專利名稱：：生成可灌注微血管系統(tǒng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于研究生理的和病理的血管生長(zhǎng)以及響應(yīng)促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生長(zhǎng)的方法。
背景技術(shù)：
：在正常的血管生長(zhǎng)的過(guò)程中(例如，月經(jīng)周期、胎盤形成、發(fā)胖、創(chuàng)傷愈合、炎癥)，新血管的生成是被調(diào)控的并最終停止。值得關(guān)注的是，血管生長(zhǎng)失去調(diào)控是病理學(xué)上的一個(gè)關(guān)鍵因素。例如，腫瘤的生長(zhǎng)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬涉及直接促成病理狀態(tài)的血管過(guò)度增殖。相反，作為老年個(gè)體的特征，血管生長(zhǎng)的削弱危害了創(chuàng)傷愈合以及由損傷或疾病導(dǎo)致的缺血組織的血管再生(revascularization)。因此，對(duì)指導(dǎo)組裝新血管的機(jī)制以及啟動(dòng)和終止血管生長(zhǎng)的過(guò)程的理解，是控制疾病中的血管形成的策略發(fā)展的核心。在新血管的生長(zhǎng)過(guò)程中(血管生成(angiogenesis))，萌芽(sprout)源自血管內(nèi)皮細(xì)胞，該血管內(nèi)皮細(xì)胞排列成毛細(xì)血管和后毛細(xì)血管(postcapillary)的內(nèi)腔(Iument)-血管系統(tǒng)的最小分枝。血管生成是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程。盡管公開了數(shù)以千計(jì)的關(guān)于血管生成的研究，但是，對(duì)介導(dǎo)和調(diào)控血管生成的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制了解甚少。由于大部分組織的不透明性，很難在體內(nèi)實(shí)時(shí)地觀察血管生成萌芽態(tài)的具體情況。很難在三維空間重建組織切片，且無(wú)法與血管生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)性質(zhì)相聯(lián)系。此外，很難在組織切片中發(fā)現(xiàn)接近血管生成萌芽的尖端的區(qū)域(控制血管侵入(vascularinvasion)和形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵區(qū)域)。為了克服傳統(tǒng)組織學(xué)的局限性，開發(fā)出了多種體內(nèi)的和體外的血管生成“模型”。體內(nèi)的血管牛成樽型為了克服活體組織的不誘明件，研究者通過(guò)活體動(dòng)物體內(nèi)的“窗口”或?qū)ｉT的觀察腔來(lái)觀察血管生成，所述動(dòng)物體內(nèi)的“窗口”包括兩棲類幼蟲的天然透明的尾(ClarkandClark1939)，所述專門的觀察腔可以植入到兔的耳朵(ClarkandClark1939)、小鼠的皮膚(Algire，Chalkleyetal，1945)和倉(cāng)鼠的頰囊(cheekpouches)(GreenblattandShubi1968)中，或者由兔角膜囊袋(Gimbrone，Cotranetal.1974)或雞胚絨毛尿囊膜(Ausprunk，Knightonetal.1974)發(fā)展而來(lái)。從這些早期的、大量描述性的研究中，得出了對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的血管化學(xué)趨向性的中心范例的驗(yàn)證，以及能促進(jìn)血管生長(zhǎng)的可擴(kuò)散的腫瘤衍生分子的相關(guān)發(fā)現(xiàn)。體內(nèi)血管生成的新實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了血管向聚合海綿體或皮下植入至嚙齒動(dòng)物的凝膠基底膜蛋白栓塞中的向內(nèi)生長(zhǎng)(PassanitiTayloretal.1992；Andrade,Machadoetal.1997；Akhtar,Dickersonetal.2002；Koike,Vernonetal.2003)0由于下述原因，體內(nèi)的方法難以實(shí)施(1)動(dòng)物之間血管生成反應(yīng)的種內(nèi)變異；(2)缺乏從一個(gè)物種到另一個(gè)物種的結(jié)果轉(zhuǎn)譯；(3)購(gòu)買和飼養(yǎng)動(dòng)物的花費(fèi)高；(4)公眾不贊成以研究為目的使用動(dòng)物；以及(5)在動(dòng)物手術(shù)和可視化方面以及結(jié)果的評(píng)估上遇到的復(fù)雜性。