專利名稱：一種篩選誘變生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選誘變生物的方法。
背景技術(shù)：
紫外線和NTG誘變育種等傳統(tǒng)菌種選育手段(classical strain improvement, csi)基本上不過(guò)多關(guān)注宿主內(nèi)的生化反應(yīng)和遺傳信息，主要是基于欲改良的表型直接進(jìn)行 篩選。不同于csi手段，代謝工程的重點(diǎn)在于針對(duì)特定的生化反應(yīng)進(jìn)行分析和改造，以實(shí)現(xiàn) 對(duì)宿主的表型進(jìn)行定向的優(yōu)化。隨著轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和代謝組分析等系統(tǒng)生物技術(shù)的普 及應(yīng)用，代謝工程手段越來(lái)越得到人們認(rèn)可和采用。CSI手段實(shí)現(xiàn)的是全基因組范圍內(nèi)的多 位點(diǎn)突變，往往對(duì)宿主表型產(chǎn)生深刻的影響，雖然耗時(shí)耗力，但實(shí)際應(yīng)用的效果要好于代謝 工程改造。相比而言，代謝工程存在兩大突出的缺點(diǎn)，一，限于目前人們的認(rèn)知水平，純理性 的分析往往有很大的局限性，因而改造結(jié)果事與愿違的情況時(shí)有發(fā)生；二，目前的組學(xué)分析 手段往往能一次提供多個(gè)候選的改造靶點(diǎn)，但是現(xiàn)有的重組DNA技術(shù)很難在同一個(gè)宿主中 高效的同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶點(diǎn)的改造，一般只能順序引入。Manor Askenazi等報(bào)道了一種名為 報(bào)告基因誘變篩選(R印orter-guided mutant selection, RGMS)的方法將代謝工程分析手 段和CSI誘變能力有效結(jié)合起來(lái)的方法，成功的實(shí)現(xiàn)了絲狀真菌Aspergillus terreus中 洛伐他定產(chǎn)量的提高。在該研究中，研究小組采用轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析技術(shù)，找到跟洛伐他 定產(chǎn)量高度正相關(guān)的關(guān)鍵基因lovF，然后，采用腐草霉素抗性基因ble作為報(bào)告基因，構(gòu)建 啟動(dòng)子探針質(zhì)粒lovF-ble，對(duì)含有該質(zhì)粒的洛伐他定產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，通過(guò)腐草霉素抗性 篩選得到一些IovF高表達(dá)的突變株，并從中篩選得到洛伐他定高產(chǎn)菌，這種方法篩選效率 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的誘變篩選效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種篩選誘變生物的方法。本發(fā)明所提供的篩選誘變生物的方法，包括如下步驟1)在誘變前，將表達(dá)盒導(dǎo)入含有與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的待誘變生物內(nèi)，得到 含有所述表達(dá)盒的重組待誘變生物；所述表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、 報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng) 子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。上述過(guò)程中，所述表達(dá)盒中的報(bào)告基因和啟動(dòng)子可以按如下方式連接從表達(dá)盒 的上游至下游依次為所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2 (即 兩個(gè)報(bào) 告基因受一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控)；所述表達(dá)盒中的報(bào)告基因和啟動(dòng)子還可以以下方式進(jìn) 行連接報(bào)告基因1和報(bào)告基因2分別受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子獨(dú)立調(diào) 控；上述過(guò)程中，所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子，不僅可以包括核心啟動(dòng)子區(qū)，還可以包括核心啟動(dòng)子周圍的順式作用元件，增強(qiáng)子等調(diào)控序列。上述過(guò)程中，所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因具體可為所述目的產(chǎn)物在生物內(nèi)的合 成途徑中的、能提高所述目的產(chǎn)物合成量的關(guān)鍵性基因。上述過(guò)程中，所述報(bào)告基因1和報(bào)告基因2為兩個(gè)不同的報(bào)告基因。上述過(guò)程中，連入表達(dá)盒中的所述報(bào)告基因具體可為報(bào)告基因的開(kāi)放讀碼框或帶 有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)放讀碼框。正如現(xiàn)有技術(shù)中所述，報(bào)告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì) 或酶的基因，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。本發(fā)明方法中，正是利用了這一 點(diǎn)，使報(bào)告基因在所述相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo) 定所述相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而標(biāo)定出目的產(chǎn)物的合成情況，進(jìn)而挑選出目的誘變生物(如 目的產(chǎn)物產(chǎn)量高的生物)。本發(fā)明方法中，所述報(bào)告基因在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面與現(xiàn) 有技術(shù)中所述相同，具體有以下幾個(gè)條件(1)已被克隆和全序列已測(cè)定；(2)表達(dá)產(chǎn)物在 受體生物中不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的生物中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物；(3)其表達(dá)產(chǎn) 物能進(jìn)行定量和定性測(cè)定。除上述條件外，在本發(fā)明方法中還最好使報(bào)告基因滿足如下條 件(1)至少其中一個(gè)報(bào)告基因?yàn)榭剐曰颍?2)保證報(bào)告基因的活性水平與上述關(guān)鍵基因 的啟動(dòng)子活性水平有一定程度的正相關(guān)。上述過(guò)程中，所述篩選方法可用于一般誘變中的篩選，如紫外誘變、NTG誘變等。 也可以用于新興誘變手段中的篩選，如基因組改組(Zhang, Y. X.，Perry, K.，Vinci, V. Α.， Powell, K. , Stemmer, W. P. , del Cardayre, S. B. , 2002. Genome shufflingleads to rapid phenotypic improvement in bacteria. Nature. 415，644—646.)。上述過(guò)程中，所述待誘變生物可為原核微生物、真核微生物(如絲狀真菌)、植物 細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞；具體可為原核微生物；再具體可為原核微生物中的放線菌；再具體可為 原核微生物中的鏈霉菌；進(jìn)一步具體可為玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomycesroseosporus)。上述過(guò)程中，當(dāng)所述目的產(chǎn)物為達(dá)托霉素，用鏈霉菌作為待誘變生物，進(jìn)行誘變產(chǎn) 生達(dá)托霉素時(shí)，所述與達(dá)托霉素在鏈霉菌內(nèi)的代謝合成相關(guān)的基因的啟動(dòng)子具體可選dptE 基因的啟動(dòng)子；所述報(bào)告基因可選自xylE基因和neo基因。所述neo基因的核苷酸序列如 序列表中序列1所示，所述xylE基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述dptE基因 的啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。達(dá)托霉素是玫瑰孢鏈霉菌產(chǎn)生的非核糖體多肽(Non-ribosomal peptides,NRPS) 類抗生素。達(dá)托霉素能在多個(gè)方面破壞細(xì)菌細(xì)胞膜功能，是目前唯一能抑制G+細(xì)菌細(xì)胞膜 上特有成分脂磷壁酸合成的抗生素。在達(dá)托霉素合成基因簇中，dptE到dptj的結(jié)構(gòu)基因
