專利名稱：一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌fel5-as1和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域，涉及一種新的棘豆埃里格孢菌(vS^Wh'w's a^^o/^'s)，具體涉及一種能夠合成莖直黃芪主要毒素苦馬豆素(Swains。nine， SW)的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和應用。
背景技術：
瘋草(Locoweed)是豆禾斗棘豆屬((9;c盧ra;^)和黃芪屬(^Wraga/w)有毒植物的 總稱，也是世界范圍內危害草原畜牧業(yè)最嚴重的一類毒草。在我國，瘋草廣泛 分布于西北、華北和西南的廣大草原，危害面積達1100萬hm2,占全國草場面 積的2.8%。莖直黃芪是我國瘋草黃芪屬的一種，主要分布于西藏地區(qū)；莖直黃 芪主要危害馬、羊、牛、駱駝等家畜，不僅引起中毒死亡，還會導致母畜繁殖， 公畜發(fā)情，影響畜種改良，嚴重危害我國西部地區(qū)草原畜牧業(yè)的發(fā)展。
莖直黃芪的主要毒性成份是苦馬豆素(Swainsonine， SW)，化學名稱為1，2,8-三羥基八氫吲哚里西啶(trihydroxyoctahydro-indolizidine)。苦馬豆素可抑制哺乳 動物細胞的溶酶體a -甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶II的活性，導致低聚糖 代謝和糖蛋白合成障礙，從而引起動物組織器官功能紊亂。動物采食莖直黃芪 等瘋草后，會發(fā)生中毒，導致大批家畜死亡，給畜牧業(yè)造成巨大損失。
莖直黃芪是豆科草本植物，其營養(yǎng)價值豐富。如果能采取相應的措施將毒 草變?yōu)榭衫玫哪敛葙Y源，既可以保護生態(tài)環(huán)境，防止草地退化，又可促進當 地畜牧業(yè)的發(fā)展，對社會、牧民、生態(tài)都有著深遠的意義。
近年來，在莖直黃芪的危害、有毒成分、毒理機制、防除和利用等方面的研究取得了重要進展，但迄今還沒有控制莖直黃貧蔓延和防止動物采食莖直黃 芪中毒的特效方法，致使動物莖直黃芪中毒問題日趨嚴重，成為草原畜牧業(yè)的 大患。對于莖直黃芪中毒病的治療目前尚無特效療法，關鍵在于預防。其預防 和治療方法與其他瘋草相同。國內學者曾嘗試用人工挖除、焚燒、應用除草劑、 浸泡、生物控制、生態(tài)控制、免疫注射、飼料添加劑、投放緩釋丸等。但仍然 在特定地區(qū)或季節(jié)實施，尚未大面積推廣應用，對主要毒性成份的合成機理和 導致動物中毒的分子機理仍不清楚，因而不能從根本上放出動物瘋草中毒病。
研究發(fā)現， 一些植物中的有毒成分與其內部寄生的內生真菌、病原真菌或 污染的霉菌有關，通過控制植物中的這些微生物可以防止動物中毒。如麥角菌 寄生在牛尾草和黑麥草中，產生很高含量的麥角生物堿，致使家畜中毒，造成 嚴重的經濟損失。人們通過改良這種牧草，推出不含麥角菌的牛尾草和黑麥草， 從根本上解決了動物牛尾草和黑麥草中毒的問題。通過抑制莖直黃貧中合成苦 馬豆素的內生菌的生長可以降低瘋草毒素的含量，不僅能從根本上解決動物莖 直黃芪中毒問題，還可以為防治動物瘋草中毒病提供借鑒，對草原毒草的生物 學控制利用和草原生態(tài)學研究起到積極作用，具有很好的經濟效益和社會效益。
苦馬豆素具有抗腫瘤作用，不僅能抑制實體瘤的生長和轉移，具有免疫刺 激功能和抗輻射作用，而且能減輕化療和放療對機體造成的不良影響，從而促
進機體的抗腫瘤免疫功能，加拿大已用于m期臨床試驗?？囫R豆素具有開發(fā)抗
腫瘤新藥的良好前景，然而苦馬豆素的來源卻十分匱乏，價格昂貴，遠遠不能 滿足人們研究和臨床醫(yī)療的需要。因此，挖掘苦馬豆素的資源，開辟生產苦馬 豆素的新途徑是解決苦馬豆素匱乏的關鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內容
針對現有技術中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種合成苦馬 豆素的棘豆埃里格孢菌，它能有效的合成苦馬豆素，為徹底解決莖直黃芪的毒 害奠定基礎，也為研制抗癌新藥提供材料。
為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案如下
一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌(^M e^/sia arj^rc^'s) FEL5-AS1， 于2008年10月|8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO: M 208144，保藏地址中國武漢武漢大學。
棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1菌株寄生于莖直黃芪的葉、莖、種的組織內部， 與莖直黃芪共生并且不會引起莖直黃芪發(fā)生病害，經體外培養(yǎng)發(fā)現FEL5-AS1能 夠產生SW，說明其參與著莖直黃芪中SW的生物合成，與莖直黃芪的毒性緊密相 關，通過抑制FEL5-AS1在莖直黃芪中的生長可以降低莖直黃甚毒性的目的。
棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1菌株經體外培養(yǎng)能夠大量繁殖擴增，并能在人工 培養(yǎng)的條件下合成抗腫瘤活性物質SW，為研制抗癌藥提供了新材料。


圖1 FEL5-AS1菌株的單個菌落形態(tài)圖。 圖2 FEL5-AS1菌株的分生孢子的顯微鏡圖。 圖3利用MEGA 4. 0軟件構建系統(tǒng)進化樹結構圖。 圖4 FEL5-AS1菌絲提取物的氣相色譜圖。
具體實施例方式
以下結合發(fā)明人給出的附圖和具體試驗例及具體實施例來進一步說明本發(fā) 明菌棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1的有益效果和制備方法。 實施例l:菌棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1的分離篩選1 )將采自西藏日喀則草原上生長的整株莖直黃芪用去離子水洗去莖直黃 芪表面的塵土，用滅菌的鑷子將植物的葉、莖、種分離，然后將葉、莖、種分 別用紗布包扎，進行表面消毒。
2) 用滅菌的濾紙將經表面消毒的植物組織上的水分吸去，再用滅菌的剪 刀將葉、莖、種等分別剪成3 mr^大小的組織塊，然后分別用滅菌的鑷子將各 組織塊接種于水瓊脂培養(yǎng)基表面，置培養(yǎng)箱中18 'C培養(yǎng)。
3) 待菌絲從組織塊周圍長出時，挑取菌落邊緣的菌絲接種于富集培養(yǎng)基 表面，置18 t:培養(yǎng)箱中進行富集培養(yǎng)；收集富集培養(yǎng)的真菌菌絲，提取其生物 堿并應用薄層色譜法和氣相色譜法檢測，用苦馬豆素標準品作對照，檢測菌絲 生物堿中是否含有苦馬豆素，最后篩選得到可以合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢 菌FEL5-AS1。
實施例2:菌棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1的鑒定 1、形態(tài)學特征
FEL5-AS1菌株的菌落呈圓形，起初為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸轉變 為淡黃色、褐色、黑褐色，中央略突起(圖1)。菌絲體具橫隔，無縱隔，部分 老齡菌絲生出分生孢子梗，少有分支，產孢梗屈膝狀彎曲，孢疤痕明顯。分生 孢子及分生孢子梗具橫隔，無縱隔，分生孢子的橫隔膜較厚，橫隔數為1 4個 不等，孢子呈棒狀，近圓柱形，分生孢子大小為20 90 iimX5 10 Um(圖2)。
2)培養(yǎng)學的特征
該菌株在在PDA、 PCA、 Cz即ek等培養(yǎng)基上生長非常緩慢，其生長速度分別 為0.60， 0. 51和0. 48 mm/d，最適生長溫度為18°C，當溫度高于25。C時生長 受到抑制。所述的PM、 PCA、 Czapek培養(yǎng)基的組分及配比為
PDA培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂13g，蒸餾水1000mL， pH 為6 7， 12rC高壓滅菌20min。
PCA培養(yǎng)基去皮馬鈴薯20g，胡蘿卜20g，瓊脂13，蒸餾水1000mL， pH 為6 7， 12rC高壓滅菌20min。
Czapek培養(yǎng)基葡萄糖20g， MgS04. 7H20 0 . 5g， KC1 0. 5g， FeS04. 7H20 0. Olg， K2HP04 lg， NaN03 2g，蒸餾水1000mL，瓊脂13g， pH為6 6. 5， 121。C高壓滅 菌20 min。
3)分子生物學鑒定
FEL5-AS1菌株ITS-5. 8S rDNA序列已在GenBank公開，登錄號為EU604068。 將FEL5-AS1菌株的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST與Genbank中的5.8S rDNA-ITS序列進行同源性比較，以假球殼科(戶/eo^ oraceae)的鏈格孢屬 "http://er"an'a)、匍柄霉屬(5fempty/^m)、假格孢屬(A7柳6;/a)、埃里格孢屬 (五m6e〃&^)、細基格孢屬(Woc/twfem)、突臍蠕孢屬(五xyera/w7wm)、平臍蠕 孢屬(S!i o/a^)、彎孢屬(Cwvw/an'a)、內臍蠕孢屬(Z>ecfe/era)等菌株序列 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。應用ClustalX 1.83 version和MEGA 4.0軟件采用鄰接法 (neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)， FEL5-ASl菌株的遺傳進化距離 與埃里格孢屬最近，與五m&〃Wa ox_y rap/5 strain DA0M 237697同源性最高， 說明該菌在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學上為棘豆埃里格孢。
根據形態(tài)學特征、培養(yǎng)特性、系統(tǒng)發(fā)育分析，并結合文獻報道，確定該菌 為棘豆埃里格孢菌FEL5-ASl 。