體外血管牛成的二維(2D)樽型在努力了解血管牛成的分子力學(xué)的過(guò)稈中,將從較大的血管中分離出的內(nèi)皮細(xì)胞置于平板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直至它們形成匯合的(confluent)、平鋪狀(pavement-like)的單細(xì)胞層，該單細(xì)胞層模擬了血管內(nèi)層(lining)內(nèi)皮細(xì)胞層(Jaffe，Nachmanetal.1973；Gimbronel976)。盡管可以用作在大血管中對(duì)內(nèi)皮損傷的增生性響應(yīng)的模型(Gimbrone，Cotranetal.1974；Fishman,Ryanetal.1975；MadriandStennl982；MadriandPratt1986；Jozaki,Maruchaetal.1990；Rosen,Meromskyetal.1990)，但是，在模擬血管生成的過(guò)程中，在剛性基質(zhì)上內(nèi)皮細(xì)胞的單層培養(yǎng)物并不典型地組織成毛細(xì)血管樣的管狀。然而，在1980年，在成功地長(zhǎng)期培養(yǎng)毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞后(F0lkman，Haudenschildetal1979)，據(jù)報(bào)道，培養(yǎng)?；蛉祟惷?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞20-40天后，在匯合的單層細(xì)胞的上部形成二維的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)過(guò)程被稱為“體外血管生成”(Folkmar^Haudenschildetal1980)。內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)為填充有纖維狀/無(wú)定形物質(zhì)的“管”和“內(nèi)腔”，所述纖維狀/無(wú)定形物質(zhì)被認(rèn)為是內(nèi)源合成的“軸芯”網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞在軸芯上組織起來(lái)。后續(xù)的研究報(bào)道了類似的二維網(wǎng)絡(luò)的形成，該二維網(wǎng)絡(luò)是由源自大血管的內(nèi)皮細(xì)胞(Maciag,Kadishetal.1982；Madri1982；Feder,Marasaetal.1983)和接種在基底膜蛋白的延展性水凝膠(例如Matrigelgel)頂部的內(nèi)皮細(xì)胞形成的(Kubota，Kleimanetal.1988)。盡管血管發(fā)育的二維模型仍沿用至今(基于Matrigel的測(cè)試(Kubota，Kleinmanetal.1988)是商業(yè)上可獲得的)，該模型不具備真正的血管生成的以下5個(gè)特點(diǎn)1、侵入(invasion)-二維模型中的內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的頂部形成網(wǎng)絡(luò)并顯示出很小的向下進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)的傾向(Vernon,Angeiloetal.1992，Vernon,Laraetal.1995)。2、方向性_在二維模型中，在體外形成的內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)或多或少會(huì)同時(shí)遍及預(yù)置細(xì)胞的區(qū)域，而體內(nèi)血管生成包括通過(guò)多級(jí)分枝使纖維狀萌芽分叉而向細(xì)胞外基質(zhì)的定向(vectorial)侵入。