專利名稱：：一種提高重組人Cu，Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及基因定點突變、基因重組、外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)和目的蛋白的純化，特別涉及一種提高重組人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)活性蛋白產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
：1、SOD的發(fā)現(xiàn)和作用機理超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)具有抗幅射、抗腫瘤、抗氧化的作用，是一種療效廣泛的藥用酶。該酶最初是在1938年由Mann和Kdlin首先從牛紅細(xì)胞中分離出一種藍(lán)色的含Cu蛋白質(zhì)，當(dāng)時僅僅認(rèn)識到它是一種蛋白質(zhì)。而自從1968年Fridovich等證實其具有清除生物體內(nèi)氧自由基的特異性生物學(xué)活性后受到廣泛重視。該酶廣泛存在生物體各組織內(nèi)，能夠催化衰老的啟動因子——超氧陰離子自由基(^)的歧化反應(yīng)，并在過氧化氫酶的作用下最終轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的1102和02，抑制自由基的氧化作用，從而有效地預(yù)防超氧自由基陰離子對機體的毒害作用。2、SOD的應(yīng)用SOD作為一種抗氧化、抗衰老產(chǎn)品的添加劑原料可以應(yīng)用于醫(yī)藥、日用化妝品、保健品及食品等行業(yè)。在醫(yī)藥應(yīng)用方面，SOD可以增強機體抗輻射損傷能力、防衰老、預(yù)防和治療多種疾病，而且對人和動物無毒副作用。SOD在一些腫瘤、炎癥、自身免疫疾病的治療中有良好療效，目前，SOD作為藥用酶已經(jīng)開始試用于治療關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等疾病。在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流綜合癥、老年性白內(nèi)障、心血管疾病、輻射病、癌癥和癌癥的放射治療預(yù)防以及人類長壽等領(lǐng)域的研究中也己有突破性進(jìn)展。國內(nèi)外已有SOD制劑的出現(xiàn)和應(yīng)用。在日用化妝品方面，在化妝品中添加SOD，可以起到防曬、抗衰老、抗炎的作用，此類產(chǎn)品比如SOD蜜、康妮SOD等。SOD還可以加入到牙膏、漱口水、含片等中，對預(yù)防口腔疾病有一定的療效。在保健品及食品行業(yè)，SOD和其它抗氧化劑一樣可作為罐頭食品、果汁、啤酒等的抗氧化劑，防止過氧化引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象；還可作為水果、蔬菜的良好保鮮劑。3、SOD的結(jié)構(gòu)和分類迄今為止，人們己從細(xì)菌、真菌、原生動物、藻類、昆蟲、魚類、植物和哺乳動物等生物體內(nèi)分離得到了SOD。天然存在的SOD雖然活性中心離子不同，但催化活性部位卻有高度的結(jié)構(gòu)同一性和進(jìn)化的保守性，即活性中心金屬離子都是與3或4個組氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含有一個天門冬氨酸羧基配位)和1個H20分子呈畸變的四方錐或扭曲的四面體配位。SOD從結(jié)構(gòu)上可分為兩族Cu,Zn-SOD為第一族，Mn-SOD和Fe-SOD為第二族。按照金屬輔基的不同，SOD至少可以分為5種類型Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD和Fe,Zn-SOD。其中，Cu,Zn-SOD分布最廣，廣泛存在于動物的血、肝，菠菜葉、刺梨等生物體中。Cu,Zn-SOD在人體內(nèi)專一地清除生物體內(nèi)的超氧陰離子，是平衡機體內(nèi)氧自由基的主要蛋白，是SOD結(jié)構(gòu)研究的主要突破口。比較不同來源的Cu,Zn-SOD的氨基酸序列可以發(fā)現(xiàn)，它們的同源性都很高；有些氨基酸還很保守，在所有序列中都不變，這暗示著這些氨基酸與活性中心有密切的關(guān)系。人Cu,Zn-SOD(hCu，Zn-SOD)由2個亞基組成，每個亞基含一個C^+和一個Z^+，C+與催化活性有關(guān)，Z^+與維持分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，也見于過氧化物酶體中。4、現(xiàn)有Cu,Zn-SOD產(chǎn)品目前已開發(fā)的SOD產(chǎn)品絕大分都是Cu,Zn-SOD，主要是從動物的血、肝中分離提取的。如德國生產(chǎn)的Orgotein為由動物紅細(xì)胞、肝等分離而得的水溶性Cu,Zn-SOD，可用作早產(chǎn)嬰兒的氧中毒癥的解毒藥及治療關(guān)節(jié)炎等炎癥的非固醇類消炎藥等。另外近年來一些研究者也分別研究了從大蒜、桑葉、沙棘、仙人掌中提取Cu,Zn-SOD的工藝。Cu,Zn-SOD的動物提取主要有以下幾個步驟溶血液的制備、選擇性熱變性、超濾濃縮、丙酮沉淀、柱層析、冷凍干燥。上述提取方法雖然可以有效地從動、植物的組織中獲得Cu,Zn-SOD，但是存在著以下幾類缺陷。一、生產(chǎn)原料有限，成本高；二、生產(chǎn)需大量的有機溶劑，污染大；三、獲得的產(chǎn)品純度和比活性都很低；四、獲得的Cu,Zn-SOD對于人體來說具有異體蛋白免疫原性，作為藥品、保健品和護(hù)膚品的活性因子不可避免某些異源SOD引起的過敏反應(yīng)。