(Miao, V. ，Coeffet-Legal, Μ. F. ，Brian, P. ，Brost, R. ，Penn, J.， Whiting, Α. , Martin, S. , Ford, R. , Parr, I. , Bouchard, Μ. , Silva, C. J. , Wrigley, S. K., Baltz, R.H.,2005. Daptomycin biosynthesis in Streptomyces roseosporus :cloning and analysis of the gene cluster and revision of peptide stereochemistry. Microbiology. 151，1507-1523.)，因此十分關(guān)鍵(圖1)。dptE與上游的基因間隔400bp，含 有獨(dú)立的啟動(dòng)子。因此，選擇dptE作為關(guān)鍵基因，利用dptE基因的啟動(dòng)子PdptE構(gòu)建報(bào)告 質(zhì)粒，進(jìn)行篩選。在鏈霉菌中，含有卡那抗性基因ne0(fr0m Tn5)的宿主菌對(duì)卡那霉素的抗性水平與啟動(dòng)子活性水平有一定程度的正相關(guān)(Ward，J. Μ.，Jmssen，G. R.，Kieser，Τ.， Bibb, Μ. J.，Buttner, Μ. J.，1986. Construction and characterisation of a series ofmulti-copy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the amin oglycosidephosphotransferase gene from Tn5 as indicator. Mol Gen Genet.203， 468-478·)。
艮告基因 xylE，來(lái)自于 Psedomonas TOL plasmid (Kieser, Τ. , Bibb, Μ. J., Buttner, Μ. J.，Chater, K. F.，Hopwood，D. Α.，2000. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation, Norwich, England.) ；xylE 的蛋白產(chǎn)物是 Catechol 2， 3-dioxygenase,它會(huì)邑將無(wú)色的鄰苯二 )氧化成黃色的 2-hydroxymuconic semialdehyde， 形成XylE基因-鄰苯二酚2，3-雙加氧酶顯色標(biāo)志系統(tǒng)。該報(bào)告基因檢測(cè)廉價(jià)而準(zhǔn)確，顯色 水平和啟動(dòng)子活性具有很好的線性相關(guān)性(Clayton，T. Μ.，Bibb，M. J.，1990. Streptomyces promoter-probeplasmids that utilise the xylE gene of Pseudomonas putida· Nucleic Acids Res. 18，1077.)。同時(shí)，既可以通過(guò)往平板 上的菌落噴灑底物氣霧做定性分析，也可 以通過(guò)檢測(cè)無(wú)細(xì)胞提取液中的鄰苯二酚雙加氧酶活性來(lái)定量分析液體培養(yǎng)下的啟動(dòng)子活 性。所以在鏈霉菌的實(shí)驗(yàn)中，采用上述兩個(gè)報(bào)告基因。在實(shí)際應(yīng)用中，本發(fā)明方法可以有以下幾種具體情況，當(dāng)然還有其它的應(yīng)用情況， 可以根據(jù)不同的實(shí)際需要進(jìn)行靈活選擇運(yùn)用1、只進(jìn)行一輪篩選。步驟如下只進(jìn)行一次誘變。1)在誘變前，將表達(dá)盒導(dǎo)入含有與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的待誘變生物內(nèi)，得到 含有所述表達(dá)盒的重組待誘變生物；所述表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、 報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng) 子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。2、進(jìn)行兩輪篩選。步驟如下進(jìn)行兩次誘變第一輪篩選(第一次誘變中的篩選)1)在第一次誘變前，將表達(dá)盒導(dǎo)入含有與目 的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達(dá)盒的重組待誘變生物；所述表達(dá) 盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基 因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控；2)在第一次誘變后，根據(jù)所述報(bào)告 基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。第二輪篩選(第二次誘變中的篩選)1)在進(jìn)行第二次誘變前，將不同于第一輪 篩選的表達(dá)盒導(dǎo)入第一輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第二輪篩選所用的重組待誘變 生物；所述不同于第一輪篩選的表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因 1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào) 控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因與第一輪篩選中所述的基因不同，報(bào)告基因1和報(bào) 告基因2與第一輪篩選中所述的報(bào)告基因可相同也可不同；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基 因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。在進(jìn)行第二輪篩選前，最好先將第一輪篩選得到的目的誘變生物中的、被導(dǎo)入的 表達(dá)盒丟失。丟失可用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)手段進(jìn)行(如在沒(méi)有抗性的平板上培養(yǎng)等)。
3、進(jìn)行多輪篩選。步驟如下進(jìn)行三次以上誘變(包括三次)第一輪篩選(第一次誘變中的篩選)1)在第一次誘變前，將表達(dá)盒導(dǎo)入含有與目 的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達(dá)盒的重組待誘變生物；所述表達(dá) 盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基 因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控；2)在第一次誘變后，根據(jù)所述報(bào)告 基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。第二輪篩選(第二次誘變中的篩選)1)在進(jìn)行第二次誘變前，將不同于第一輪 篩選的表達(dá)盒導(dǎo)入第一輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第二輪篩選所用的重組待誘變 生物；所述不同于第一輪篩選的表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因 1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào) 控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因與第一輪篩選中所用的基因不同，報(bào)告基因1和報(bào) 告基因2與第一輪篩選中所用的報(bào)告基因可相同也可不同；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基 因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。第三輪篩選(第三次誘變中的篩選)1)在進(jìn)行第三次誘變前，將不同于第一輪和 第二輪篩選的表達(dá)盒導(dǎo)入第二輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第三輪篩選所用的重組 待誘變生物；所述不同于第一輪和第二輪篩選的表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟 動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因 的啟動(dòng)子的調(diào)控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因與第一輪和第二輪篩選中所述的基 因不同，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2與第一輪和第二輪篩選中所用的報(bào)告基因可相同也可不 同；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。