3、正確的極性-盡管二維模型使單細(xì)胞管與毛細(xì)血管非常類似(Maciag，Kadishetal.1982；Feder,Marasaetal.1983；SageandVernon1994)，但是，它們的極性是“由內(nèi)向外的”，即它們將基底膜物質(zhì)沉積在它們的內(nèi)腔表面，并且使它們的凝血酶原表面向外面向周圍的培養(yǎng)基(Maciag，Kadishetal.1982；Feder,Marasaetal.1983)，這與體內(nèi)的情形相反。4、內(nèi)腔形成-二維模型生成具有專屬內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)管的證據(jù)不足。通常，內(nèi)皮細(xì)胞管具有“內(nèi)腔”空間，該內(nèi)腔空間填充有細(xì)胞外基質(zhì)(外源的或由細(xì)胞合成的)(Maciag,Kadishetal.1982；Madri1982；Feder,Marasaetal.1983；SageandVernon1994；Vernon,Laraetal.1995)。存在專屬內(nèi)腔時(shí)，專屬內(nèi)腔通常以由內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的厚壁所分隔的縫隙狀或狹窄的圓柱形空間的形式出現(xiàn)-與體內(nèi)典型的毛細(xì)管的膨脹的、薄壁內(nèi)皮細(xì)胞管具有顯著的不同。5、細(xì)胞特性-二維模型中的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)通過(guò)機(jī)械過(guò)程生成，該機(jī)械過(guò)程可以由非內(nèi)皮細(xì)胞型來(lái)實(shí)現(xiàn)(Verrton，Angelloetal.1992；Vernon,Laraetal.1995)。當(dāng)然，數(shù)學(xué)建模顯示出，任何能夠使具有延展性的二維細(xì)胞外基質(zhì)(內(nèi)源合成的或提供的(例如Matrigel凝膠))具有張力的附著細(xì)胞型，均能在最佳條件下生成網(wǎng)絡(luò)(Manoussaki，Lubkinetal.1996)。體外血管牛成的三維(3D)樽型對(duì)三維細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)牛的體內(nèi)血管牛成的認(rèn)識(shí)已經(jīng)得出多種模型，其中，在體外的三維細(xì)胞外基質(zhì)凝膠中誘導(dǎo)萌芽。在早期的三維模型中，內(nèi)皮細(xì)胞分散于由芯和管的網(wǎng)絡(luò)(ElsdaleandBard1972)形成的膠原凝膠中(Montesano,Orcietal.1983)。盡管內(nèi)皮細(xì)胞管顯示出正確的極性，但是缺乏侵入和方向性的特性(內(nèi)皮細(xì)胞被預(yù)先植入并均勻地分散在細(xì)胞外基質(zhì)中)。雖然如此，已經(jīng)證明這個(gè)方法在研究?jī)?nèi)腔形成(DavisandCamarillo1998)和內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的響應(yīng)方面是有用的(Madri,Prattetal1988；Merwin.Andersonetal.1990；KuzuyaandKinsellal994；Marx,Perlmutteretal.1994；DavisandCamarillo1996)。在一個(gè)可選的方法中，將1毫米大鼠主動(dòng)脈切片(環(huán)狀)植入三維的血漿凝塊中會(huì)生成有分枝的吻合(anastomosing)管(Nicosia，Tchaoetal.1982)。源自動(dòng)脈環(huán)的萌芽顯示出類似于血管生成的侵入以及除了極性以外的方向性。利用源自大鼠的主動(dòng)脈環(huán)或源自小鼠的微血管片段的移植模型，已經(jīng)被用于研究腫瘤、生長(zhǎng)因子、多種細(xì)胞外基質(zhì)載體、和衰老的情況對(duì)血管生成的影響(Nicosia,Tchaoetal.1983；Mori,Sadahiraetal.1988；NicosiaandOttinetti1990；Nicosia,Bonannoetal.1992；VillaschiandNicosia1993；Nicosia,Bonannoetal.1994；Nicosia,Nicosiaetal,1994；NicosiaandTuszynski1994；Hoying.Boswelletal.1996；Arthur,Vernonetal.1998)。