上述這些缺陷使得Cu,Zn-SOD在應(yīng)用方面受到很大限制。因此，利用基因工程方法生產(chǎn)重組人Cu，Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)就成為了廣開酶源、降低成本和獲得無免疫原性產(chǎn)品的有效途徑。5、rhCu，Zn-SOD的研究進(jìn)展通過對hCu,Zn-SOD基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，該酶含有4個Cys殘基，分別位于6、57、111和146位，其中Cys57和Cysl46形成的二硫鍵是hCu,Zn-SOD中的一對鏈內(nèi)二硫鍵，Cys6和Cyslll保持-SH基團(tuán)為游離狀態(tài)。目前利用基因工程方法生產(chǎn)rhCu,Zn-SOD主要集中在兩個方面，一方面是通過對Cu,Zn-SOD進(jìn)行修飾來提高其穩(wěn)定性；另一方面是利用不同的表達(dá)系統(tǒng)來提高其產(chǎn)量。在對Cu,Zn-SOD進(jìn)行修飾來提高其穩(wěn)定性方面，將天然的hCu，Zn-SOD的Cy^和、或Cysm改變?yōu)槠渌陌被釟埢赡茉黾铀姆€(wěn)定性，而事實也證明了這一點。如Kanematsu將rhCu，Zn-SOD中的Cys6改為Ala6，該突變基因在大腸桿菌中表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后鑒定，與天然的hCu,Zn-SOD6相比活性是一致的，而且Tm值提高了l(TC。施惠娟等在此基礎(chǔ)上將hCu，Zn-SOD的Cys6改為Ala6，并在細(xì)胞中得到表達(dá)的突變hCu,Zn-SOD，其SOD酶活性較穩(wěn)定。周贊虎等通過將hCu，Zn-SOD基因中非活性中心第111位活躍的Cys轉(zhuǎn)換成相對惰性的Ala,在無毒的聚球藻中表達(dá)改良后的hCu,Zn-SOD，表達(dá)量為占藻體可溶性蛋白的3.61%，具有相應(yīng)酶活，且比天然hCu，Zn-SOD的熱穩(wěn)定性有了一定的提高。在利用不同的表達(dá)系統(tǒng)來提高其產(chǎn)量方面，Hallewell等人報道hCu,Zn-SOD的cDNA的核苷酸序列，并使其在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，表達(dá)的蛋白可溶性為5%;他們還研究了hCu,Zn-SOD基因在酵母菌中的表達(dá)，其產(chǎn)生的hCu,Zn-SOD是可溶的，具正常的酶比活。趙敏順等人工合成了Cu,Zn-SOD基因，并在五.co//中進(jìn)行了有效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的13%。醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所和海軍總醫(yī)院分子生物學(xué)研究室將hCu，Zn-SOD在基因克隆到大腸桿菌中，表達(dá)率高達(dá)50%。施惠娟等以RT-PCR法獲得hCu,Zn-SOD并使之表達(dá)，分別獲得了38%和50%的高表達(dá)率且表達(dá)的蛋白具有SOD有酶活性。對hCu，Zn-SOD進(jìn)行重組就是為了獲得高表達(dá)的活性蛋白，克服傳統(tǒng)工藝的缺陷，因此在表達(dá)成功的基礎(chǔ)上，表達(dá)的活性蛋白占總蛋白的比例對重組方案的影響是很重要的。而以上所述的對hCu,Zn-SOD進(jìn)行修飾或者選擇不同的表達(dá)載體，雖然獲得具有活性的重組蛋白，但是最終所獲得的活性蛋白的產(chǎn)量不高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題在于利用基因工程方法獲得具有生物活性的rhCu,Zn-SOD蛋白，提高活性蛋白的產(chǎn)量；同時提供活性蛋白的制備純化工藝，降低生產(chǎn)成本，為rhCu，Zn-SOD的廣泛應(yīng)用和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種提高重組人Cu，Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，對編碼人Cu，Zn-SOD蛋白的基因序列進(jìn)行定點突變，構(gòu)建人Cu,Zn-SOD重組表達(dá)載體以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，提高其所表達(dá)的可溶性重組蛋白的比例；所述的定點突變?yōu)槿薈u，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸殘基定點突變?yōu)橛H水性氨基酸殘基。所述人Cu，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸殘基均定點突變?yōu)榻z氨酸殘基；所述構(gòu)建人Cu,Zn-SOD重組表達(dá)載體所引入的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。