專利名稱：：人工合成用于轉基因抗蟲植物的Bt殺蟲基因的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物防治
技術領域：
，具體涉及用于植物表達的Crj^Mc-#基因。技術背景.-價基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌(5a"'77z^^wr&^eywA)，該菌為革蘭氏陽性土壤桿菌，屬于芽孢桿菌屬，其菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈。它在芽孢形成過程中產(chǎn)生稱為5-內毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白(控制合成這種蛋白質的基因在質粒上)，這些蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種昆蟲具有特異性的殺蟲活性。1981年Schenpf和Whiteley從蘇云金芽孢桿菌(5acJ'77wst力ur眾g7'e/7W's)中克隆了第一個編碼S-內毒素的cr/基因1985年Adang，M.J等從蘇云金芽孢桿菌t/yr//wiey^is)中克隆了Cz了Z4c基因，但由于該基因序列特征使得其在過去的二十幾年中一直沒有得到實際應用。截止到目前，已確定數(shù)十種蘇云金芽孢桿菌菌系及130多種它們編碼的殺蟲晶體蛋白。1983年美國華盛頓大學宣布成功將卡那霉素抗性基因導入煙草細胞，以及同年4月美國威斯康星大學宣布成功將大豆基因轉入向日葵共同標志著植物轉基因技術的誕生。1986年，首批轉基因植物(抗蟲、抗除草劑)被批準進入田間試驗。1989年哺乳動物抗體重鏈和輕鏈基因在煙草中成功表達并正確組裝成有功能的抗體。1990年Gordon-Kamm首次報道用基因槍轉化玉米懸浮細胞系獲得了可育的轉化體。隨后，玉米轉基因技術開始迅猛發(fā)展，大量轉基因植物陸續(xù)研制開發(fā)成功。Koziel(1993)等培育出了抗蟲轉基因玉米，轉基因植株能高水平表達C/7^〖W抗蟲基因。張秀君(1999)等用基因槍法將兩個含高賴氨酸蛋白質基因導入玉米的胚性愈傷組織。劉大文(2000)等將Z/^J-^a7va^基因轉化玉米胚性愈傷組織，經(jīng)過除草劑篩選得到陽性植株。Ishida(1996)等首次利用超雙元載體建立了根癌農(nóng)桿菌轉化玉米自交系的幼胚，F(xiàn)rame(2002)等成功實現(xiàn)了根癌農(nóng)桿菌利用普通的雙元載體轉化幼胚。張艷貞(2002)等對根癌農(nóng)桿菌介導法將殺蟲基因導入優(yōu)良玉米自交系進行了較為系統(tǒng)的研究。Huang和Wei(2005)利用根癌農(nóng)桿菌成功轉化了常規(guī)玉米自交系。Frame(2006)等和Lee(2007)等分別利用農(nóng)桿菌成功轉化了常規(guī)玉米自交系。我國在轉基因技術研究方面，已經(jīng)建立了比較成熟的玉米轉基因技術體系，在國內，中國農(nóng)業(yè)大學較早的開展了玉米遺傳轉化的工作，1994在國內外首次用子房注射的方法把抗蟲基因5t轉入玉米并獲得轉基因植株，以自主知識產(chǎn)權基因價為代表的抗蟲玉米已展示了良好的開發(fā)前景。同時，在無選擇標記、選擇標記基因刪除和目標基因產(chǎn)物定時降解、植物組織特異性優(yōu)勢表達等核心技術創(chuàng)新方面已具有較強的創(chuàng)新能力。目前已分離的抗蟲基因很多，主要的抗蟲基因有①細菌來源的抗蟲基因，主要是價毒蛋白基因(Cr/M6、CrWJc、Cr/么CryJ等)；②植物來源的蛋白酶抑制劑基因，特點在于抗蟲譜廣、來源于植物本身易于被公眾接受；③細菌來源的營養(yǎng)殺蟲蛋白(Vipl、Vip2、Vip3等)，廣譜抗鱗翅目，特別是對小地老虎、粘蟲和甜菜葉蛾具有較強作用。由于基因抗蟲能力及昆蟲耐受性的影響，轉基因抗蟲產(chǎn)品主要通過獲得更多更有效的抗蟲基因、改造已有基因、雙抗植物體等途徑獲得。美國是世界上種植轉基因玉米最大的國家，轉基因玉米推廣面積占美國玉米總面積的比例由2000年的25%上升至2007年的73%。