多種現(xiàn)存的模型誘導(dǎo)純化的內(nèi)皮細(xì)胞(單細(xì)胞層或聚集體)萌發(fā)侵入至三維細(xì)胞夕卜基質(zhì)疑膠的下面或周圍(MontesanoandOrci1985；Pepper,Montesanoetal.1991；Montesano,Pepperetal.1993；NehlsandDrenckhahnl995；NehlsandHerrmann1996；VernonandSage1999；VernonandGooden2002)。每一種模型都具有特殊的局限性，包括很難用肉眼觀察萌芽形成、受限制的萌芽、切片法(sectioning)的要求、或者缺乏特定類型的內(nèi)皮細(xì)胞的效力。Wolverine和Gulec公開了一種三維血管生成系統(tǒng)(US2002/0150879A1)，包括將腫瘤組織片段植入基質(zhì)中?？杀碚鞒鑫⒀艿南蛲馍L(zhǎng)以分析該組織的血管生成潛能。但是，這個(gè)方法不能提供微血管的內(nèi)腔灌注。Neumann(本發(fā)明人)等，在2003年公開了在體外包括在人工組織中生成可灌注的微血管是可能的。Neumann等人在2003年教導(dǎo)，使用127微米的尼龍釣魚線作為用于制造微血管的軸芯，該軸芯被收縮管材(shrinktubing)夾持。由植入到瓊脂中的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞制造血管。這些微血管具有試探性的性質(zhì)，并不適合于產(chǎn)生人類血管移植物。體外血管生長(zhǎng)的二維模型不能形成前述列出的血管生成的定義性特征，然而，現(xiàn)有的三維模型重建了其中一些或多數(shù)的特征。重要的是，現(xiàn)今的三維模型中沒(méi)有一個(gè)模型能重建包含有壓力的、流動(dòng)的、循環(huán)流體的親代血管。所以，現(xiàn)有的體外三維模型中沒(méi)有一個(gè)模型能夠進(jìn)行關(guān)于內(nèi)腔壓力和流動(dòng)對(duì)血管生長(zhǎng)和形態(tài)生成的貢獻(xiàn)方面的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種在體外生成可灌注微血管的方法。將軸芯從基質(zhì)中撤出，從而形成通過(guò)所述基質(zhì)的通道。將細(xì)胞注入到具有內(nèi)壁的所述通道中。培育所述基質(zhì)以使所述細(xì)胞附著到內(nèi)壁上。灌注所述通道以去除未附著的細(xì)胞，從而生成親代血管，其中該親代血管包括由所述基質(zhì)中的細(xì)胞襯里的(lined)可灌注的空通道。所述親代血管被誘導(dǎo)生成進(jìn)入周圍基質(zhì)凝膠的萌芽以便形成微血管網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)所述親代血管對(duì)所述微血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行內(nèi)腔灌注。本發(fā)明克服了現(xiàn)有血管生成模型的局限性，提供了通過(guò)將用于在三維細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中生成侵入的、管狀的微血管萌芽的已驗(yàn)證方法與用于構(gòu)建將成為內(nèi)腔流動(dòng)源頭的組織工程化親代血管的新方法相結(jié)合的方法和系統(tǒng)。通過(guò)灌注液，可以將調(diào)節(jié)血管生成的化合物施用于已知存在特定靶受體的內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)腔表面。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)腔流體的存在將會(huì)充分地增加體外毛細(xì)血管的存活時(shí)間。本發(fā)明的血管生成系統(tǒng)可用于評(píng)估多個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括缺氧/氧過(guò)量、特定的可溶性生物活性化合物的測(cè)試、基因修飾(geneticallymodified)的細(xì)胞的使用、以及經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的基因傳遞。該系統(tǒng)還可以用于研究與創(chuàng)傷修復(fù)、衰老、癌癥、和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的血管生成。