上述的提高重組人Cu,Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，包括以下步驟a、通過基因定點突變，將編碼rhCu,Zn-SOD蛋白111位和6位的Cys殘基突變?yōu)镾er殘基首先構(gòu)建rhCu,Zn-SOD第111位突變體rhCu,Zn-SODCys6'se出i，在突變體rhCu,Zn-SODCys6'se"n的基礎(chǔ)上構(gòu)建rhCu,Zn-SOD第6、111位突變體rhCu,Zn-SODS^Se"u;根據(jù)上述突變位點，設(shè)計了5條引物，分別為Pl:gtacatatggcgacgaaggccgtgtg26P2:gtacatatggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaag36P3:cgagtcgacttattgggcgatcccaattac30P4:aatgatggaatggtctcctgagagcgag28P5:gaccattccatcattggccgcacactg27其中，Pl和P2含有NdeI的酶切位點，P3含有終止密碼子和SalI的酶切位點；分別以P1、P4和P3、P5為前后引物對，人Cu,Zn-SOD基因為模板，進(jìn)行兩次PCR，所得產(chǎn)物互為模板和引物進(jìn)行第三次PCR，最后再以P1、P3為前后引物對，第三次PCR定點突變所得產(chǎn)物為模板進(jìn)行第四次PCR，最終獲得111位的Cys突變?yōu)镾er的突變體基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；以P2、P3為前后引物對，SEQIDNO.l所示的基因序列為模板進(jìn)行PCR，獲得第6位、111位的Cys突變?yōu)镾er的突變體基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；b、通過NdeI的酶切位點、SalI酶切位點分別將上述兩種突變體基因克隆入原核表達(dá)載體pET22b中構(gòu)建表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒，經(jīng)SalI和NdeI雙酶切鑒定確認(rèn)插入片段；c、挑取重組單菌落接種于10mL含Ampl00mg/mL的LB培養(yǎng)液中，37r搖床培養(yǎng)過夜，次日以1:100的比例轉(zhuǎn)接到含AmplOOmg/mL的LB培養(yǎng)液中，在37"搖床培養(yǎng)3.5h至對數(shù)生長中期，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集菌體；d、收集的菌體裂菌并離心后，上清加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30。/。的(NH02SO4沉淀，再加入硫酸銅至終濃度為lmmoL/L，然后透析至O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl緩沖液中，過DEAE柱進(jìn)行純化，采用含0.2MNaCl的O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。本發(fā)明有益的技術(shù)效果本發(fā)明將天然hCu,Zn-SOD的基因序列插入到pET22b原核表達(dá)載體中，構(gòu)建天然hCu，Zn-SOD的重組表達(dá)載體；另外以天然hCu，Zn-SOD的基因序列為模板，對hCu,Zn-SOD做定點突變，構(gòu)建突變的hCu,Zn-SOD重組表達(dá)載體。上述表達(dá)載體不僅可以在BL21(DE3)中高效表達(dá)，而且與未突變體比較，突變體在總體表達(dá)量不變的情況下(占菌體蛋白總量的50%)，裂菌上清中的重組蛋白占重組蛋白總體表達(dá)的比例由40%提高到80%，并且從上清中純化的突變體rhCu，Zn-SOD的比活性與上清中純化的未突變rhCu,Zn-SOD的相當(dāng)。比較從上清中純化的rhCu,Zn-SOD和從沉淀中純化的rhCu,Zn-SOD的比活性，發(fā)現(xiàn)從上清中純化的rhCu，Zn-SOD的比活性為從沉淀中純化的rhCu,Zn-SOD的45倍，因此增加rhCu，Zn-SOD蛋白在裂菌上清中的表達(dá)比例可以大幅提高rhCu,Zn-SOD的活性產(chǎn)量。確定的上清表達(dá)量大量增加的rhCu,Zn-SOD突變體的氨基酸序列通式為hCu,Zn-SOD天然氨基酸序列的6位、111位的半胱氨酸突變絲氨酸，或者6位、lll位的半胱氨酸突變?yōu)槠渌H水性氨基酸。其中6位、111位雙突變?yōu)橛H水性絲氨酸使得裂菌上清中的重組蛋白占重組蛋白總體表達(dá)的比例由40%提高到80%，并且從上清中純化的突變體rhCu,Zn-SOD的比活性與上清中純化的未突變rhCu,Zn-SOD的相當(dāng)。另一方面，本發(fā)明提供的制備純化工藝，不但使發(fā)酵后得到的活性蛋白量產(chǎn)量增加，而且使下游的純化工藝大大簡化，有效地降低了rhCu,Zn-SOD生產(chǎn)成本，提高了其產(chǎn)量，為rhCu，Zn-SOD的廣泛應(yīng)用和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。圖l是三種rhCu,Zn-SOD突變體表達(dá)載體的雙酶切鑒定結(jié)果其中，泳道1為DL2000;泳道2為pET22b-rhSOD雙酶切；泳道3為pET22b-rhSODGys6'Serlll雙酶切；泳道4為pET22b-rilSOD雙酶切；泳道5為對照載體。圖2是rhCu,Zn-SOD突變體和rhCu,Zn-SOD的誘導(dǎo)表達(dá)SDS凝膠電泳鑒定結(jié)果其中泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為pET22b-rhSOD/BL21未誘導(dǎo)；泳道3為pET22b-rhSOD/BL21IPTG誘導(dǎo)；泳道4為pET22b-rhSOD6'm/BL21IPTG誘導(dǎo)。