數(shù)據(jù)顯示，由于Bt玉米的使用，農(nóng)藥和殺蟲劑的用量明顯下降，大大減少了對環(huán)境的污染。既減少了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，又可以節(jié)省勞動力。玉米抗蟲的優(yōu)良性狀為社會帶來了巨大的經(jīng)濟和環(huán)境效益，并被越來越多的大眾所接受，其推廣面積逐年大幅度提高。本實驗室對CryWc基因進行了基因編碼框長度及密碼子優(yōu)化改造，CryWc對鱗翅目昆蟲(如玉米螟)有很強的毒性，但是原始的基因不能在植物中高效表達，達不到植物保護的要求，我們按照單子葉植物編碼特征對Crj^4c基因進行了全面的改造，改造后的Co^4c-f被連在CaMV35S-Adhl為啟動子的表達載體上。通過共轉化的方法，把說基因Cr;^4c省轉到具有高效轉化效率的玉米自交系中，然后通過回交的方法獲得了含有抗蟲基因Ctt/4c-I的轉基因玉米骨干自交系。
發(fā)明內容發(fā)明目的玉米是我國的重要糧食作物，當前玉米蟲害嚴重，造成玉米大量減產(chǎn)，由此對我國玉米生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。生產(chǎn)上造成玉米減產(chǎn)的主要蟲害是玉米螟，因此采取有效措施控制其危害對玉米生產(chǎn)至關重要。目前解決蟲害的主要方法是在生長過程中噴施化學殺蟲劑。但是化學殺蟲劑不但殺死害蟲，還殺死了害蟲的天敵，造成生態(tài)平衡破壞和環(huán)境污染。本發(fā)明的目的是針對Bt菌株來源的C/yMc基因，通過對基因編碼框長度及密碼子序列的人工改造，改造后的編碼氨基酸密碼子序列如SEQIDN06所示，將改造后的序列構建植物高效表達載體，使改造后的基因能夠在植物中高效表達，將其轉化農(nóng)桿菌等微生物可以用于侵染玉米幼胚等植物組織，達到轉化玉米等植物的功效，從而提高玉米等植物的抗蟲性。通過轉基因及常規(guī)育種手段，把抗蟲基因"t轉入生產(chǎn)中普遍應用的骨干自交系當中，為解決玉米生產(chǎn)中的蟲害提供了一條行之有效途徑。解決問題美國已成為世界上種植轉基因玉米最大的國家，轉基因玉米推廣面積占美國玉米總面積的比例由2000年的25%上升至2007年的73%。數(shù)據(jù)顯示，由于Bt玉米的使用，農(nóng)藥和殺蟲劑的用量明顯下降，大大減少了對環(huán)境的污染。既減少了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，又可以節(jié)省勞動力。玉米抗蟲的優(yōu)良性狀為社會帶來了巨大的經(jīng)濟和環(huán)境效益，而在我國轉基因玉米品種培育較美國還有較大差距，為此08年國家啟動了《轉基因生物新品種培育科技重大專項》來改善目前狀況。我國在轉基因抗蟲玉米品種培育方面雖有些報道，但是卻沒有能夠最終商品化，主要歸結于5t基因的抗蟲效果及轉化植株的穩(wěn)定性。本發(fā)明對C7yMc蛋白的活性區(qū)域進行了細致的分析，在保證進一步提高其殺蟲活性的前提下，按照單子葉植物編碼特征對fr;^^進行了密碼子及編碼框長度的改造，使得該基因能夠在植物體中高效表達，并構建了植物表達載體，通過共轉化的方法，將改造后的價Cr7^4c-i/殺毒蛋白基因轉化玉米株系，經(jīng)過多代多點檢測，該基因不但在各株系中能夠正常表達殺蟲活性，而且能夠穩(wěn)定遺傳，這就為轉價抗蟲基因的推廣奠定基礎。技術方案1、Oy/^c基因的改造根據(jù)Cry^c不同區(qū)域的活性分析，我們對它的密碼子及編碼框進行了改造，改造后的核苷酸序列與原始的(^r"c同源性僅為69%，編碼框長度由原來的1179個氨基酸變?yōu)?16個氨基酸，而G+€含量也由原來的37.32%變?yōu)?7.64%。2、Cry^c-#基因的表達載體構建將人工合成的At基因3'端分別連上啟動子和增強子，5'端連上終止子，從而實現(xiàn)At基因在植物體內正常的表達，具體圖譜見(圖l)。