重要的是，根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的模型可以適用于提供能夠整合到生物工程化人工組織中的功能齊全的血管系統(tǒng)。本發(fā)明也提供了新型的方法，包括用于生成微血管、從內(nèi)皮細(xì)胞生成微血管、以及生成較大血管(例如，具有冠狀動(dòng)脈大小的血管)的多支管設(shè)計(jì)。這些和其它重要的新教導(dǎo)包括，例如，一種生成微血管網(wǎng)絡(luò)的方法，該方法是以下述說(shuō)明書和權(quán)利要求書的描述為依據(jù)的。圖1A、圖IB和圖IC示意性地描述了親代血管生成的實(shí)例。圖2A、圖2B、圖2C和圖2D示意性地描述了已知的熱收縮過(guò)程的實(shí)例。圖3A示意性地描述了已知的安裝(mounting)培養(yǎng)/灌注設(shè)備的設(shè)計(jì)圖。圖3B示意性地描述了安裝培養(yǎng)/灌注設(shè)備的制備方法所用的設(shè)計(jì)圖。圖4A和圖4B示意性地描述了培養(yǎng)/灌注設(shè)備的多支管的制造。圖5A、圖5B和圖5C示意性地描述了微裝配(microfabricated)的培養(yǎng)/灌注設(shè)備的可選設(shè)計(jì)圖。圖6示意性地描述了細(xì)胞接種程序。圖7示意性地描述了兩個(gè)生物人工親代血管之間的毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)。圖8a描述了在體外接種平滑肌細(xì)胞后的多個(gè)軸芯的圖例。圖8b描述了灌注的肌板(muscleplate)的實(shí)例。圖9示意性地描述了CPD的可選實(shí)施方式。圖10描述了單個(gè)親代血管生長(zhǎng)萌發(fā)而進(jìn)入周圍基質(zhì)。圖11描述了一個(gè)親代血管通過(guò)萌芽網(wǎng)絡(luò)與第二親代血管相接。圖12描述了通過(guò)將細(xì)胞接種至膠原基質(zhì)的通道中生成親代細(xì)胞的可選方法。具體實(shí)施例方式本文列出實(shí)施例的目的是為了進(jìn)一步了解本發(fā)明。這些實(shí)施例是示例性的，本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)例性的實(shí)施方式。本發(fā)明的方法可以用于研究生理學(xué)和病理學(xué)的血管生長(zhǎng)和響應(yīng)促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生長(zhǎng)。其它有益的應(yīng)用是評(píng)估癌組織血管生成的可能和對(duì)抗血管生成藥物的響應(yīng)的方法。此外，本發(fā)明的方法可用于構(gòu)建多種創(chuàng)傷愈合設(shè)備以及用于組織工程化構(gòu)建的血管形成。在一個(gè)實(shí)施例中，公開了一種用于生成可灌注的三維微血管網(wǎng)絡(luò)的方法和設(shè)備。此處所用的“EC”指內(nèi)皮細(xì)胞，“SME”指平滑肌細(xì)胞，以及“CAS”指冠狀動(dòng)脈替代物。一般來(lái)說(shuō)，用于培養(yǎng)和灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的設(shè)備由可在中心處容有一個(gè)或多個(gè)軸芯的腔室構(gòu)成(最好如圖1所示)。該腔室能夠通過(guò)使用許多技術(shù)由任何生物相容性的材料制得，例如，通過(guò)使激光切割的框架形成夾層。以可收回的(retractable)方式將軸芯裝在腔室中。這可以通過(guò)將軸芯的端部固定在管中來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)熱收縮(如圖2所示)。所述軸芯的直徑取決于期望的血管管徑?？筛淖?cè)O(shè)置以適應(yīng)單個(gè)血管、兩個(gè)血管、或直至二維或三維中的整體血管陣列(arrays)。軸芯可以是多種材料，例如，聚合纖維、玻璃纖維、線材等。通過(guò)將細(xì)胞接種在軸芯上，刺激細(xì)胞在所述軸芯周圍增殖，當(dāng)細(xì)胞形成管壁后取出所述軸芯，從而生成微血管。隨后將血管植入基質(zhì)中。依賴于培養(yǎng)的條件、基質(zhì)的組成、以及血管生成刺激的存在(例如，生長(zhǎng)因子)，親代血管將形成萌芽而進(jìn)入周圍的基質(zhì)中。