圖3是rhCu-ZnSOD突變體和rhCu-ZnSOD的WesternBlot鑒定結(jié)果其中，泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為pET22b-rhSOD/BL21未誘導(dǎo)；泳道3為pET22b-rhSOD/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；泳道4pET22b-rhSOD6'm/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)。圖4是rhCu,Zn-SOD突變體和rhCu，Zn-SOD裂菌沉淀蛋白SDS凝膠電泳結(jié)果泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為誘導(dǎo)pET22b-rhSOD/BL21裂菌沉淀；泳道3為誘導(dǎo)pET22b-rhSOD6'm/BL21裂菌沉淀。圖5是rhCu,Zn-SOD突變體和rhCu，Zn-SOD裂菌上清蛋白SDS凝膠電泳結(jié)果泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為誘導(dǎo)pET22b-rhSOD/BL21裂菌上清；泳道3為誘導(dǎo)pET22b-rhSOD6'm/BL21裂菌上清。圖6是rhCu,Zn-SOD和rhCu,Zn-SOD6，111純化結(jié)果的鑒定泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為rhCu,Zn-SOD6'111純化結(jié)果；泳道3為rhCu,Zn-SOD純化結(jié)果。具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。為了解決利用基因工程獲得具有生物活性的rhCu，Zn-SOD蛋白，提高活性蛋白的產(chǎn)量，本發(fā)明采用的方案是提高可溶性蛋白占總蛋白的比例，通過以下方案來實施1、首先確定增加rhCu，Zn-SOD在裂菌上清中的比例可以大幅提高rhCu，Zn-SOD的活性產(chǎn)量。將hCu,Zn-SOD基因克隆入原核表達(dá)載體pET22b中，經(jīng)誘導(dǎo)后使其在大腸桿菌中得到有效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總量的50%左右。經(jīng)過溶菌酶裂菌，目的蛋白在裂菌上清中的比例約占總目的蛋白量的40%，在裂菌沉淀中的比例約占總目的蛋白量的60%。同時從上清和沉淀中進(jìn)行純化，均獲得純度大于90%的rhCu,Zn-SOD。活性測定結(jié)果顯示，從上清中純化的rhCu,Zn-SOD的比活性為13000U/mg，從沉淀中純化rhCu，Zn-SOD的比活性為3200U/mg，ii從裂菌上清中純化的目的蛋白的比活性是從裂菌沉淀中純化的目的蛋白的比活性的4倍。也就是說在表達(dá)相同量的重組蛋白情況下，與沉淀的重組蛋白相比，可溶性的重組蛋白中活性蛋白所占的比例高。所以提高rhCu,Zn-SOD在菌體表達(dá)上清(可溶性)中的比例能夠大大提高rhCu,Zn-SOD的活性產(chǎn)量。2、通過對rhCn,Zn-SOD和其突變體可溶性目的蛋白占目的蛋白表達(dá)總量的比例比較分析，確定了上清表達(dá)量大量增加的rhCu，Zn-SOD突變體的氨基酸序列通式為hCu，Zn-SOD天然氨基酸序列的6位、111位的半胱氨酸突變?yōu)橛H水性氨基酸絲氨酸，或6位、111位的半胱氨酸突變?yōu)槠渌H水性氨基酸。采用點突變技術(shù)對hCu,Zn-SOD的6位和111位半胱氨酸進(jìn)行定點突變?yōu)橛H水的絲氨酸殘基，獲得lll位突變變體(命名為rhCu,Zn-SOD111)，6位和111雙突變體(命名為rhCu，Zn-SOD6.川)系列基因；將rhCu,Zn-SOD、rhCu，Zn-SOD6'111基因插入pET22b原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使其高效表達(dá)。對表達(dá)菌體裂菌上清中目的蛋白比例進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)6位、111位突變?yōu)榻z氨酸可以大幅提高目的產(chǎn)物在裂菌上清中的比例，而且與未突變體比較，在重組蛋白總體表達(dá)量不變的情況下(占菌體蛋白總量的50%)，6位、111位雙突變把裂菌上清的重組蛋白占重組蛋白總體表達(dá)的比例由40%提高到80%，并且從上清中純化的rhCu,Zn-SOD突變體的比活性與從上清中純化的未突變rhCu/Zn-SOD的相當(dāng)。分析上述結(jié)果得出使rhCu，Zn-SOD表達(dá)在上清中比例提高、活性蛋白總產(chǎn)量提高的突變體通式為hCu,Zn-SOD天然氨基酸序列的6位、111位的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸殘基；由于第6位、111位半胱氨酸的絲氨酸突變并沒有引起重組蛋白活性的變化，說明第6位、111位并不是影響hCu,Zn-SOD的關(guān)鍵位點；鑒于為了提高重組蛋白的可溶性，推定當(dāng)?shù)?位、111位的半胱氨酸突變?yōu)槠渌H水性氨基酸殘基同樣能夠?qū)崿F(xiàn)相同的技術(shù)效果。3、用基因工程方法對上述的rhCu,Zn-SOD突變體進(jìn)行了高效表達(dá)，并進(jìn)行了鑒定、純化和活性檢測，獲得了高溶解性、高活性產(chǎn)量的rhCu/Zn-SOD突變體的制備工藝。