第η輪篩選(第η次誘變中的篩選)1)在進(jìn)行第η次誘變前，將不同于第1輪至 第η-1輪篩選的表達(dá)盒導(dǎo)入第η-1輪篩選得到的目的誘變生物中，得到第η輪篩選所用的 重組待誘變生物；所述不同于第1輪至第η-1輪篩選的表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基 因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相 關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控；其中，所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因與第1輪至第η-1輪篩選中所 用的基因不同，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2與第1輪至第η-1輪篩選中所用的報(bào)告基因可相 同也可不同；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。在進(jìn)行每輪篩選前，最好先將前一輪篩選得到的目的誘變生物中的、被導(dǎo)入的表 達(dá)盒丟失。丟失可用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)手段進(jìn)行(如在沒(méi)有抗性的平板上培養(yǎng)等)。在以上多輪篩選中，每輪篩選所用的與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因都不同，以實(shí)現(xiàn)對(duì)多 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行疊加篩選的功能。具體可以通過(guò)采用游離型報(bào)告質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)該功能由于大 多數(shù)游離質(zhì)粒在無(wú)抗性壓力的條件下比較容易從宿主中丟失，因此，可以在操作完一個(gè)關(guān)鍵 基因后，得到一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)表型優(yōu)化了的突變株，然后通過(guò)簡(jiǎn)單的質(zhì)粒丟失，再轉(zhuǎn)入另一個(gè) 關(guān)鍵基因的報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行下一輪誘變篩選。如果結(jié)合轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和代謝組分析技術(shù)，對(duì) 每輪篩選得到的突變株進(jìn)行分析，理性的選擇下一輪操作的靶基因，將更加有效。本發(fā)明方法中，在保留抗性基因作為報(bào)告基因的前提下，引入了第二個(gè)報(bào)告基因， 與第一個(gè)抗性基因串聯(lián)起來(lái)，共同監(jiān)測(cè)同一個(gè)靶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，故將本發(fā)明方法 稱為雙報(bào)告基因誘變篩選方法(Double-r印orter-guided mutant selection, dRGMS)。
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dRGMS不僅適用于誘變微生物中篩選次生代謝產(chǎn)物(如抗生素)產(chǎn)量高的突變微生物，也適用于誘變其它生物中篩選其它小分子代謝產(chǎn)物(如初級(jí)代謝的檸檬酸，甚至大 分子蛋白質(zhì)，如抗體，糖蛋白等)產(chǎn)量提高的突變生物。事實(shí)上，只要在這些代謝物合成的途徑，能找到關(guān)鍵的過(guò)表達(dá)靶點(diǎn)，并且對(duì)應(yīng)的 宿主能做基本的遺傳操作，dRGMS就可用。比如在生產(chǎn)一些細(xì)胞因子類蛋白的研究開(kāi)發(fā) 中，人們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)蛋白折疊相關(guān)的關(guān)鍵基因，結(jié)果使宿主獲得增強(qiáng)的分泌 能力，提高了 蛋白因子的產(chǎn)量(Borth, N. ，Mattanovich, D. ， Kunert, R. ，Katinger, H.， 2005. Effect of increased expression of protein disulfide isomerase andheavy chain binding protein on antibody secretion in a recombinant CHO cell line. Biotechnol. Prog. 21,106-111.)。在另一個(gè)例子中，過(guò)表達(dá)細(xì)胞周期調(diào)控的負(fù)調(diào)節(jié)因 子，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，延長(zhǎng)了細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白合成的周期，最終導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量提高 (Fussenegger,Μ. ,Schlatter,S. ,Datwyler,D. ,Mazur,Χ. ,Bailey,J. Ε. ,1998. Controlled proliferation by multigene metabolic engineering enhances the productivity ofChinese hamster ovary cells. Nat. Biotechnol. 16，468-472.)。只需要對(duì) dRGMS 做有 限的修改，比如使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體，以及換成適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雙報(bào)告基因， 就可以用dRGMS作為替代手段來(lái)過(guò)表達(dá)以上提及的關(guān)鍵基因，達(dá)到更好的效果。本發(fā)明的篩選誘變生物的方法在生物誘變中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?，F(xiàn)有技術(shù)中的報(bào)告基因誘變篩選(R印orter-guided mutant selection, RGMS) 存在假陽(yáng)性較高的問(wèn)題。因?yàn)樗拗鲗?duì)某種抗生素產(chǎn)生抗性，往往同時(shí)存在多種機(jī)理 (Appelbaum, P. C. ,2002.Resistance among Streptococcus pneumoniae !Implications fordrug selection. Clin Infect Dis. 34，1613-1620)，所以當(dāng)用抗生素的某個(gè)抗性基因作 為報(bào)告基因的時(shí)候，可能存在假陽(yáng)性的問(wèn)題，即宿主獲得高的抗性并不是因?yàn)閳?bào)告基因的 高表達(dá)引起的。報(bào)告基因的假陽(yáng)性會(huì)直接導(dǎo)致通過(guò)報(bào)告基因法挑選得到的突變株庫(kù)中產(chǎn)量 提高的陽(yáng)性菌株的比例下降。本發(fā)明方法利用雙報(bào)告基因進(jìn)行篩選，克服了上述假陽(yáng)性高的問(wèn)題，大大降低了 篩選過(guò)程中假陽(yáng)性突變的比率，大大提高了篩選效率。以原核微生物中的玫瑰孢鏈霉菌 NRRL 11379 (Streptomyces roseosporus NRRL 11379)誘變篩選為例，在該實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明 方法的篩選陽(yáng)性率可達(dá)90%，而單報(bào)告基因篩選方法的篩選陽(yáng)性率僅50%。本發(fā)明成功的將NTG誘變和報(bào)告基因篩選方法在鏈霉菌中得以應(yīng)用，這說(shuō)明該方 法應(yīng)該具有普遍適用性。進(jìn)一步，本發(fā)明通過(guò)采用雙報(bào)告基因方法，即dRGMS，使篩選的效率 得到了驚人的提高，并且通過(guò)跟傳統(tǒng)重組DNA技術(shù)的比較，首次比較系統(tǒng)的研究了報(bào)告基 因誘變篩選技術(shù)的特點(diǎn)，即在實(shí)現(xiàn)靶基因間接過(guò)表達(dá)的同時(shí)，引入未知因素，來(lái)擴(kuò)展篩選的 空間。隨著人們對(duì)生物學(xué)系統(tǒng)復(fù)雜性的逐漸認(rèn)識(shí)，特定生物系統(tǒng)的詳細(xì)全景將逐漸清晰和 充實(shí)，但在這漫長(zhǎng)的過(guò)程中，如何在已有的理性認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，充分利用更為廣闊的未知空 間，進(jìn)行定向的設(shè)計(jì)和篩選，具有十分重要的實(shí)用價(jià)值，報(bào)告基因誘變篩選即是這樣一種技 術(shù)。因此，本發(fā)明方法在誘變篩選中將有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)及其合成基因簇。