所述萌芽將會(huì)相互連接而形成毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。在除去所述軸芯后，將設(shè)備連接到灌注系統(tǒng)上，向血管中注入內(nèi)腔液體流。現(xiàn)在參考圖1A、圖IB和圖1C，圖中描述了生成親代血管的示意性實(shí)例。圖IA顯示了在生長(zhǎng)培養(yǎng)基100中的內(nèi)皮細(xì)胞1，被接種在軸芯2上，軸芯2由設(shè)備主體3中的收縮管4支撐。圖IB顯示了所述細(xì)胞1增殖并形成細(xì)胞套筒(sleeve)102形式的環(huán)狀層。圖IC顯示了在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠110中取出軸芯2后，所述細(xì)胞套筒被灌注生長(zhǎng)培養(yǎng)基100。本發(fā)明公開的方法包括對(duì)用于組織工程化應(yīng)用和研究模型的可灌注生物人工血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行工程化。公開的方法的基本原理包括培養(yǎng)細(xì)胞而在被緊固在薄壁管或其它固定物上的可去除軸芯的周圍環(huán)繞細(xì)胞層。一旦細(xì)胞層達(dá)到期望的壁厚度，即取出軸芯，并在灌注系統(tǒng)的幫助下向由此生成的生物人工血管(BAVs)中灌注培養(yǎng)基、血液、血液替代物、或其它流體。公開的方法可以用于生產(chǎn)大量制造的或常規(guī)生成的血管、體外灌注的血管生成模型、創(chuàng)傷愈合設(shè)備、組織成分、整個(gè)組織和器官、以及研究模型。培養(yǎng)/灌注設(shè)備的制造現(xiàn)在參考圖2A、圖2B、圖2C和圖2D，圖中描述了已知的熱收縮過(guò)程的示意性實(shí)例。特別如圖2A所示，每個(gè)培養(yǎng)/灌注設(shè)備(CPD)可以包括一個(gè)或多個(gè)裝在支撐框架12內(nèi)的軸芯2。軸芯2的直徑為期望的血管口徑，軸芯2的末端與醫(yī)藥級(jí)收縮管片段4緊密配合。軸芯2可以包括生物相容性纖維(例如，聚合物纖維、玻璃纖維、線材、或等同物)，根據(jù)待模擬的血管尺寸，軸芯2的直徑可以為幾微米到幾毫米。在一個(gè)實(shí)施例中，采用含有光學(xué)纖維的微毛細(xì)管作為軸芯。更詳細(xì)的描述如圖2B所示，每個(gè)收縮管片段4的中間部位14在一個(gè)軸芯2的周圍熱收縮。隨后，特別如圖2C所示，軸芯2被收回(retracted)，并將管切斷。圖2D示出了重置軸芯以便將該軸芯的兩端封閉在正切斷并分離的收縮管片段4中之后的情況。可以使用多種材料和工藝構(gòu)建框架12?？梢愿淖?cè)O(shè)置以適應(yīng)單獨(dú)的生物人工血管或生物人工血管陣列。同樣地，通過(guò)將軸芯陣列分層放置，由血管網(wǎng)絡(luò)可以生成厚的、可灌注的組織。灌注腔室的制造現(xiàn)在參考圖3A，描述了已知的用于灌注多個(gè)軸芯/收縮管組件(assemblies)11的設(shè)置?？蚣?0可以方便地由聚碳酸酯或等同材料碾壓制成。分配腔室30可以包括在設(shè)計(jì)中，這樣可以允許同時(shí)灌注多個(gè)生物人工血管。包含軸芯2的一套線程(thread)的末端被收集(gathered)在硅管23中。聚酯膜框架的激光切割現(xiàn)在參考圖3B，示意性地描述了用于安裝培養(yǎng)/灌注設(shè)備的制造方法的新設(shè)計(jì)。單血管設(shè)計(jì)(CPD70)可以便利地通過(guò)將軸芯2夾在兩個(gè)激光切割的Mylar框架22之間而生成，所述軸芯2由熱收縮管4支撐。一個(gè)環(huán)狀的環(huán)氧多支管21可以方便地用于支撐軸芯/收縮管組件11，該多支管的構(gòu)成將在下面說(shuō)明。將軸芯/收縮管組件夾在兩個(gè)聚酯膜等(例如Mylar)的框架之間，并將粘著的側(cè)面壓在一起，這樣每個(gè)軸芯通過(guò)在端部的兩個(gè)收縮管片段4’懸掛在框架窗口76中。通過(guò)在框架22中包括至少一根細(xì)穩(wěn)固線材26，并通過(guò)封裝在圓柱形的環(huán)氧多支管中，來(lái)穩(wěn)定并強(qiáng)化兩個(gè)收縮管4’，所述環(huán)氧多支管是通過(guò)使用硅酮(silicone)管的模具，環(huán)繞著收縮管和至少一根細(xì)的穩(wěn)固線材26而鑄成的。所述兩個(gè)收縮管片段4’最后將變成CPD70的流入口和流出口?