下面對上述的實施方案做詳細(xì)說明(DhCu,Zn-SOD基因的獲取按照基因Bank中天然hCu，Zn-SOD的基因序列，進(jìn)行全基因合成，其基因序列如下atggcgacg3aggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcatcatcaat60ttcgagcag33gg333gt33tgg3CC3gtgaaggtgtgggg33gC3tta33gg3Ctg3Ct120gaaggcctgcatggattccatgttcatgagtttgg3g3t33teicagcaggctgtaccagt180gcaggtcctcactttaatcctctatccagaaaacacggtgggCC肪3gg3tg卿卿gg240catgttggagacttgggcaatgtgactgctgacaaagatggtgtggccgatgtgtctatt300gaagattctgtgatctcgctctcaggagaccattgcatcattggccgcacactggtggtc360catgaaaaagcagatgacttgggcaiaaggtgga肪tgaaggacgggaaac420gctggaagtcgtttggcttgtggtgtaattgggatcgccc465②rhCu，Zn-SOD及其突變體的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建通過將hCu，Zn-SOD第6位、111位的Cys突變?yōu)镾er，構(gòu)建hCu,Zn-SOD的突變體，突變位點分別為(Cys6，Serlll)和(Ser6，Serlll)。根據(jù)上述突變位點，設(shè)計了5條引物，分別為Pl:gtacatatggcgacgaaggccgtgtg26P2:gtacatatggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaag36P3-cgagtcgacttattgggcgatcccaattac30P4:aatgatggaatggtctcctgagagcgag28P5:gaccattccatcattggccgcacactg27其中，Pl和P2含有NdeI的酶切位點，P3含有終止密碼子和SalI的酶切位點。以上引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。分別以P1、P4和P3、P5為前后引物對，rhCu,Zn-SOD基因為模板，進(jìn)行兩次PCR，所得產(chǎn)物互為模板和引物進(jìn)行第三次PCR。最后再以P1、P3為前后引物對，第三次PCR所得產(chǎn)物為模板進(jìn)行第四次PCR，獲得rhOi,Zii-SODeys6'Seml突變體基因。其四次PCR反應(yīng)條件分別為<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>分別得到大小為300bp(產(chǎn)物A)、lOObp(產(chǎn)物B)左右的目的條帶；以其互為模板和引物進(jìn)行第三次PCR反應(yīng)，其PCR反應(yīng)條件為C.2XTaqPC腹asterMix1OjxL產(chǎn)物AlfxL產(chǎn)物BlpLddH208pL94。C5min—94。C50s--61°Clmin-10個循環(huán)20|uL-72。Clmhr-72°ClOmin——4。CD.得到產(chǎn)物C，以其為模板進(jìn)行第四次PCR反應(yīng)'2XPremixTaq10引物Pl0.5pL引物P30.5fiL產(chǎn)物Cl|uLddH2Q94。C5min——94°C30s——62°C50s_20|liL-72°Clmin-畫72。ClOmin——4°C30個循環(huán)通過上述四次PCR反應(yīng)，獲得rhCu，Zn-SODc^'s"m突變體基因，其基因序列如SEQIDNO.l所示。以P2、P3為前后引物對，hCu,Zn-SODCys6'Sed11基因為模板進(jìn)行PCR定點突變，獲得hCu,Zn-SODSer6'Sef111突變體基因。其PCR反應(yīng)條件為2XTaqPCRMasterMix1OfiL引物P20.5|iL引物P30.5nLpET22b-rhCu,Zn-SODSct6'Sef1111pLddH208pL20(iL94°C5min——94°C30s——58。C30s——72°Clmin——72°ClOmin——4°C_35個循環(huán)_所得hCu,Zn-SODSw6，s"m基因序列如SEQIDNO.2所示。通過NdeI的酶切位點、SalI酶切位點分別將hCu，Zn-SOD及2種突變體基因克隆入原核表達(dá)載體pET22b中，將上述重組載體分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒，經(jīng)SalI和NdeI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖1所示，對照泳道1和5，泳道2、3、4經(jīng)酶切鑒定都獲得預(yù)期460bp大小的插入片段，說明上述載體構(gòu)建并轉(zhuǎn)化成功。對引入pET22b的hCu，Zn-SOD及其突變體分別進(jìn)行測序，引入的hCu,Zn-SOD與天然hCu,Zn-SOD的基因序列相同，2個突變體(Cys6，Ser111)和(Ser6，Serlll)的基因序列分別如SEQIDNO.l、SEQIDNO.2所示。其突變位點分別為111位單點、6位和111位雙點。將hCu,Zn-SOD及其2個突變體(Cys6，Serlll)和(Ser6，Serlll)的重組質(zhì)粒分別命名為pET22b-rhSOD、pET22b-rhSODSw6'Cys111、和pET22b-rhSODSer6'Serlll。hCu,Zn-SOD和其突變體(Ser6，Serlll)所得工程菌分別命名為pET22b-rhSOD/BL21、pET22b-rhSOD6，m/BL21。