依次為CaMV35S啟動子^Adhlintron—5tCryMc-4i碼區(qū)域一nos終止子；其中CaMV35S啟動子538bp,來自花椰菜花葉病毒CaMV，負責啟動價基因的表達；(SEQIDNO1)Adhlintron增強子575bp,來自玉米，負責增強At基因的表達(SEQIDN02);份Cry"c-i/基因編碼區(qū)域1868bp,人工合成，負責編碼殺蟲蛋白(SEQIDNO3);nos終止子253bp，為根癌農(nóng)桿菌Ti質粒T-DNA區(qū)胭脂堿合成酶基因終止子，終止基因的轉錄(SEQIDNO4)。3、說Oy2y4c-#基因在玉米植株中的表達將含OT^c-^基因的植物表達載體轉化玉米胚性愈傷組織，將含Cry^c-#的愈傷再生成苗，檢測"tCr7/^H/基因的表達情況(圖2)。4、轉價CryWc-#基因玉米植株抗蟲性鑒定通過田間人工接蟲檢測轉價CrWH植株玉米的抗蟲性。將轉價Cr/Wc-#玉米植株及非轉化植株于田間接蟲，進行抗蟲性分析(圖3)。圖l、含價Crj^4c-if基因的植物表達載體。圖2、利用金標Bt蛋白檢測試紙檢測轉AfCry^c-if基因植株。從左向右依次為轉價C/y^c-i/基因植株、轉化空載體植株、非轉基因植株。圖3a、轉價CxMc-#玉米接蟲2周后表現(xiàn)。圖3b、非轉價Crj^4c-i/玉米接蟲2周后表現(xiàn)。具體實施例方式1、Cry^c基因的改造本發(fā)明對^y^l通白的活性區(qū)域進行了細致的分析，在保證進一步提高其表達水平的前提下，按照單子葉植物編碼特征對CryMc進行了基因編碼框及密碼子改造。改造后的Crj^Mc-W與CrW力c序列同源性只有6將，編碼框長度由原來的1179個氨基酸變?yōu)?16個氨基酸，而G+C含量也由原來的37.32%變?yōu)?7.64%，改造前后密碼子使用率見下表。密碼子改變前序列見SEQIDN05，改造后序列見SEQIDN06。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2Crj^lc-維因的表達載體構建插入序列的大小和結構，確定其特性的分析方法插入序列的大小約為3234bp,依次為CaMV35S啟動子^Adhlintron—CrxMc-yfe編碼區(qū)域ios終止子；其中CaMV35S啟動子538bp,來自花椰菜花葉病毒CaMV，負責啟動CryZ4c-l基因的表達；Adhlintron增強子575bp，來自玉米，負責增強Cr;^4c-i/基因的表達；Cr/7A:省基因編碼區(qū)域1868bp，人工合成，負責編碼殺蟲蛋白；nos終止子253bp，為根癌農(nóng)桿菌Ti質粒T-DNA區(qū)胭脂堿合成酶基因終止子，終止CryWc-l基因的轉錄；植物選擇標記基因力ar，552bp，來自吸水鏈霉素，編碼膦化麥黃酮乙酰轉移酶，用來和CrxMc#基因共轉化。各片段大小和排列次序質粒的酶切圖譜及重組過程確定，并參考相關的資料。3目的基因與載體構建的圖譜，載體的名稱、來源、結構、特性和安全性，包括載體是否有致病性以及是否可能演變?yōu)橛兄虏⌒苑治?。目的基因是和植物篩選標記基因^r進行共轉化，目的基因所在的載體是線性結構，僅包括CaMV35S啟動子、Adhlintron、At編碼區(qū)域、nos終止子，不含有任何其他冗余序列。這些核苷酸序列均不帶有致病基因，不攜帶毒素合成基因，對動植物安全，無演變?yōu)橛兄虏⌒再|粒的可能。4載體中插入?yún)^(qū)域各片段的資料4.1啟動子和終止子的大小、功能及其供體生物的名稱'CaMV35S啟動子，780bp長，來自花椰菜花葉病毒CaMV，負責啟動Crj^4c-I基因的表達。nos終止子，250bp長，為根癌農(nóng)桿菌Ti質粒T-DNA區(qū)胭脂堿合成酶基因終止子，終止Crj^4cT(/基因轉錄。4.2標記基因和報告基因的大小、功能及其供體生物的名稱標記基因力ar基因(bial鄰hosresistancegene)，長552bp,編碼217個氨基酸。能使植物抵抗以L-Phosphiothricin(PPT，Y-羥基甲基亞膦基-a-酪氨酸，膦化麥黃酮)為活性成分的除草劑(De-Block等，1987;Wohlleben等，1988),如除草劑Bial即hos(雙丙氨膦)和Glufosinate(草丁膦)。