，F(xiàn)在參考圖4A和圖4B，圖中示意性地描述了一種生成用于培養(yǎng)增殖(profusion)設(shè)備的多支管的方法。圖4A特別描述了通過(guò)例如硅酮管50的套管被拉出的多個(gè)收縮管/軸芯組件11。注入環(huán)氧膠水40以填充硅酮管50并使它硬化(harden)。圖4B特別描述了環(huán)氧膠40硬化后以及硅酮管50被切開并被移開之后的情況。剩下的是硬化的環(huán)氧棒44。將軸芯收回至切點(diǎn)之后，切斷環(huán)氧棒44，留下由收縮管形成的通道42。多個(gè)收縮管的端部46可以被整合，以形成多支管21。疊加單個(gè)的CPDs或CPD框架組件可用于生成三維血管陣列?？蛇x擇的方法現(xiàn)在參考圖5A、圖5B和圖5C，示意性地描述了用于微組裝的培養(yǎng)/灌注設(shè)備的可選設(shè)計(jì)圖。圖5A特別描述了通過(guò)小孔(perforations)54將一套軸芯2引入框架，所述小孔具有套筒56，它們用于替代收縮管。圖5B特別描述了細(xì)胞接種前的CPD，包括安裝在框架壁52上的一套軸芯2。圖5C特別描述了一個(gè)可選實(shí)例，該實(shí)例為具有血管62的培養(yǎng)/灌注設(shè)備，其中微組裝多支管64可以在框架52外面聯(lián)接在套管56上。如這里所示，血管62在軸芯上生長(zhǎng)，并在軸芯被移除后而被保留下來(lái)?？梢允褂梦⒔M裝的方法(例如微成型)來(lái)大量生產(chǎn)這樣的CPD框架組件。血管生成和灌注現(xiàn)在參考圖6，這里示意性地描述了細(xì)胞接種程序。為了制備用于細(xì)胞接種的CPDs70，首先對(duì)它們進(jìn)行清洗并用紫外線滅菌。在無(wú)菌條件下，將CPDs固定在一個(gè)表面上(例如彼得里(Petri)盤72的底部)。隨后在CPD框架組件70的內(nèi)部窗口76(如圖3B所示)中填充含有附著蛋白(例如層粘連蛋白-1)的溶液。根據(jù)需要，可以使用一個(gè)或多個(gè)襯墊(spacer)77。在培育期后，將含有附著蛋白的溶液除去，然后將培養(yǎng)基中含有期望類型細(xì)胞(例如平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞)的懸浮液轉(zhuǎn)移至所述CPD70的窗口76中。通過(guò)將一定體積的細(xì)胞懸浮液填充在窗口中進(jìn)行細(xì)胞接種，翻轉(zhuǎn)CPD框架組件70使它的上部向下，因此產(chǎn)生了懸滴(hangingdroplet)80。在大約為45分鐘的培育期內(nèi)，大量細(xì)胞將附著在位于CPD框架組件中的軸芯/收縮管組件上。過(guò)量的細(xì)胞將沉到懸滴的端部，并可以很容易的被收集和除去。然后將包括一個(gè)或多個(gè)CPD框架組件的彼得里(Petri)盤恢復(fù)到朝上的位置，填充培養(yǎng)基直到CPD框架組件被浸沒(méi)，并進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中的培養(yǎng)條件包括環(huán)境中CO2含量為5%，溫度為37°C。附著在軸芯/收縮管組件上的細(xì)胞，將向外延伸并增殖，形成同軸的單細(xì)胞層(例如內(nèi)皮細(xì)胞)或150微米或更厚的多細(xì)胞層(例如平滑肌細(xì)胞)。達(dá)到期望的壁形狀或厚度時(shí)，取出軸芯從而制得空心細(xì)胞管。較薄的壁需要通過(guò)在取出軸芯前在細(xì)胞套管的周圍涂覆凝膠(例如瓊脂糖、膠原、基底膜蛋白凝膠等等)進(jìn)行保護(hù)，以防止破裂。然后將CPD框架組件的多支管連接到灌注系統(tǒng)上，灌注選擇的流體，例如生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一種由人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)生成內(nèi)皮“親代”血管的方法包括下述步驟，其中首先清洗培養(yǎng)設(shè)備，并用紫外線從各個(gè)側(cè)面照射滅菌30分鐘。在無(wú)菌條件下，將設(shè)備固定在具有無(wú)菌條(sterilestrip)的彼得里(Petri)盤的底部。然后，用層粘連蛋白-1附著蛋白溶液填充所述設(shè)備的內(nèi)部窗口(可用其它的附著蛋白代替，例如纖連蛋白(fibronectin)或明膠)。培育過(guò)夜后，除去含有附著蛋白的溶液，并將培養(yǎng)基中的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的懸浮液轉(zhuǎn)移至所述設(shè)備的窗口中。