專利名稱：：阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種阿維菌素批發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：阿維菌素是一種低毒、高效、高選擇、綠色、環(huán)保型、生物源的殺蟲劑，它完全解決了傳統(tǒng)農(nóng)藥存在高毒、抗性和對環(huán)境產(chǎn)生影響的問題。作為目前世界上最為有效的殺蟲劑之一的阿維菌素，其生產(chǎn)水平的提高關(guān)鍵在于阿維菌素發(fā)酵工藝的優(yōu)化。目前阿維菌素發(fā)酵工藝大多采取批發(fā)酵方法，以稱之為阿佛曼鏈霉菌的放線菌為生產(chǎn)菌種，在好氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)中的培養(yǎng)基采用玉米淀粉為主要碳源，配合豆餅粉、花生粉和酵母提取物作為氮源，并添加少量無機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵所得阿維菌素為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，經(jīng)過過濾、浸提、濃縮、精制來獲得最終高純度產(chǎn)品。例如一種常規(guī)的阿維菌素批發(fā)酵工藝為按照淀粉14%、氮源4%、無機(jī)鹽及微量元素1%配料，用水補(bǔ)足(初始裝量為65~70%)后用蒸汽消毒滅菌，滅菌后降溫至28士0.5'C，然后在無菌情況下接入8~10%的種液，按照通風(fēng)比l:0.7，溫度28i0.5'C，自然PH,進(jìn)行發(fā)酵操作控制，發(fā)酵周期260小時(shí)左右，在殘?zhí)堑陀?%且效價(jià)日增長低于300ug/ml后放罐，發(fā)酵全程不進(jìn)行任何補(bǔ)料及帶放操作。目前普遍釆用的阿維菌素批發(fā)酵工藝的配料濃度較高，能夠達(dá)到14%以上。隨著培養(yǎng)基濃度的成倍增加產(chǎn)量雖然也有所遞增，但隨之而來的還有培養(yǎng)基利用不徹底、單位干物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)率下降、發(fā)酵設(shè)備利用率降低及發(fā)酵污水COD濃度增高、處理難度加大等一系列問題。目前雖然已有阿維菌素發(fā)酵補(bǔ)料工藝的研究，在阿維菌素發(fā)酵中后期通過流加或批補(bǔ)葡萄糖液來增加產(chǎn)量，但是效果并不明顯，僅能增加部分放罐體積，而培養(yǎng)基利用不徹底、單位干物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)率下降、發(fā)酵設(shè)備利用率降低等問題仍未得到徹底解決。所以有必要通過優(yōu)化阿維菌素批發(fā)酵的,補(bǔ)料工藝，提高阿維菌素發(fā)酵總億、提高發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，主要通過補(bǔ)料工藝的優(yōu)化，提高阿維菌素發(fā)酵總億、提高發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率。本發(fā)明提供的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝在傳統(tǒng)的利用阿佛曼鏈霉菌批發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素的工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，其中，發(fā)酵初期發(fā)酵液中碳源比例為8~11%，發(fā)酵進(jìn)行到2030小時(shí)，開始流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液，使發(fā)酵液中碳源比例保持在8~11%;發(fā)酵50-60小時(shí)后，停止流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液，補(bǔ)加無菌水，補(bǔ)加的無菌水的體積為補(bǔ)加前發(fā)酵液總體積的2~10%;發(fā)酵175-185小時(shí)后，帶放15%~20%發(fā)酵液，剩余發(fā)酵液中流加營養(yǎng)液，使發(fā)酵液中碳源比例保持在14%，完成發(fā)酵周期。所述含有葡萄糖和淀粉的混合溶液可以為含有8~12重量％的葡萄糖和22~30重量％的淀粉的混合溶液。例如為葡萄糖和淀粉重量比為1:3，總含量為35重量％的葡萄糖和淀粉混合液。所述營養(yǎng)液可以含有65~75重量份水、18~22重量份葡萄糖、510重量份淀粉、2~3重量份乙酸鈉、0.20.8重量份氨基酸、0.10.5重量份淀粉酶。例如為含有70重量份水、20重量份葡萄糖、7重量份淀粉、2.5重量份乙酸鈉、0.5重量份氨基酸(賴氨酸和L-異亮氨酸)和少量的淀粉酶。所述氨基酸可以為賴氨酸和L-異亮氨酸。較佳地，流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液時(shí)，使發(fā)酵液的pH值保持在5.8^6.2?？梢酝ㄟ^控制流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液的流量和/或利用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH值。較佳地，所述帶放部分發(fā)酵液為帶放10~20%發(fā)酵液。本發(fā)明的重點(diǎn)在于補(bǔ)料工藝的優(yōu)化，除了以上描述的操作步驟和操作條件外，其它條件可以參照常規(guī)的阿維菌素批發(fā)酵工藝進(jìn)行。