③rhCu,Zn-SOD及其突變體的表達(dá)16挑取riiCu，Zn-SOD和其突變體工程菌的單菌落接種于10mL含100mg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB的培養(yǎng)液中，37""C搖床培養(yǎng)過夜，次日以l:lOO的比例轉(zhuǎn)接到含Amp的LB培養(yǎng)液中，37。C搖床培養(yǎng)3.5h至對數(shù)生長中期(OD6o。為0.40.6)，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集菌體。④表達(dá)產(chǎn)物的鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)取少許菌體加入50nL水和50^iL2x載樣緩沖液，混勻。沸水中煮5min，12000rpm離心5min，取4.5pL上清加樣于15°/。分離膠6%濃縮膠，電壓160V，電泳lh。用0.5。/。考馬斯亮蘭R-250振蕩染色lh，脫色直至背景清晰后制備干膠保存。結(jié)果如圖2所示，泳道3、4在20.1KD附近有新生電泳條帶，上述菌體的表達(dá)載體均得到表達(dá)。凝膠掃描分析表達(dá)量，結(jié)果顯示rhCu，Zn-SOD、rhCu，Zn-SOD6'111總體表達(dá)量占菌體蛋白總量的50%。免疫印跡反應(yīng)SDS-PAGE結(jié)束后，按Bio-Rad產(chǎn)品說明，凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維膜(NC膜)靠近陽極一側(cè)，置轉(zhuǎn)移緩沖液中(25mmol/LTris、192mmol/LGlycine、20%甲醇)，100V恒壓lh，將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至NC膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，用洗滌液TBST(含0.02mol/LpH7.4TBS、0.4%Tween20)室溫洗3次，浸入封閉液(含2%BSA的TBST)中37。C條件下1h，洗滌液(TBST)室溫洗3次，加小鼠抗人SOD單克隆抗體，37'C孵育1h，TBST室溫洗膜3次，加入羊抗小鼠IgG-AP二抗，37。C孵育lh，TBST室溫洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)后的蛋白(泳道3、4)均可以特異性的與小鼠抗人SOD單克隆抗體特異性結(jié)合，且顯色條帶位置與預(yù)期結(jié)果相符，說明rhCu,Zn-SOD及其突變體經(jīng)誘導(dǎo)后得到表達(dá)。表達(dá)菌體的裂解及表達(dá)產(chǎn)物結(jié)果分析取rhCu,Zn-SOD及其突變體的發(fā)酵菌體各1克加入到10mL裂解Buffer中，4'C攪拌得到菌懸液，然后加入0.5mg溶菌酶；4'C攪拌20分鐘，加入7mg脫氧膽酸鈉，室溫攪拌至粘稠，加入MgCl2至終濃度為10mmoL/L，加入DNasel5(iL,攪拌至不粘稠。取50pL裂菌后的溶液，4°C，15,000rpm離心30min，吸出上清加入50pL2x載樣緩沖液，混勻；裂菌沉淀樣品加入50pL水，混懸后再加入50|iL2x載樣緩沖液混勻。沸水中煮5min，12000rpm離心5min。制得的樣品取4.5pL上清進(jìn)行SDS-PAGE。用0.5%考馬斯亮蘭R-250振蕩染色1h，脫色直至背景清晰后制備干膠，結(jié)果如圖4、圖5所示；目的蛋白rhCu,Zn-SOD在裂菌上清和沉淀中均有分布。凝膠掃描分析rhCu，Zn-SOD及其突變體裂菌上清和沉淀中目的蛋白的比例。結(jié)果顯示rhCu,Zn-SOD在裂菌上清中的比例為蛋白表達(dá)總量的40%，rhCu，Zn-SOD6'111在裂菌上清中的比例為蛋白表達(dá)總量的80%。rhCu,Zn-SOD蛋白的純化同時從上清和沉淀中進(jìn)行純化，均獲得純度大于90%的rhCu,Zn-SOD?；钚詼y定結(jié)果顯示，從上清中純化的rhCu,Zn-SOD的比活性為13000U/mg，從沉淀中純化rhCu,Zn-SOD的比活性為3200U/mg，從裂菌上清中純化的目的蛋白的比活性是從裂菌沉淀中純化的目的蛋白的比活性的4倍。rhCu,Zn-SOD和rhCu,Zn-SOD6'111的裂菌上清分別經(jīng)30%硫酸銨沉淀后，加入硫酸銅至終濃度lmmoL/L，然后透析至O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl緩沖液中，過DEAE柱進(jìn)行純化，采用0.2MNaCl，0.01MpH8.0Tris-Hcl洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。對純化的rhCu，Zn-SOD進(jìn)行SDS-PAGE和比活性測定。SDS-PAGE結(jié)果如圖6所示，泳道2、3所示的目的蛋白峰處于20.1KD附近，與預(yù)期結(jié)果相符。⑦rhCu,Zn-SOD及其不同突變體的活力測定根據(jù)GB/T5009.171-2003，采用修改的Marklund方法進(jìn)行純化的rhCu，Zn-SOD及rhCu，Zn-SOD6，111的活力測定。試劑-A液pH8.2，O.lmoL/LTris-HCl(含lmmoL/LEDTA2Na)。稱取1.2114gTris和37.2mgEDTA2Na，溶于62.4mLO.lmoL/LHC1溶液中，蒸餾水定容至100mL;B液4.5mmoL/L鄰苯三酚溶液。稱取鄰苯三酚(AR)56.7mg先溶于10mmoL/L鹽酸溶液中，再用其定容至100mL。方法a.在25。C左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸餾水2.00mL，B液0.15mL，加入B液后立即混勻，開始計時，lmin后于325nm處測定鄰苯三酚的自氧化速率吸光值；b.