圖2為sRGMS中使用的單報(bào)告質(zhì)粒pSRdptE和dRGMS中使用的雙報(bào)告質(zhì)粒 pDRdptE。圖3為單/雙報(bào)告基因篩選所得的突變株的相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力。圖4為在卡那霉素抗性平板上長(zhǎng)出的突變株，鄰苯二酚顯色結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、以玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379為出發(fā)菌株 進(jìn)行誘變篩選玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種 保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)。質(zhì)粒 pT3 (Kashiwagi, Α. , Sakurai, Τ. , Tsuru, S. , Ying, B. W. , Mori, K. and Yomo, Τ. ,2009.Construction of Escherichia coli gene expression level perturbation collection. Metab. Eng. 11，56-63) (Yomo，T 惠贈(zèng))；MΙ pSET152(Kieser, Τ. ， Bibb, Μ. J. ， Buttner, Μ. J. ， Chater, K. F. ， Hopwood, D. Α. ,2000.Practical Streptomyces genetics.John Innes Foundation, Norwich, England.)，Chater, K. F.惠贈(zèng)；質(zhì) pIJ4083 (Clayton, Τ. Μ. , Bibb, Μ. J. ,1990. Streptomyces promoter-probeplasmids that utilise the xylE gene of Pseudomonas putida. Nucleic Acids Res. 18，1077.)，Bibb, M. J.惠贈(zèng)；質(zhì) 粒 pSE34(Schmitt-John, Τ. , Engels, J. W. ,1992. Promoter constructions forefficient secretion expression in Streptomyces lividans. Appl Microbiol Biotechnol. 36，493-498.)，Engels, J. W.惠贈(zèng)；M Ε. coli ET1257/pUZ8002(Kieser, Τ. ， Bibb, Μ. J. ， Buttner, Μ. J. ， Chater, K. F. , Hopwood, D. Α. ,2000. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation, Norwich, England.), Bibb, M. J 惠贈(zèng)。質(zhì)粒提取、酶切、連接等常規(guī)操作見(jiàn)《分子克隆》第三版(Sambrook et al.，1989)。 玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)的遺傳操作見(jiàn)《鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)》(Kieser et al.，2000)。KOD-plus DNA polymerase (TOYOBO)用于做 PCR 反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增的片段亞 克隆到pGMET-easy (Promega,在連接之前添加3 ‘ -A),或特定的載體中。一、含雙報(bào)告基因重組菌的構(gòu)建(一)相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建pSR質(zhì)粒的構(gòu)建用引物Sens-neo和Anti-neo從質(zhì)粒pT3中擴(kuò)增出883bp的無(wú)啟 動(dòng)子的neo片段，測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增得到的neo片段序列正確，序列(5’ 一3’ )如下所示(序 列表中序列1)TT(MlTCTAAGTAGCTGACAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCatgattgaacaagatggattgca cgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatg ccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcac tgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccg agaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaa gcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagca tcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgaccc atggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggt gtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccg cttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttct gaGAATTCACTGG。其中小寫(xiě)字母為基因neo編碼框，neo片段的兩端連接有酶EcoRI的識(shí)別序列，另 外，5’端還含有三重終止密碼子序列“TAAGTAGCTGA”和核糖體結(jié)合位點(diǎn)“AGGATGA”)；將擴(kuò) 增得到的neo片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切，然后插入pSET152的EcoRI酶切位點(diǎn)， 得到基本報(bào)告載體PSR，酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及插入的序列正確，pSR中卡那 霉素抗性基因neo和安普霉素抗性基因aac (3) IV在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄方向。pSRdptE 質(zhì)粒構(gòu)建(圖 2)以玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) NRRLl 1379的基因組DNA為模板，用引物Sens-PdptE和Anti-PdptE進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩 端連接有酶NotI的識(shí)別序列的含dptE啟動(dòng)子的片段(用PdptE表示)，測(cè)序驗(yàn)證，序列正 確，PdptE的序列(5’ 一 3’)如序列表中序列2所示。用限制性內(nèi)切酶NotI分別酶切擴(kuò)增得到的片段及pSR質(zhì)粒，連接，得到報(bào)告質(zhì)粒 pSRdptE，酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及插入的序列正確，pSRdptE中含dptE啟動(dòng)子 的片段位于neo的前面。