本發(fā)明提供的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，主要通過補(bǔ)料工藝的優(yōu)化，提高了阿維菌素發(fā)酵總億、提高了發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率?？裳娱L發(fā)酵周期(發(fā)酵周期可由傳統(tǒng)的260小時(shí)延長至290小時(shí)左右)、增大放罐體積(放罐總體積可達(dá)發(fā)酵罐全容積的80%左右，而傳統(tǒng)工藝僅為70%)、提高發(fā)酵罐的利用率、降低發(fā)酵液殘?zhí)菨舛?、將單罐總億提高20%左右。具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。本發(fā)明使用的生產(chǎn)菌種為從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)的阿弗曼鏈霉菌菌種，菌種搖床效價(jià)為5500ug/ml以上；初始發(fā)酵液的配方為淀粉10%，氮源4%、無機(jī)鹽及微量元素1%配料，用水補(bǔ)足，初始裝量為70m3。發(fā)酵設(shè)備為100mS不銹鋼發(fā)酵罐。傳統(tǒng)批發(fā)酵工藝中碳源(總糖)比例為14%左右，而本發(fā)明將初始培養(yǎng)基中碳源濃度降低到10%左右，降低碳源濃度不但不會對菌體產(chǎn)生不良影響，而且由于解除了葡萄糖抑制會促使菌體更快的生長；之后在發(fā)酵進(jìn)行到2030小時(shí)，菌體生長進(jìn)入比生長速率衰減期時(shí)，通過流加葡萄糖和淀粉混合溶液(35%，其中葡萄糖和淀粉比例為1:3)的方法，來增強(qiáng)菌體比生長速率，最終達(dá)到增加發(fā)酵液菌體濃度的目的。通過此方法，菌體濃度可由40%左右升至50%以上，為以后的增產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)。表l為一些主要時(shí)點(diǎn)的參數(shù)(總糖和菌濃)對照表?？偺堑臏y定方法為先將發(fā)酵液經(jīng)酸催化水解生成單糖后，再采用常規(guī)的菲林試劑標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定法測定總糖含量。菌濃測定方法為離心機(jī)(型號LD5-2A)于35004000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，根據(jù)上清液量計(jì)算出發(fā)酵液中菌絲的百分含量。表l發(fā)酵周期(h)本發(fā)明補(bǔ)料工藝傳統(tǒng)批發(fā)酵工藝總糖(%)菌濃(%)流加碳源體積/發(fā)酵液總體積(％)總糖(％)菌濃(％)09.8013.289.414012.712168.420012.118248.2321.411.526328.5404.010.732409.2456.510.436489.9499.310.140569.05210.09.842通過發(fā)酵初期降低碳源比例，使發(fā)酵液變的稀薄，移種之后表層機(jī)械泡沫較少易于控制，由上表1可知，降低碳源后前期生長過程中，菌體生長加速，菌濃增加和碳源消耗都明顯快于對比。在2(T30小時(shí)開始大量流加補(bǔ)充碳源后，由于葡萄糖和淀粉的補(bǔ)充，特別是葡萄糖以流加形式的補(bǔ)充，使菌體初級代謝更為快速和持久，增強(qiáng)了菌體比生長速率，最終達(dá)到了增加發(fā)酵液菌體濃度的目的。但在補(bǔ)料過程中要特別注意發(fā)酵液的PH情況，如發(fā)現(xiàn)pH有快速走低趨勢則應(yīng)適當(dāng)減小補(bǔ)糖量或用碳酸鈣將PH調(diào)至6.57.2。在發(fā)酵中前期(5(T60小時(shí))，菌體初級代謝開始轉(zhuǎn)向次級代謝時(shí)，補(bǔ)入適量無菌水，促使菌體代謝快速轉(zhuǎn)到次級代謝；具體操作和.各參數(shù)見下表2。表2發(fā)酵周期(h)本發(fā)明補(bǔ)料工藝傳統(tǒng)批發(fā)酵工藝總糖(o/o)菌濃(%)流加補(bǔ)水體積/發(fā)酵液總體積(％)總糖(％)菌濃(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>發(fā)酵5060小時(shí)流加補(bǔ)入無菌水后，發(fā)酵液菌濃有明顯降低，而發(fā)酵起步效價(jià)(72小時(shí)左右)方面則本發(fā)明補(bǔ)料工藝明顯要高于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，平均高近20%左右，效果較為明顯。效價(jià)測定采用GB19336-2003高效液相色譜法測定。發(fā)酵后期(180小時(shí)左右)效價(jià)積累減緩后，根據(jù)各項(xiàng)代謝參數(shù)適當(dāng)帶放部分(15%~20%)發(fā)酵液，剩余發(fā)酵液根據(jù)菌體碳源及前提物質(zhì)消耗速率來控制流加補(bǔ)料，以維持菌體次級代謝活力，維持效價(jià)積累速率。具體操作和各參數(shù)見下表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>發(fā)酵進(jìn)行180小時(shí)以后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的減少、代謝產(chǎn)物的大量累計(jì)和菌體代謝活力的衰退，菌體出現(xiàn)了衰老甚至死亡的現(xiàn)象，而隨著菌絲自溶的增多，發(fā)酵液泡沫加大，菌體比生產(chǎn)速率也大幅降低。這時(shí)通過帶放15%發(fā)酵液，可緩解發(fā)酵泡沫大及頂罐問題。