在25T左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸餾水1.8mL，待測SOD溶液20uL，B液0.15mL，加入B液后立即混勻，開始計時，lmin后于325nm處測定樣品的吸光值，取吸光值約為鄰苯三酚的自氧化速率的1/2的值為樣品測定值代入下式進(jìn)行計算-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中U/mL—SOD酶活力單位△A325—鄰苯三酚自氧化速率△A'325—SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率V—SOD酶液體積(mL)D~SOD酶液的稀釋倍數(shù)4.5—反應(yīng)總體積(mL)計算結(jié)果為rhCu,Zn-SOD活力(U/mL)=4000U/mLrhCu，Zn-SOD6'111活力(U/mL)=11000U/mL比活性計算染料法(楊安鋼等，《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)》，高等教育出版社)檢測純化的目的蛋白的蛋白濃度，用測定的活力和蛋白濃度計算rhCu,Zn-SOD及rhCu,Zn-SOD6，111的比活性。試劑考馬斯亮藍(lán)染液稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250溶解于95。/。乙醇中，加入100mL85。/。磷酸，加水稀釋至1000mL。方法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制在試管中分別加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的0.1mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(購自西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司)，用水補足到1.0mL，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻后室溫放置5min，在595nm處比色測定，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0272x+0.1221(其中y為樣品在595nm處的吸光度，x為蛋白含量ug);在試管中分別加入待測酶液0.8mL，用水補足到1.0mL，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻后室溫放置5min，在595nm處比色測定吸光值，計算蛋白濃度和蛋白比活性。具體結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結(jié)果顯示從上清中純化獲得的rhCu,Zn-SOD6'111的活力是rhCu,Zn-SOD的3.2倍。從rhCU,Zn-SOD6'111突變體上清中獲得的目的蛋白的總活力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未突變的rhCu,Zn-SOD。核苷酸序列表<110>陜西省微生物研究所〈12O—種提高重組人Cu，Zn-S0D活性蛋白產(chǎn)量的方法<160>2<210>1<211>465<212>DNA<213>人工合成<400>1atggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggCEitcatcaat60ttcgagcagatggaccagtga郷tgtggggaagcattaaaggactgact120gaaggcctgcatggattccatgttcatgagtttgg3g3t3atacagcaggctgtaccagt180gcaggtcctcactttaatcctctatccagaaaacacggtgggccaemggatga卿gagg240catgttggagacttgggcaatgtgactgctgacaaagatggtgtggccgatgtgtctatt300gaag3ttctgtgatctcgctCtC3gg3g3Ccattccatcattggccgcacactggtggtc360cagatgacttgggcaeiaggtggaaatgaag3肪gt3c犯agscgggaa^c420gctgg卿tcgtttggcttgtggtgtaattgggatcgccc465<210>2<211>465<212>DNA<213>人工合成<400>2atggcgacgaaggccgtgagcgtgctg肪gggcgacggcccagtgcagggcatcatcaat60ttcg3gc恥33gg朋agt幼tggaccagtgaaggtgtggggaagcattaaaggactgact120gaaggcctgcatggattccatgttcatgagtttggagataatacsgcaggctgtaccagt18022gcaggtcctcactttaatcctctatccagaaaacacggtgggccaaaggatgaagagagg240catgttggagacttgggcaatgtgactgctgacaaagatggtgtggccgatgtgtctatt300ga卿ttctgtgatctcgctctcaggagaccattccatcattggccgcacactggtggtc360catgaaaaagcagatgacttgggcaaaggtggaaatgaagaaagtacaaagacgggaaac420gctggaagtcgtttggcttgtggtgtaattgggatcgcccaataa46權(quán)利要求1、一種提高重組人Cu，Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于，對編碼人Cu，Zn-SOD蛋白的基因序列進(jìn)行定點突變，構(gòu)建人Cu，Zn-SOD重組表達(dá)載體以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，提高其所表達(dá)的可溶性重組蛋白的比例；所述的定點突變?yōu)槿薈u，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸殘基定點突變?yōu)橛H水性氨基酸殘基。