Z^r基因是從合成Bialaphos的吸水鏈霉菌(6Yre一，es/^rosc,.ctw)中分離出來的(Wohlleben等，1988)，是S,Hygroscopicus避免自身產(chǎn)物Bialaphos毒害的保護基因，編碼PPT乙酰轉移酶(PAT)。PAT催化乙酰輔酶A的乙?；D移到PPT的氨基上，形成乙酰PPT，而使PPT失活。5轉基因方法采用基因槍法將插入序列導入受體植株的愈傷組織，經(jīng)除草劑草丁膦篩選后獲得轉基因植株。具體方法為一、誘導II型愈傷組織1、去除苞葉。切除果穗頂端約lcm左右，用鑷子從頂端插入果穗，這樣可以以鑷子當作把手，有利與操作，然后把果穗放入含有消毒液的燒杯里，根據(jù)實際需要，可以在同一個燒杯里放4-6個果穗。2、向燒杯里加約700ral的消毒液(50%的漂白劑或5.25%的次氯酸鈉，并加入一滴Tween20)用來浸泡果穗，在消毒20分鐘過程當中，不時的旋轉果穗同時輕輕拍打燒杯以驅除子粒表面的氣泡，從而達到最佳的消毒效果，消毒結束后，取出果穗并放入盛滿滅菌水的燒杯里，在水里洗3次，然后準備剝胚。3、把消毒過果穗的一端放在一個大的培養(yǎng)皿上,用大的手術刀削掉子粒的頂部(1-2mm),在這過程當中，要勤消毒所用的工具，如手術刀片、培養(yǎng)皿、剝胚刀等。4、用剝胚刀的刀尖插在胚和胚乳之間,然后輕輕向上撬出幼胚,用小的手術刀尖輕輕托起幼胚,確保幼胚不受到任何的損傷，把幼胚的胚軸面緊貼放有濾紙的N6E培養(yǎng)基，胚的密度大約是2X2cm(20-25個/皿)。5、新鮮的幼胚大約1.5-1.8咖大小，放置在N6E培養(yǎng)基上面，每隔10-15天繼代一次，剛獲得的幼胚容易長出芽狀組織，這樣可以提早去掉該組織，而不用等到10-15天。6、挑選優(yōu)等II型愈傷第二次愈傷繼代時，II型愈傷已經(jīng)開始形成，其特征為顏色米黃，生長速度快，松散易碎，新生愈傷頂端呈現(xiàn)米粒狀顆粒?？梢愿鶕?jù)其特征來進行有針對性的挑選，可以把已經(jīng)分化出的II型愈傷分成麥粒狀大小，每皿(90cm)放20-25塊。7、為了保證愈傷的質量，保證每次繼代的時間間隔不能超過15天，同時保證一直有400皿以上的II型愈傷，以便做基因槍轉化。二、金粉的準備和基因槍轟擊1、稱量15mg金粉并放入滅菌后的1.5ml的印pendorf離心管當中，這樣結果是10X的量。2、在超凈臺下，向每個離心管中加入500ul冰凍(-20°C)無水乙醇，震蕩15sec，在超凈臺上收集金粉到離心管管底部，靜止30分鐘，直到金粉全部沉淀。3、然后轉速3000rpm離心60sec，徹底去除乙醇。再向離心管中加入冰浴的無菌ddH20，用手指輕彈混勾，然后轉速3000rpm離心60sec。重復上述步驟2-3次，最后一次用轉速5000rpm離心15sec，然后移去上清，再用500ulddH20懸浮。震蕩15sec，然后快速懸浮混勻，邊混邊分裝。4、具體的分裝方法是先把10個離心管放好，用25ul的量分裝，重復分裝兩次，第一遍從第一個管開始，第二遍從最后一個管開始，這樣每個離心管含有50ul水，1.5mg金粉。然后蓋上蓋子于-2(TC保存。5、上午先把要打槍的愈傷分成小塊，堆積在滲透培養(yǎng)基(N60SM)的中央?yún)^(qū)域，根據(jù)計劃做準備。6、目的DNA的包裹先把分裝好的金粉(-20'C)(每管1.5mg并保存在50微升超純水當中)放在冰上，同時把CaCL2濃度為2.5M(4。C)和亞精胺濃度為0.1M(-7(TC)也放在冰上融化，其中CaCL2和亞精胺分裝成一次性使用的包裝。7、用手指輕輕彈裝有金粉的離心管使之懸浮起來，然后加入目的DNA(60-200ng)，迅速用手指輕彈使之混勻然后加入50微升CaCL2并用槍頭輕輕吸吐使之混勻，然后加入20微升亞精胺，靜置30秒把離心管放在漩渦振蕩器上面震蕩10分鐘(注意使旋渦液體不要上升太高，同時使液體全部懸浮起來)。8、離心管放到冰上靜置5分鐘(如果震蕩以后有金粉在液體表面漂浮,靜置前再用手指輕彈使金粉沉淀下來)，然后2000rpm離心15秒，然后用吸頭吸掉上清加入預冷(-20°C)的無水乙醇250微升，并用槍頭輕輕(使20微升的槍調到10-13微升)吸吐混勻重復以上步驟3-4次，然后加入無水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏載片上面開始基因槍轟擊。