pDR質(zhì)粒的構(gòu)建以pIJ4083為模板，用引物Sens-xylE和Anti-xylE進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到963bp無(wú)啟動(dòng)子的xylE，測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增得到的片段序列正確，序列(5，— 3’)如 下所示(序列表中序列3)TATTGCGGCCGCTGAGTTGAAGAGGTGACGTCatgaacaaaggtgtaatgcgaccgggccatgtgcagc tgcgtgtactggacatgagcaaggccctggaacactacgtcgagttgctgggcctgatcgagatggaccgtgacgac cagggccgtgtctatctgaaggcttggaccgaagtggataagttttccctggtgctacgcgaggctgacgagccggg catggattttatgggtttcaaggttgtggatgaggatgctctccggcaactggagcgggatctgatggcatatggct gtgccgttgagcagctacccgcaggtgaactgaacagttgtggccggcgcgtgcgcttccaggccccctccgggcat cacttcgagttgtatgcagacaaggaatatactggaaagtggggtttgaatgacgtcaatcccgaggcatggccgcg cgatctgaaaggtatggcggctgtgcgtttcgaccacgccctcatgtatggcgacgaattgccggcgacctatgacc tgttcaccaaggtgctcggtttctatctggccgaacaggtgctggacgaaaatggcacgcgcgtcgcccagtttctc agtctgtcgaccaaggcccacgacgtggccttcattcaccatccggaaaaaggccgcctccatcatgtgtccttcca cctcgaaacctgggaagacttgcttcgcgccgccgacctgatctccatgaccgacacatctatcgatatcggcccaa cccgccacggcctcactcacggcaagaccatctacttcttcgacccgtccggtaaccgcaacgaagtgttctgcggg ggagattacaactacccggaccacaaaccggtgacctggaccaccgaccagctgggcaaggcgatcttttaccacga ccgcattctcaacgaacgattcatgaccgtgctgacctga其中小寫(xiě)字母為xylE編碼框，其5’端連接有酶NotI的識(shí)別序列，另外，5’端還含 有三重終止密碼子序列“TGAGTTGAAGAGGTGA”和核糖體結(jié)合位點(diǎn)“GAGGTGA”)；將擴(kuò)增得到的xylE片段用限制性內(nèi)切酶NotI進(jìn)行酶切，然后插入pSR(用NotI和EcoRV酶切)，得到基本的雙報(bào)告質(zhì)粒PDR，酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及插入的序列正確；pDR中，xylE 位于neo的前面，構(gòu)成xylE-neo雙報(bào)告結(jié)構(gòu)。pDRdptE質(zhì)粒的構(gòu)建(圖2)用限制性內(nèi)切酶NotI分別酶切上述擴(kuò)增得到的 PdptE片段及pDR質(zhì)粒，連接，得到報(bào)告質(zhì)粒pDRdptE，酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及 插入的序列正確；pDRdptE質(zhì)粒中xylE和neo在PdptE的控制下共轉(zhuǎn)錄。pEdptE質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pSE34為模板，用引物Sens_ermE和Anti_ermE進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到啟動(dòng)子PermE*的123pb片段，測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增得到的片段序列正確，序列為T(mén)CGACTCTAGAgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtgg caccgcgatgctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtaGCGGCCGCAAGCTT其兩端連接有酶XbaI和NotI的識(shí)別序列。用限制性內(nèi)切酶XbaI和NotI酶切PCR 擴(kuò)增的啟動(dòng)子PermE*片段和pSR，連接，得到質(zhì)粒pSRE ；酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 及插入的序列正確。以玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL11379的基因組 DNA為模板，用引物Sens-dptE-BamHI和Anti-dptE_EcoRV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含完整dptE 編碼框的片段(1844bp)，測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增得到的片段序列正確，序列如下所示(序列表中序 列4)TATAGGATCCCGACCGGAGTCAGGAGGGGGAGTGCCTGCCgtgagtgagagccgctgtgccgggcaggg cctggtgggggcactgcggacctgggcacggacacgtgcccgggagactgccgtggttctcgtacgggacaccggaa ccaccgacgacacggcgtcggtggactacggacagctggacgagtgggccagaagcatcgcggtgaccctccgacag caactcgcgccggggggacgggcacttctgctgctgccgtccggcccggagttcacggccgcgtacctcggctgcct gtacgcgggtctggccgccgtaccggcgccgctgcccggggggcgccacttcgaacgccgccgtgtcgcggccatcg ccgccgacagcggagccggcgtggtgctgaccgtcgcgggtgagaccgcctccgtccacgactggctgaccgagacc acggccccggctactcgcgtcgtggccgtggacgaccgggcggcgctcggcgacccggcgcagtgggacgacccggg cgtcgcgcccgacgacgtggctctcatccagtacacctcgggctcgaccggcaaccccaagggcgtggtcgtgaccc acgccaacctgctggcgaacgcgcggaatctcgccgaggcctgcgagctgaccgccgccactcccatgggcggctgg ctgcccatgtaccacgacatggggctcctgggcacgctgacaccggccctgtacctcggcaccacgtgcgtgctgat gagetccacggcattcatcaaacggccgcacctgtggctacggaccatcgaccggttcggcctggtctggtcgtegg ctcccgacttcgcgtacgacatgtgtctgaagcgcgtcaccgacgagcagatcgccgggctggacctgtcccgctgg cggtgggccggcaacggcgcggagcccatccgggcagccaccgtacgggccttcggcgaacggttcgcccggtacgg cctgcgccccgaggcgctcaccgccggctacgggctggccgaggccaccctgttcgtgtcgaggtcgcaggggctgc acacggcacgagtcgccaccgccgccctcgaacgccacgaattccgcctcgccgtacccggcgaggcagcccgggag atcgtcagctgcggtcccgtcggccacttccgcgcccgcatcgtcgaacccggcgggcaccgtgttctgccgcccgg ccaggtcggcgagctggtcctccagggagccgccgtctgcgccggctactggcaggccaaggaggagaccgagcaga ccttcggcctcaccctcgacggcgaggacggtcactggctgcgcaccggcgatctcgccgccctgcacgaagggaat ctccacatcaccggccgctgcaaagaggccctggtgatacgaggacgcaatctgtacccgcaggacatcgagcacga actccgcctgcaacacccggaacttgagagcgtcggcgccgcgttcaccgtcccggcggcacctggcacgccgggct tgatggtggtccacgaagtccgcaccccggtccccgccgacgaccacccggccctggtcagcgccctgcgggggacg atcaaccgcgaattcggactcgacgcccagggcatcgccctggtgagccgcggcaccgtactgcgtaccaccagcgg caaggtccgccggggcgccatgcgtgacctctgcctccgcggggagctgaacatcgtccacgcggacaagggctggcacgccatcgccggcacggccggagaggacatcgcccccactgaccacgctccacatccgcaccccgcgtaaGATATC TATA。其中小寫(xiě)字母為dptE編碼框，序列兩端連接有酶BamHI和EcoRV的識(shí)別序列，序 列的5’端，編碼框之前約18bp處為核糖體結(jié)合位點(diǎn)“ggagg”。