2、如權(quán)利要求1所述的提高重組人Cu，Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于，人Cu,Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸殘基均定點突變?yōu)榻z氨酸殘基。3、如權(quán)利要求2所述的提高重組人Cu,Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于，構(gòu)建人Cu，Zn-SOD重組表達(dá)載體所引入的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。4、如權(quán)利要求2所述的提高重組人Cu,Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟a、通過基因定點突變，將編碼rhCu，Zn-SOD蛋白111位和6位的Cys殘基突變?yōu)镾er殘基首先構(gòu)建rhCu，Zn-SOD第111位突變體rhCu，Zn-SODCys6's"m，在突變體rhCu,Zn-SODCys6'^"的基礎(chǔ)上構(gòu)建rhCu,Zn-SOD第6、111位突變體rhCu，Zn-SODS^se"u;根據(jù)上述突變位點，設(shè)計了5條引物，分別為Phgtacatatggcgacgaaggccgtgtg26P2:gtacatatggcgacgaaggccgtgagcgtgctgaag36P3:cgagtcgacttattgggcgatcccaattac30P4:aatgatggaatggtctcctgagagcgag28P5:gaccattccatcattggccgcacactg27其中，Pl和P2含有NdeI的酶切位點，P3含有終止密碼子和SalI的酶切位點；分別以Pl、P4和P3、P5為前后引物對，人Cu,Zn-SOD基因為模板，進(jìn)行兩次PCR，所得產(chǎn)物互為模板和引物進(jìn)行第三次PCR，最后再以P1、P3為前后引物對，第三次PCR定點突變所得產(chǎn)物為模板進(jìn)行第四次PCR，最終獲得111位的Cys突變?yōu)镾er的突變體基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；以P2、P3為前后引物對，SEQIDNO.l所示的基因序列為模板進(jìn)行PCR，獲得第6位、111位的Cys突變?yōu)镾er的突變體基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；b、通過NdeI的酶切位點、SalI酶切位點分別將上述兩種突變體基因克隆入原核表達(dá)載體pET22b中構(gòu)建表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒，經(jīng)SalI和NdeI雙酶切鑒定確認(rèn)插入片段；c、挑取重組單菌落接種于10mL含Ampl00mg/mL的LB培養(yǎng)液中，37。C搖床培養(yǎng)過夜，次日以l:100的比例轉(zhuǎn)接到含Ampl00mg/mL的LB培養(yǎng)液中，在37"C搖床培養(yǎng)3.5h至對數(shù)生長中期，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集菌體；d、收集的菌體裂菌并離心后，上清加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30。/。的(NH4)2SO4沉淀，再加入硫酸銅至終濃度為lmmoL/L，然后透析至O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl緩沖液中，過DEAE柱進(jìn)行純化，采用含0.2MNaCl的O.OIM、pH8.0的Tris-Hcl洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。全文摘要一種提高重組人Cu，Zn-SOD活性蛋白產(chǎn)量的方法，對編碼人Cu，Zn-SOD蛋白的基因序列進(jìn)行定點突變，構(gòu)建人Cu，Zn-SOD重組表達(dá)載體以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，提高其所表達(dá)的可溶性重組蛋白的比例；所述的定點突變?yōu)槿薈u，Zn-SOD蛋白的第6位和第111位半胱氨酸殘基定點突變?yōu)橛H水性氨基酸殘基。第6位、111位雙突變?yōu)橛H水性絲氨酸使得裂菌上清中的重組蛋白占重組蛋白總體表達(dá)的比例由40％提高到80％，并且從上清中純化的突變體rhCu，Zn-SOD的比活性與上清中純化的未突變rhCu，Zn-SOD的相當(dāng)。文檔編號C12N15/74GK101525600SQ20091002172公開日2009年9月9日申請日期2009年3月27日優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日發(fā)明者一萬,琨張,張月娟,琰王申請人:陜西省微生物研究所