9、基因槍轟擊以后的1-12小時把愈傷倒到N6E培養(yǎng)基上進行恢復。三、轉基因植株的獲得1、在N6E培養(yǎng)基上誘導愈傷組織10-14天后，轉移到N6S(選擇培養(yǎng)基)上面(2.Omg/Lbialaphos)開始選擇含有轉化子的細胞，然后用parafilm封口膜封培養(yǎng)皿。2、3周以后，把胚轉移到新鮮的N6S培養(yǎng)基上面，大約6-8周，就會選到抗草胺膦的克隆。3、把II型愈傷組織每皿轉移15片(4mm/片)到再生培養(yǎng)基I上面，25度暗培養(yǎng)2-3周，并用通風帶封住培養(yǎng)皿。4、2-3周后，把成熟的胞質胚轉移到再生培養(yǎng)基II上面準備發(fā)芽，同時用通風帶封住培養(yǎng)皿，植株將在這個培養(yǎng)基里長葉和根。5、移栽成活的轉化植株長出7-8葉時，取葉片提取DNA,采用PCR技術檢測外源基因，轉基因植株開花后套袋自交或姊妹交結實。種子播種在溫室，植株長到4-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測是帶有外源基因，對PCR陽性植株進行SouthernbloUing檢測，選轉基因植株進行基因表達分析。6、檢測價Cr/Mc-膽因在轉化植株中的表達采用Bt-CrylAb/Ac免疫檢測試紙檢測Bt蛋白表達情況。6.1、檢測樣本處理及準備取0.3g新鮮的玉米葉片，放入2ml離心管中，加入600微升蒸餾水和0.2g石英砂研磨，取上清液檢測。6.2、樣本檢測使用前將試紙恢復至室溫(15-30°C),取500微升研磨上清液至微量離心管中，將檢測試紙垂直插入微量離心管中，樣品端淹沒入樣品液的深度約為O.5cm。IO秒鐘后，取出放平閱讀檢測結果。6.3、結果判斷檢測線及對照線一般可在3-5min內出現(xiàn)(圖2)。陽性結果在檢測條上出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，一條檢測線和一條質控線。陰性結果在檢測條上僅出現(xiàn)一條紫紅色質控線。無效結果在質控線位置未出現(xiàn)一紫紅色條帶，表明操作不正確或試紙變質。7、轉5tCryWc-f基因玉米植株田間抗蟲性鑒定轉基因玉米植株具有抗玉米螟特性，其葉片中含有5t殺蟲蛋白。未轉基因的對照植株不能合成Bt殺蟲蛋白，喂食針尖大小玉米螟幼蟲后基本死亡。轉基因植株的葉片有5t殺蟲蛋白是由于轉入了CaMV35S啟動子啟動的5t基因的表達。于玉米8葉期將己經(jīng)黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于玉米心葉中。每株接2-3個中等大小的卵塊，于接蟲后20-25天調查食葉級別。食葉級別的記載方法按國際玉米螟協(xié)作組制定的9級分級標準。l級蟲孔針狀，稀少分散2級蟲孔針狀，數(shù)量中等3級蟲孔針狀，數(shù)量大4級蟲孔火柴頭大，稀少分散5級蟲孔火柴頭大數(shù)量中等6級蟲孔火柴頭大數(shù)量大7級蟲孔更大稀少分散8級蟲孔更大數(shù)量中等9級蟲孔更大數(shù)量大其中l(wèi)-2.9級為高抗；3-4.9級為抗；5-6.9級為感；7-9級為高感。根據(jù)上述標準，我們對含有Cry^c-I基因及不含有CryWc-i/基因的玉米株系進行田間接蟲，結果含有價C玎7U基因的株系表現(xiàn)為高抗，而不含有價Q丁X4c-#基因的株系表現(xiàn)為高感(圖3)。