定植圖3S1菌的生長曲線
五具體實(shí)施例方式
1 菌株的分離和鑒定以無菌方法取仔豬腸道食糜及腸壁，將其溶解于無菌生理鹽水中，用旋渦混合儀將稀釋液混勻后，1000r.min-1下離心，取上清梯度稀釋后接種于固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)數(shù)天。從中挑取數(shù)個(gè)菌落，菌株優(yōu)化結(jié)果表明，S1菌的生長速度極快，在接種后10小時(shí)即可達(dá)到平穩(wěn)期，見圖3；S1菌耐低pH值、高溫、高膽鹽濃度及抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果最好，該菌鑒定為Sporolactobacillus sp.。主要生物學(xué)特性為G+，菌體細(xì)長桿狀，有分節(jié)，橢圓形芽孢，孔雀綠染色后芽孢明顯，兼性厭氧生長。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
2 菌株優(yōu)化實(shí)驗(yàn)2.1pH值對(duì)芽孢乳桿菌S1存活的影響S1在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，取菌液在pH2.5、3.5、4.5生理鹽水中，每隔30min測(cè)定S1菌株的數(shù)量，結(jié)果表明，上述pH值對(duì)S1菌株的存活無太大影響，在pH4.5時(shí)，其活菌數(shù)隨時(shí)間延長不斷上升，菌株呈正常生長態(tài)勢(shì)，在pH3.5時(shí)，在整個(gè)處理期間，活菌數(shù)基本無變化；在pH2.5時(shí)，隨時(shí)間延長，活菌數(shù)有所下降，但在150min時(shí)存活數(shù)仍較高。在pH1.5時(shí)，經(jīng)60min處理后存活數(shù)低于1.00×104，說明S1菌株對(duì)pH1.5耐受性差。由此可見，S1菌可耐受pH2.5以上的條件。
2.2膽鹽對(duì)芽孢乳桿菌S1存活的影響S1菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，接種于含膽鹽的無菌生理鹽水中，每間隔1h測(cè)定一次其中活菌數(shù)量。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，S1菌株的生長受膽鹽的抑制，隨培養(yǎng)時(shí)間的增長，活菌數(shù)下降，且在同一時(shí)間點(diǎn)上，隨膽鹽濃度增加，S1菌株活菌數(shù)下降；但S1菌株對(duì)0.1-0.2％膽鹽耐受性較好。
2.3芽孢乳桿菌S1的熱耐受性S1菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)后期，按10％的接種量接到已預(yù)熱至50℃、80℃、100℃的無菌生理鹽水中，每間隔1min測(cè)定其中的活菌數(shù)量，結(jié)果表明，S1菌株經(jīng)100℃加熱2min處理后存活率為1.94％，5min后存活率小于0.02％，50℃熱處理對(duì)S1菌株的存活無影響。
2.4芽孢乳桿菌S1的抑菌效果采用牛津杯法，研究S1的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效應(yīng)，表1所示，S1菌株發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌K88、K99、O141、1987P和金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著。S1菌株菌液的抑菌物質(zhì)中除乳酸外，同時(shí)存在其他抑菌物質(zhì)，這些抑菌物質(zhì)占總抑菌效應(yīng)的30％左右。S1菌株發(fā)酵液的抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和耐蛋白酶特性，經(jīng)70℃30min、100℃30min、121℃15min加熱處理后殘留抑菌效果(熱處理菌液抑菌圈直徑除以原液抑菌圈直徑)均在92％以上，經(jīng)蛋白酶處理后殘留抑菌效果(蛋白酶處理菌液抑菌圈直徑除以原液抑菌圈直徑)均在85％以上，見表2。
2.5芽孢乳桿菌S1制劑與不同寡糖的復(fù)合效應(yīng)研究芽孢乳桿菌S1菌劑與不同寡糖的組合效應(yīng)。結(jié)果表明，快發(fā)酵型(FOS)和慢發(fā)酵型(菊糖)寡糖復(fù)合后對(duì)芽孢乳桿菌S1的生長速度和產(chǎn)酸能力促進(jìn)作用最強(qiáng)。