用限制性內(nèi)切酶BamHI和 EcoRV酶切dptE編碼框片段和pSRE，連接，得到pEdptE ；酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 及插入的序列正確；PEdptE中dptE受強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*轉(zhuǎn)錄控制。(采用鏈霉菌中常用的 強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*來(lái)過(guò)表達(dá)dptE)。( 二)重組菌的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將步驟(一)中得到的各質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入玫瑰孢鏈 霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379 中。轉(zhuǎn)入方法具體如文獻(xiàn)(Kieser， Τ. ， Bibb, Μ. J. ， Buttner, Μ. J. ， Chater, K. F. ， Hopwood, D. Α. ，2000. Practical Streptomycesgenetics. John Innes Foundation, Norwich, England.)中所述。重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pSR 將質(zhì)粒pSR轉(zhuǎn)入玫瑰孢 鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379 得至Ij ；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDR 將質(zhì)粒pDR轉(zhuǎn)入玫瑰孢 鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379 得至Ij ；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pSRdptE(含單報(bào)告基因) 將質(zhì)粒 PSRdptE 轉(zhuǎn)入玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) NRRL 11379 得到；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE (含雙報(bào)告基因) 將質(zhì)粒 PDRdptE 轉(zhuǎn)入玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) NRRL 11379 得到；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pEdptE 將質(zhì)粒 pEdptE 轉(zhuǎn)入 玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379 得到。二、誘變、篩選達(dá)托霉素產(chǎn)量高的菌株麥芽粉購(gòu)自O(shè)xoid，產(chǎn)品目錄號(hào)為L(zhǎng)P0029 ；糊精購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，產(chǎn)品目錄 號(hào)為69009992 ；MOPS購(gòu)自Amresco，產(chǎn)品目錄號(hào)為0670。豆粉為自制，制備方法為先將豆 子壓榨出油，再對(duì)豆餅進(jìn)行炒制，最后進(jìn)行磨粉，其加工細(xì)度為40目。YD培養(yǎng)基，其組成為每升培養(yǎng)基中含有酵母粉4g，麥芽粉10g，葡萄糖4g，NaCl 2g，CaCl2L 5g，瓊脂糖20g，其余為蒸餾水，pH 7. 5。培養(yǎng)重組菌的培養(yǎng)基向YD培養(yǎng)基中添加安普霉素(其在培養(yǎng)基中的濃度為 25mg/l)和/或卡那霉素(目的不同，濃度有所變化)。豆粉培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有豆粉20g，糊精10g，甘油5. Og，KH2PO4O. 6g JPMOPS 8. Og，其余為水；pH 7. 1。發(fā)酵方法為將菌株接種在YD平板上，28°C培養(yǎng)7天，然后接種5cm2的菌苔到裝 有IOOml豆粉培養(yǎng)基的500ml搖瓶中；搖床上28°C，250rpm培養(yǎng)72h。(一)重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pSRdptE(含單報(bào)告基 因)的誘變、篩選1、啟動(dòng)子PdptE轉(zhuǎn)錄水平與卡那霉素抗性水平的相關(guān)性重組菌卡那霉素抗性水平檢測(cè)方法制備含有不同濃度卡那霉素的豆粉培養(yǎng)基平 板；每個(gè)平板涂布大約IO5玫瑰孢鏈霉菌孢子，28°c培養(yǎng)3天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。觀察得到剛好不長(zhǎng)菌落的平板，以及卡那霉素濃度稍低于前者的菌落生長(zhǎng)很差的平板。這兩個(gè)平板對(duì)應(yīng)的卡那霉素濃度的平均值，定義為重組菌的卡那霉素抗性上限。在不同濃度的卡那霉素篩選平板上分別培養(yǎng)重組菌玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomycesroseosporus) /pSRdptEλ 攻瑰抱鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) / pSR(對(duì)照)，方法同“重組菌卡那霉素抗性水平檢測(cè)方法”。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) / pSR卡那霉素抗性上限為10 μ g/ml，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomycesroseosporus)/ PSRdptE的卡那霉素抗性上限為70 μ g/ml。這說(shuō)明重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pSRdptE 的抗性水平明顯高于玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)/ pSR，說(shuō)明含有啟動(dòng)子PdptE的報(bào)告質(zhì)粒的抗性水平明顯高于不含啟動(dòng)子PdptE的空?qǐng)?bào)告載 體，說(shuō)明卡那霉素抗性水平與啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平具有較好的正相關(guān)，因此，卡那霉素抗性水平 可以反映啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。而且，該實(shí)驗(yàn)也表明，達(dá)托霉素合成次級(jí)代謝途徑的關(guān)鍵基因 dptE轉(zhuǎn)錄水平較低，具有較大的提升空間。2、重組菌的誘變和篩選(1)誘變篩選取2 XIO8CFU的重組菌玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomycesroseosporus)/pSRdptE 孢子，用 NTG(lmg/ml)誘變處理 30min。然后將處 理后的孢子涂布在一個(gè)190-mm的含有豆粉培養(yǎng)基(2%瓊脂)的平板上，平板培養(yǎng)基含有 50mg/l的安普霉素和150mg/l的卡那霉素，涂布好的平板在28°C培養(yǎng)5天，長(zhǎng)出抗性突變 株。隨機(jī)從平板上挑選單菌落，即得到單報(bào)告基因抗性菌落。(2)發(fā)酵檢測(cè)每株菌產(chǎn)目的產(chǎn)物的能力將上述得到的單報(bào)告基因抗性菌落接種 在含有200mg/l卡那霉素的YD平板上；培養(yǎng)好的突變株分別進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)其產(chǎn)達(dá)托霉素 能力，篩選高產(chǎn)菌株。(3)計(jì)算單報(bào)告基因篩選的陽(yáng)性率采用t檢驗(yàn)(P = 0. 05, η = 3，雙邊檢驗(yàn))比較 突變株和出發(fā)菌株(重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pSRdptE)的產(chǎn)達(dá) 托霉素能力差異。每個(gè)菌株做3個(gè)平行發(fā)酵，取平均值。統(tǒng)計(jì)單報(bào)告基因抗性篩選出的菌株 中陽(yáng)性突變株的比例。以不經(jīng)誘變的重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/ pSRdptE為對(duì)照菌株。陽(yáng)性突變株的比例=(達(dá)托霉素產(chǎn)量顯著高于對(duì)照菌株的突變株的數(shù)目，P = 0. 05)/單報(bào)告基因抗性篩選得到的所有突變菌株數(shù)目。計(jì)算各突變株相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力。