SEQIDNO1(CaMV35S啟動子序列)SEQIDN02(Adhlintron增強子序列)GGACCCGTGCAGCTGCGGTGGCAACTAGTSEQIDNO3(價CryWc-l基因編碼區(qū)域序歹lJ)AGTGACCGCCACCCTTGAGGCCGAGTACTGASEQIDNO4(nos終止子序列)SEQIDNO5(密碼子改變前CiT"c基因及氨基酸序列)1ATGGATAACAATCCGAACATCAATGAATGCATTCCTTATAATTGTTTAAGTAACCCTGAA61GTAGAAGTATTAGGTGGAGAAAGAATAGAAACTGGTTACACCCCAATCGATATTTCCTTG121TCGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTGAATTTGTTCCCGGTGCTGGATTTGTGTTAGGACTA181GTTGATATAATATGGGGAATTTTTGGTCCCTCTCAATGGGACGCATTTCTTGTACAAATT241GAACAGTTAATTAACCAAAGAATAGAAGAATTCGCTAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTA301GAAGGACTAAGCAATCTTTATCAAATTTACGCAGMTCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGAT361CCTACTAATCCAGCATTAAGAGAAGAGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCC421CTTACAACCGCTATTCCTCTTTTTGCAGTTCAAAATTATCAAGTTCCTCTTTTATCAGTA481TATGTTCAAGCTGCAAATTTACATTTATCAGTT'TTGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAA541AGGTGGGGATTTGATGCCGCGACTATCAATAGTCGTTATAATGATTTAACTAGGCTTATT601GGCAACTATACAGATTATGCTGTACGCTGGTACAATACGGGATTAGAACGTGTATGGGGA661CCGGATTCTAGAGATTGGGTAAGGTATAATCAATTTAGAAGAGAATTAACACTAACTGTA721TTAGATATCGTTGCTCTGTTCCCGAATTATGATAGTAGAAGATATCCAATTCGAACAGTT781TCCCAATTAACAAGAGAAATTTATACAAACCCAGTATTAGAAAATTTTGATGGTAGTTTT841CGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAAGAAGTATTAGGAGTCCACATTTGATGGATATACTT901MCAGTATAACCATCTATACGGATGCTCATAGGGGTTATTATTATTGGTCAGGGCATCAA961ATAATGGCTTCTCCTGTAGGGTTTTCGGGGCCAGAATTCACTTTTCCGCTATATGGAACT1021ATGGGAAATGCAGCTCCACAACAACGTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTATAGA1081ACATTATCGTCCACTTTATATAGAAGACCTTTTAATATAGGGATAAATAATCAACAACTA1141TCTGTTCTTGACGGGACAGAATTTGCTTATGGAACCTCCTCAAATTTGCCATCCGCTGTA1201TACAGAAAAAGCGGAACGGTAGATTCGCTGGATGAAATACCGCCACAGAATAACAACGTG1261CCACCTAGGCAAGGATTTAGTCATCGATTAAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCTTT1321AGTAATAGTAGTGTAAGTATAATAAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCT1381GAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAAC1441TTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGACCAGGATTTACTGGTGGGGACTTAGTTAGA1501TTAAATAGTAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTC1561CCATCGACATCTACCAGATATCGAGTTCGTGTACGGTATGCTTCTGTAACCCCGATTCAC1621CTCMCGTTAATTGGGGTAATTCATCCA]TTTTTCCAATACAGTACCAGCTACAGCTACG1681TCATTAGATAATCTACAATCAAGTGATTTTGGTTATTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACA1741TCTTCATTAGGTAATATAGTAGGTGTTAGAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATAATA1801GACAGATTTGAATTTATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAATATAATCTGGAAAGA脂GCGCAGAAGGCGGTGAATGCGCTGTTTACGTCTACAAACCAACTAGGGCTAAAAACAAAT1921GTAACGGATTATCATATTGATCAAGTGTCCAATTTAGTTACGTATTTATCGGATGAATTT1981TGTCTGGATGAAAAGCGAGAATTGTCCGAGAAAGTCAAACATGCGAAGCGACTCAGTGAT2041GAACGCAATTTACTCCAAGATTCAAATTTCAAAGACATTAATAGGCAACCAGAACGTGGG2101TGGGGCGGAAGTACAGGGATTACCATCCAAGGAGGGGATGACGTATTTAAAGAAAATTAC2161GTCACACTATCAGGTACCTTTGATGAGTGCTATCCAACATATTTGTATCAAAAAATCGAT2221GAATCAAAATTAAAAGCCTTTACCCGTTATCAATTAAGAGGGTATATCGAAGATAGTCAA2281GACTTAGAAATCTATTTAATTCGCTACAATGCAAAACATGAAACAGTAAATGTGCCAGGT2341ACGGGTTCCTTATGGCCGCTTTCAGCCCAAAGTCCAATCGGAAAGTGTGGAGAGCCGAAT2401CGATGCGCGCCACACCTTGAATGGAATCCTGACTTAGATTGTTCGTGTAGGGATGGAGAA2461AAGTGTGCCCATCATTCGCATCATTTCTCCTTAGACATTGATGTAGGATGTACAGACTTA2521AATGAGGACCTAGGTGTATGGGTGATCTTTAAGATTAAGACGCAAGATGGGCACGCAAGA2581CTAGGGAATCTAGAGTTTCTCGAAGAGAAACCATTAGTAGGAGAAGCGCTAGCTCGTGTG2641AAAAGAGCGGAGAAAAAATGGAGAGACAAACGTGAAAAATTGGAATGGGAAACAAATATC2701GTTTATAAAGAGGCAAAAGAATCTGTAGATGCTTTATTTGTAAACTCTCAATATGATCAA2761TTACAAGCGGATACGAATATTGCCATGATTCATGCGGCAGATAAACGTGTTCATAGCATT2821CGAGAAGCTTATCTGCCTGAGCTGTCTGTGATTCCGGGTGTCAATGCGGCTATTTTTGAA2881GAATTAGAAGGGCGTATTTTCACTGCATTCTCCCTATATGATGCGAGAAATGTCATTAAA2941AATGGTGATTTTAATAATGGCTTATCCTGCTGGAACGTGAAAGGGCATGTAGATGTAGAA3001GAACAAAACAACCAACGTTCGGTCCTTGTTGTTCCGGAATGGGAAGCAGAAGTGTCACAA3061GAAGTTCGTGTCTGTCCGGGTCGTGGCTATA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