對于剩余發(fā)酵液，則根據(jù)其培養(yǎng)基碳源及前提物質(zhì)消耗速率，來控制流加補(bǔ)料速率，通常采用測定單位時(shí)間內(nèi)總糖消耗速率乘以一定的系數(shù)來計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)的補(bǔ)料量。本案例中補(bǔ)充的30%營養(yǎng)液配方為20%葡萄糖、7%淀粉、2.5%乙酸鈉、0.5%氨基酸(賴氨酸和L-異亮氨酸)、少量的淀粉酶及70%水。通過補(bǔ)料來維持菌體次級代謝活力，維持效價(jià)積累速率。但在補(bǔ)料過程中要密切關(guān)注PH和菌絲鏡檢形態(tài)，如出現(xiàn)pH急劇下降和"返青"現(xiàn)象，則要適當(dāng)?shù)恼{(diào)減補(bǔ)糖速率。"返青"為菌絲重新二次生長，菌體代謝由次級代謝轉(zhuǎn)為初級代謝的一種現(xiàn)象，出現(xiàn)該現(xiàn)象將嚴(yán)重影響發(fā)酵產(chǎn)物的積累，必須嚴(yán)加控制。本實(shí)施例通過補(bǔ)料工藝優(yōu)化阿維菌素發(fā)酵過程后1、延長了發(fā)酵周期，提高了發(fā)酵罐的利用率；2、增大了放罐體積，放罐總體積達(dá)到發(fā)酵罐全容積的80%(傳統(tǒng)工藝放罐體積為70%左右)；3、提高了培養(yǎng)基的利用率，將傳統(tǒng)工藝中發(fā)酵液殘?zhí)菨舛冉档土?.1%，降低了廢水處理難度；4、成功將單罐總億提高了22%，達(dá)到了增產(chǎn)增效的目的。權(quán)利要求1、阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，利用阿佛曼鏈霉菌批發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素，其特征在于發(fā)酵初期發(fā)酵液中碳源比例為8～11％，發(fā)酵進(jìn)行到20～30小時(shí)，開始流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液，使發(fā)酵液中碳源比例保持在8～11％；發(fā)酵50～60小時(shí)后，停止流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液，補(bǔ)加無菌水，補(bǔ)加的無菌水的體積為補(bǔ)加前發(fā)酵液總體積的2～10％；發(fā)酵175～185小時(shí)后，帶放部分發(fā)酵液，剩余發(fā)酵液中流加營養(yǎng)液，使發(fā)酵液中碳源比例保持在1～4％，完成發(fā)酵周期。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，所述含有葡萄糖和淀粉的混合溶液含有812重量％的葡萄糖和22~30重量％的淀粉。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，所述營養(yǎng)液含有65~75重量份水、1822重量份葡萄糖、510重量份淀粉、23重量份乙酸鈉、0.20.8重量份氨基酸、0.1~0.5重量份淀粉酶。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，所述氨基酸為賴氮酸和L-異亮氨酸。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液時(shí)，使發(fā)酵液的pH值保持在6.5~7.26、根據(jù)權(quán)利要求l所述的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，通過控制流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液的流量和/或利用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH值。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，所述帶放部分發(fā)酵液為帶放10~20%發(fā)酵液。全文摘要本發(fā)明提供了一種阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，是在傳統(tǒng)的利用阿佛曼鏈霉菌批發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素的工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，其中，發(fā)酵初期發(fā)酵液中碳源比例為8～11％，發(fā)酵進(jìn)行到20～30小時(shí)，開始流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液，使發(fā)酵液中碳源比例保持在8～11％；發(fā)酵50～60小時(shí)后，停止流加含有葡萄糖和淀粉的混合溶液，補(bǔ)加無菌水，補(bǔ)加的無菌水的體積為補(bǔ)加前發(fā)酵液總體積的2～10％；發(fā)酵175～185小時(shí)后，帶放15％～20％發(fā)酵液，剩余發(fā)酵液中流加營養(yǎng)液，使發(fā)酵液中碳源比例保持在1～4％，完成發(fā)酵周期。本發(fā)明提供的阿維菌素批發(fā)酵優(yōu)化工藝，主要通過補(bǔ)料工藝的優(yōu)化，提高了阿維菌素發(fā)酵總億、提高了發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率。文檔編號C12P17/18GK101586133SQ200910087739公開日2009年11月25日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者張福志申請人:張福志