相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力=各突變株菌產(chǎn)達(dá) 托霉素的能力的平均值/對(duì)照菌株產(chǎn)達(dá)托霉素的能力的平均值。結(jié)果，通過(guò)單報(bào)告基因抗性篩選共挑選得到41株能在平板上生長(zhǎng)的菌株。41株 菌的相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力如圖3A所示(圖3A中，SS表示出發(fā)菌株，其余表示41株突 變株)。結(jié)果抗性篩選得到的41株菌中陽(yáng)性突變株的比例為51%。ManorAskenazi ^ (Askenazi et al. ,2003)報(bào)道的單報(bào)告基因篩選結(jié)果，陽(yáng)性率大致也在40% 50%之間， 這與本實(shí)驗(yàn)得到的篩選陽(yáng)性率比較相近。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，陽(yáng)性突變株的比例均為50%左右，與Manor Askenazi等 (Askenazi et al. ,2003)報(bào)道的單報(bào)告基因篩選結(jié)果均相近。(二)重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE(含雙報(bào)告基因)的誘變、篩選
盡管實(shí)驗(yàn)(一)中篩選陽(yáng)性率較高，但是仍有一個(gè)問(wèn)題前人的研究結(jié)果顯示， dptE過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致達(dá)托霉素產(chǎn)量提高，但是以抗性基因作為報(bào)告基因篩選得到的突變株 中，仍然有約一半的突變株產(chǎn)量沒(méi)有提高。哪些原因?qū)е逻_(dá)托霉素產(chǎn)量沒(méi)有提高呢？導(dǎo)致 這種現(xiàn)象的主要原因可能是，一些突變株的卡那霉素抗性提高并不是報(bào)告基因neo的過(guò)表 達(dá)引起，而是其他原因?qū)е?，從而產(chǎn)生了抗性提高和報(bào)告基因過(guò)表達(dá)關(guān)聯(lián)的解離。有兩個(gè)機(jī) 制可能導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生第一，如果全基因組存在卡那霉素外排泵，突變導(dǎo)致了這類外 排泵的過(guò)表達(dá)；第二，由于卡那霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的靶點(diǎn)是核糖體蛋白，因此相關(guān)核糖體蛋 白，或其修飾酶的突變，同樣可以導(dǎo)致對(duì)卡那霉素的耐受。將卡那霉素抗性提高、但是dptE 基因并沒(méi)有明顯過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象定義為抗性假陽(yáng)性。為了驗(yàn)證以上抗性假陽(yáng)性分析，同時(shí)也為了提高報(bào)告基因篩選陽(yáng)性率，本實(shí)驗(yàn)進(jìn) 行了雙報(bào)告基因的改進(jìn)方法。在靶基因啟動(dòng)子和neo (帶rbs序列)之間插入xylE基因， 這樣，串聯(lián)的兩個(gè)報(bào)告基因均受同一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。對(duì)含有靶基因雙報(bào)告質(zhì)粒的出發(fā)菌株 進(jìn)行誘變后，先用卡那霉素抗性平板讓高抗性突變株長(zhǎng)出，然后通過(guò)對(duì)平板上菌落噴灑無(wú) 色的鄰苯二酚(xylE基因的底物)進(jìn)行顯色，挑選黃色明顯加深的突變株進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵和 達(dá)托霉素產(chǎn)量檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下1、重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE (含雙報(bào)告基因) 的卡那霉素抗性水平和xylE顯色水平評(píng)價(jià)卡那霉素抗性水平檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)(一)中所述一致。xylE顯色水平評(píng)價(jià)方法每個(gè)豆粉培養(yǎng)基平板涂布大約IO5玫瑰孢鏈霉菌孢子， 28°C培養(yǎng)3天，然后噴灑0. 5M鄰苯二酚(水溶液)氣霧，每個(gè)平板噴5次(約0. 5ml)，37°C 溫育20min，裸眼觀察菌落顯黃色的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/ PDRdptE的卡那霉素抗性上限為90μ g/ml。同單報(bào)告基因重組菌抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不同， 重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE顯示的啟動(dòng)子PdptE轉(zhuǎn)錄水 平略有提高，這是插在neo之前的xylE基因?qū)?dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA起到了一定的穩(wěn)定作用。 對(duì)照菌株玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDR的XylE顯色結(jié)果肉眼不可見(jiàn)， 重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE的XylE顯色結(jié)果用肉眼也看 不見(jiàn)。結(jié)果同樣說(shuō)明dptE在該培養(yǎng)條件下表達(dá)水平較低，具有較大的提升空間。2、重組菌誘變和篩選(1)誘變和篩選取2 X IO8CFU 的重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus) /pDRdptE (含 雙報(bào)告基因)孢子，用NTG(lmg/ml)誘變處理30min。然后將處理后的孢子涂布在一個(gè) 190-mm的含有豆粉培養(yǎng)基(2%瓊脂)的平板上，平板培養(yǎng)基含有50mg/l的安普霉素和 200mg/l的卡那霉素，涂布好的平板在28°C培養(yǎng)5天，長(zhǎng)出抗性突變株。先噴灑XylE的顯 色底物鄰苯二酚，30°C保溫20min，然后挑選肉眼可見(jiàn)的明顯黃色的突變株，即得到雙報(bào)告 基因表達(dá)提高的菌株。(2)發(fā)酵檢測(cè)每株菌產(chǎn)目的產(chǎn)物的能力將上述得到的雙報(bào)告基因抗性菌株接種在含有200mg/l卡那霉素的YD平板上；培養(yǎng)好的突變株分別進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)其產(chǎn)達(dá)托霉素 能力，篩選高產(chǎn)菌株 (3)計(jì)算雙報(bào)告基因篩選的陽(yáng)性率采用t檢驗(yàn)(P = 0. 05, η = 3，雙邊檢驗(yàn))比較 突變株和出發(fā)菌株(重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE)的產(chǎn)達(dá) 托霉素能力差異。每個(gè)菌株做3個(gè)平行發(fā)酵，取平均值。統(tǒng)計(jì)雙報(bào)告基因抗性篩選出的菌株 中陽(yáng)性突變株的比例。以不經(jīng)誘變的重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/ PDRdptE為對(duì)照菌株。陽(yáng)性突變株的比例=(達(dá)托霉素產(chǎn)量顯著高于對(duì)照菌株的突變株的數(shù)目，P = 0. 05) /雙報(bào)告基因抗性篩選得到的所有突變菌株數(shù)目。計(jì)算各突變株相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力。相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力=各突變株菌產(chǎn)達(dá) 托霉素的能力的平均值/對(duì)照菌株產(chǎn)達(dá)托霉素的能力的平均值。鄰苯二酚顯色的結(jié)果見(jiàn)圖4(圖中A指示的突變株顯示較深的黃色，B指示的突變 株用肉眼觀察不到黃色)。從圖中可以看出，并不是所有在高卡那霉素抗性平板上長(zhǎng)出的突 變株都顯示了明顯的黃色，相反，只有大約一半的突變株顯示了肉眼明顯可見(jiàn)的黃色，這些 突變株是dptE基因?qū)崿F(xiàn)了過(guò)表達(dá)的突變株，圖中突變株A即是典型的dptE過(guò)表達(dá)株，而突 變株B是典型的假陽(yáng)性突變株(高卡那霉素抗性低XylE活性)。共挑選得到50株能在平板上生長(zhǎng)的菌株。