試驗例1:菌棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1合成苦馬豆素試驗將FEL5-AS1菌株接種于富集培養(yǎng)基表面，置18 。C培養(yǎng)30d，然后將菌絲刮下，50 'C烘干，然后稱量菌絲。將干燥的菌絲研磨成粉后，用濾紙將其包裹放入索氏提取器中用甲醇70 'C加熱提取24h，將甲醇提取液濃縮揮干得殘渣。用去離子水將殘渣溶解，加入5cm長的AG 50W陽離子交換樹脂柱。先用去離子水洗脫樹脂柱，再用氨水洗脫樹脂柱，收集氨水洗脫液，并將其濃縮揮干，用甲醇將SW標準品、FEL5-AS1中提取的生物堿溶解，并分別點樣于硅膠薄層板上，用薄層色譜法檢測。若菌絲生物堿經薄層色譜分離后具有與SW標準品的顏色和位移相同的斑點，即可確定其對應的真菌可以合成SW。應用氣相色譜法檢測菌絲中SW的含量為67.67 pg/g，其氣相色譜圖如圖4所示。
試驗例2:幾種殺菌劑對棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1抑菌試驗
1) 供試菌棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1。
2) 供試殺菌劑50%多菌靈，70%甲基托布津，70%百菌清，50%福美雙，45°/。萬霉靈，25 0/。丙環(huán)唑。
3) 抑菌試驗采用菌絲生長速率測定法測定不同殺菌劑對FEL5-AS1的生長抑制作用。在15mL的滅好菌的PDA培養(yǎng)基中分別加入不同的殺菌劑，配制成含不同殺菌劑的培養(yǎng)基平板。然后將直徑為6mm的菌苔接入含有殺菌劑的培養(yǎng)基平板上，置于18 。C下培養(yǎng)，以不加殺菌劑的處理作對照。培養(yǎng)15d后測量菌落生長直徑，計算生長抑制率，每個處理重復6次。為了測試不同濃度殺菌劑對FEL5-AS1的影響，每種殺菌劑采用2種濃度:500(ig/mL或l 00(Vg/mL。菌絲的生長抑制率按下面公式進行計算
菌絲生長抑制率(％)=(對照菌落生長直徑一處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑XIOO。4)不同殺菌劑對病原菌生長的抑制作用6種供試殺菌劑對棘豆埃里格孢
菌FEL5-AS1的菌絲生長均有一定程度的抑制作用(表1)。其中25 %丙環(huán)唑是6種供試殺菌劑中效果最好的，當供試濃度為500jig/mL或l 000ixg/mL時，25 %丙環(huán)唑對FEL5-AS1菌絲的生長都有很強的抑制作用；70 %甲基托布津的抑制作用略低于25%丙環(huán)唑，但仍可以達到比較好的效果，隨著濃度的升高，抑制作用越明顯；50%多菌靈，45%萬霉靈的效果較差，且不同濃度之間的抑制效果無顯著性差異;70 %百菌清和50 %福美雙抑制率最弱。
表1 不同殺菌劑對棘豆埃里格孢菌FEL5-AS 1菌絲生長的抑制作用
供試殺菌劑濃度(u g/mL)菌落直徑(mm)抑制率(％)
對照組(CK)20.50
50 °/。多菌靈50015.723.41
50 °/。多菌靈100015.225.85
70°/。甲基托布津50010.650.44
70%甲基托布津10009.454.15
70 %百菌清50016.519.51
70%百菌清100016.220.98
50 %福美雙50017.713.66
50 °/。福美雙畫17.315.61
45 %萬霉靈50014.529.27
45 %萬霉靈100012.240.49
25 %丙環(huán)啤5007.762.44
25 %丙環(huán)唑10007.165.3權利要求
1.一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌(Embellisia oxytropis)FEL5-AS1，保藏號為CCTCC NOM 208144。
2. 權利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1在合成苦馬豆素中的應用。
3. 權利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1在制藥中的應用。
4. 權利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1在制備預防動物瘋草中毒 藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1，于2008年10月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC NOM 208144。該菌株的菌落呈圓形，起初為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸轉變?yōu)榈S色、黃褐色、黑褐色，中央略突起。菌絲體具橫隔，無縱隔，部分老齡菌絲生出分生孢子梗，分生孢子梗有分支，產孢梗屈膝狀彎曲，孢疤痕明顯。分生孢子及分生孢子梗具橫隔，無縱隔，分生孢子的橫隔膜較厚，橫隔數為1～4個不等，孢子呈棒狀，近圓柱形，分生孢子大小為20～90μm×5～10μm；該菌株從莖直黃芪的葉、莖、種子中經人工分離、篩選而得，具有合成瘋草主要毒素苦馬豆素(SW)的功能。
文檔編號C12N1/14GK101514326SQ200910021858
公開日2009年8月26日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權日2009年4月3日
發(fā)明者余永濤, 王建華, 王建娜, 耿果霞, 趙清梅 申請人:西北農林科技大學