3實(shí)際應(yīng)用實(shí)驗(yàn)3.1芽孢乳桿菌S1制劑的動(dòng)物試驗(yàn)選取多窩新生仔豬，分別在7(開食當(dāng)天)、9、11日齡進(jìn)行口服芽孢乳桿菌S1的試驗(yàn)。結(jié)果表明，芽孢乳桿菌S1能提高斷奶后仔豬前后腸乳酸菌與大腸桿菌的數(shù)量比值；提高后腸VFA濃度尤其是丁酸濃度(丁酸濃度的提高對(duì)仔豬的健康有益)；分子跟蹤顯示其在乳仔豬胃腸道中能夠存活并定植。同時(shí)取仔豬胃底、十二指腸、空腸組織，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可顯著提高斷奶后仔豬胃底腺鹽酸細(xì)胞的數(shù)量，并可促進(jìn)斷奶前十二指腸腸絨毛的增高，但對(duì)空腸腸絨毛高度無顯著影響。
3.2芽孢乳桿菌S1制劑的應(yīng)用劑量試驗(yàn)選用30窩新生仔豬，分別于7(開食當(dāng)天)、9、11日齡給三個(gè)處理組口服不同劑量的芽孢乳桿菌S1，結(jié)果表明不同劑量的芽孢乳桿菌S1均能顯著降低乳仔豬的腹瀉率，CFU為109的口服劑量效果最佳。
3.3芽孢乳桿菌S1制劑的中試動(dòng)物試驗(yàn)選取多個(gè)豬場(chǎng)，每豬場(chǎng)30-40窩新生仔豬，于7、9、11日齡口服CFU為109的芽孢乳桿菌S1。結(jié)果表明，在7-21日齡期間，口服芽孢乳桿菌S1組的平均日增重比對(duì)照組提高9.49％，而且其日增重變異系數(shù)明顯好于對(duì)照組(7.47％vs23.15％)，試驗(yàn)組腹瀉率極顯著低于對(duì)照組(3.1％vS19.7％)。
表1 對(duì)大腸桿菌K88、99、O141、987P、E1及金黃色葡萄球菌的抑菌效應(yīng)單位mm

表2 S1菌液中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

權(quán)利要求
1.一種芽孢乳桿菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陽性的Sporolactobacillus sp.的菌株S1，2005年2月5日寄存于中國微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.1315，經(jīng)鑒定為Sporolactobacillus sp.，主要生物學(xué)特性為G+，菌體細(xì)長桿狀，有分節(jié)，橢圓形芽孢，孔雀綠染色后芽孢明顯，兼性厭氧生長，葡萄糖、乳糖、纖維二糖、菊糖能氧化產(chǎn)酸，但不分解阿拉伯糖、木糖、淀粉；該菌發(fā)酵菌液具有顯著的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長的效應(yīng)；該菌耐低pH值及高膽鹽濃度，對(duì)胃蛋白酶不敏感，80℃下2小時(shí)內(nèi)能生長，其菌劑在仔豬飼養(yǎng)中使用后可較大幅度的降低仔豬的腹瀉率，提高生長速度，減少仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。
2.一種用權(quán)利要求1所述的芽孢乳桿菌的菌劑，是通過以下方法生產(chǎn)而成1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入10升發(fā)酵罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)基配方為蛋白胨1％；牛肉浸膏1％；酵母浸膏0.5％；葡萄糖2％；檸檬酸三銨0.2％；醋酸鈉0.5％；K2HPO40.5％；MgSO4.7H2O 0.05％；MnSO4.4H2O 0.02％；吐溫-80 0.1％；番茄汁10％；pH5.5～6.2；培養(yǎng)溫度為37℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上；3)發(fā)酵罐中的菌液在3000×g，4℃下離心10分鐘后，所得菌泥添加無菌脫脂乳液，而后-70℃過夜，在冷凍干燥儀中冷凍干燥20h，制成凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可降低仔豬腹瀉率的芽孢乳桿菌及其生產(chǎn)的活菌制劑，所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌S1，經(jīng)鑒定為Sporolactobacillus sp.。主要生物學(xué)特性為G
文檔編號(hào)C12N1/20GK1687400SQ20051003889
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者朱偉云, 姚文, 毛勝勇 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)