50株菌的相對(duì)產(chǎn)達(dá)托霉素的能力如圖 3B所示(圖3B中，SS表示對(duì)照菌株玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pDRdptE, A表示重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pEdptE其余表示50株突變株)。 結(jié)果抗性篩選得到的50株突變株中僅5株產(chǎn)量與出發(fā)菌株持平，其他產(chǎn)量均不同程度的提 高，篩選陽(yáng)性率高達(dá)90% .這說(shuō)明，通過(guò)第二個(gè)報(bào)告基因篩選的引入，有效的排除了單一抗 性報(bào)告基因篩選的假陽(yáng)性，從而極其高效的挑選到dptE過(guò)表達(dá)、達(dá)托霉素產(chǎn)量提高的突變 株。這種篩選效率是傳統(tǒng)的誘變方法根本無(wú)法達(dá)到的。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，均得到相同的陽(yáng)性突變株的比例。(三)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)達(dá)托霉素檢測(cè)儀器為Waters Alliance 2690 HPLC system,色譜柱為 Waters Symmetrycolumn (4. 6*50mm，顆粒大小3. 5 μ m)。流動(dòng)相為乙腈和水(均加入0. 01%三氟乙 酸)。流速1.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)285nm。發(fā)酵液上清用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾后直接上樣，上樣 量為20μ 1。梯度洗脫步驟如下在0 2. 5min內(nèi)，乙腈10% (體積百分含量)；2. 5 8. 5min 內(nèi)，乙腈濃度從10%線性增加到100% ；8. 5-10min,乙腈濃度從100%線性回復(fù)到10%。在上述條件下，達(dá)托霉素相關(guān)三個(gè)組分的保留時(shí)間分別為A21978Q5. 57min、 A21978C25. 71min、A21978C35. 85min。每個(gè)菌株發(fā)酵液三個(gè)組分的總含量作為達(dá)托霉素的 產(chǎn)量。由于出發(fā)菌株和所有突變株的菌體生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯差異，菌體密度趨于統(tǒng)一，所以 菌株產(chǎn)達(dá)托霉素的能力統(tǒng)一用“g/Ι發(fā)酵液”表示，不再考慮菌體量變化。為了便于比較， 用每個(gè)突變株產(chǎn)達(dá)托霉素的能力值除以出發(fā)菌株的產(chǎn)達(dá)托霉素的能力值，得到產(chǎn)達(dá)托霉素 的能力的相對(duì)值。在sRGMS實(shí)驗(yàn)中，重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/ pSRdptE是出發(fā)菌株；在dRGMS實(shí)驗(yàn)中的出發(fā)菌株是重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)/pDRdptE。菌種發(fā)酵產(chǎn)生的達(dá)托霉素類化合物主要三個(gè)組分是A21978(V3，生產(chǎn)中，通過(guò)水解這三種化合物的側(cè)鏈然后連上達(dá)托霉素特異的側(cè)鏈來(lái)合成達(dá)托霉素 (Miao et al. ,2005. Daptomycin biosynthesis in Streptomyces roseosporus :cloning and analysis of the genecluster and revision of peptide stereochemistry. Microbiology. 151，1507-1523.)。(四)玫瑰孢鏈霉菌(St r印tomyces roseosporus) NRRL 11379與重組菌玫瑰孢鏈 霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)/pDRdptE的產(chǎn)達(dá)托霉素能力比較按照上述方法將玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379與重組 菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus)/pDRdptE分別發(fā)酵，然后檢測(cè)其產(chǎn)達(dá)托霉素 能力。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)NRRL 11379 的 產(chǎn)達(dá)托霉素能力為103mg/l發(fā)酵液；重組菌玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomycesroseosporus)/ PDRdptE的產(chǎn)達(dá)托霉素能力為98mg/l發(fā)酵液；二者沒(méi)有明顯差別，表明向野生菌株中導(dǎo)入 雙報(bào)告質(zhì)粒pDRdptE對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)量沒(méi)有明顯的影響。上述實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒及菌種如表1所示。上述實(shí)施例中所使用的PCR引物 序列及測(cè)序引物序列如表2所示。表1.所用的菌種和質(zhì)粒
權(quán)利要求
一種篩選誘變生物的方法，包括如下步驟1)在誘變前，將表達(dá)盒導(dǎo)入含有與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達(dá)盒的重組待誘變生物；所述表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基因1和報(bào)告基因2挑選目的誘變生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述表達(dá)盒從上游至下游依次為所述與 目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物為微生物、植物細(xì)胞或動(dòng)物 細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述微生物為原核微生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述原核微生物為鏈霉菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述鏈霉菌為玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomyces roseosporus)0
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述報(bào)告基因1的核苷酸序列 如序列表中序列1所示，所述報(bào)告基因2的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述與目的 產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
8.權(quán)利要求1-7中任一所述方法在生物誘變中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選誘變生物的方法。該篩選方法包括如下步驟1)在誘變前，將表達(dá)盒導(dǎo)入含有與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的待誘變生物內(nèi)，得到含有所述表達(dá)盒的重組待誘變生物；所述表達(dá)盒包括與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因1和報(bào)告基因2，報(bào)告基因1和報(bào)告基因2受所述與目的產(chǎn)物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子的調(diào)控；2)在誘變后，根據(jù)所述報(bào)告基因挑選目的誘變生物。本發(fā)明方法利用雙報(bào)告基因進(jìn)行篩選，克服了假陽(yáng)性高的問(wèn)題，大大降低了篩選過(guò)程中假陽(yáng)性突變的比率，大大提高了篩選效率。以原核微生物中的玫瑰孢鏈霉菌NRRL11379(Streptomyces roseosporus NRRL 11379)誘變篩選為例，在該實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明方法的篩選陽(yáng)性率可達(dá)90％，而單報(bào)告基因篩選方法的篩選陽(yáng)性率僅50％。
文檔編號(hào)C12N15/64GK101942476SQ200910088678
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者周博 申請(qǐng)人:周博