翻轉(zhuǎn)彼得里盤使上部向下，在所述設(shè)備的窗口中產(chǎn)生了細(xì)胞-培養(yǎng)基懸浮液的懸滴。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中(CO2含量為5%，溫度為37°C)培育45分鐘后，大量細(xì)胞將附著到所述設(shè)備中的軸芯/收縮管組件上。然后將彼得里盤回轉(zhuǎn)到朝上的位置，在其中填充用于人血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，直到設(shè)備被浸沒(méi)。未附著在軸芯上的細(xì)胞將落下并被吸出和除去。然后將所述彼得里盤放置在培養(yǎng)箱(CO2含量為5%，溫度為37°C)中。附著在所述軸芯上的細(xì)胞將向外擴(kuò)散并增殖，形成同軸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的單細(xì)胞層。除去所述彼得里盤中的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)設(shè)備的窗口中裝入膠原溶液并使其凝固(solidify)，并包圍帶有細(xì)胞層的軸芯。人血管內(nèi)皮細(xì)胞將形成萌芽而進(jìn)入膠原凝膠中。然后將軸芯慢慢地取出，留下可灌注的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的“親代”微血管。然后，將所述設(shè)備的多支管連接到灌注系統(tǒng)，并灌注人血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。灌注系統(tǒng)CPDs可以以線性模式或循環(huán)模式聯(lián)接在灌注系統(tǒng)上。線性設(shè)置可以由重力流系統(tǒng)形成，或者由商業(yè)可獲得的或常規(guī)構(gòu)建的注射泵形成。在注射器中裝滿灌注培養(yǎng)基并將其安裝在注射泵上，通過(guò)氣密管材與CPDs的上游端連接。CPDs可以儲(chǔ)存在無(wú)菌條件的培養(yǎng)箱中，或在CDPs內(nèi)部建立無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。將CPDs的下游多支管連接到收集灌注液的蓄水池的末端。可以通過(guò)使用蠕動(dòng)泵構(gòu)建循環(huán)系統(tǒng)。所述線性系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)均可以被固定在氣體交換設(shè)備上。氣體的濃度、灌注的壓力、流程、溫度、和營(yíng)養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物的濃度可通過(guò)傳感器進(jìn)行測(cè)量。所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)入反饋回路，以嚴(yán)格控制所需的參數(shù)。特定應(yīng)用用于與血管生成相關(guān)研究的模型現(xiàn)在參考圖7，圖7示意性地描述了在兩個(gè)生物人工親代血管200、202之間的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)減少流體(f)流入“靜脈”親代血管202，并增加在“動(dòng)脈”親代血管200上的阻力R，使流動(dòng)的灌注液204通過(guò)毛細(xì)管206改道。從而，驅(qū)動(dòng)灌注液204從具有較高壓力的血管進(jìn)入具有較低壓力的血管，以模擬從毛細(xì)管床的動(dòng)脈端到靜脈端的自然血流。軸芯法也可以用于血管生成研究模型的開發(fā)，如在藥物測(cè)試以及在創(chuàng)傷愈合、衰老、和癌癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等疾病的研究中所需要的。只采用內(nèi)皮細(xì)胞，或者內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、和外周細(xì)胞(pericytes)的結(jié)合，能夠環(huán)繞微米直徑的軸芯來(lái)培養(yǎng)親代生物人工微血管(BMVs)，并植入到細(xì)胞外基質(zhì)的載體凝膠中。然后將所述軸芯取出，將親代內(nèi)皮細(xì)胞管留在細(xì)胞外基質(zhì)凝膠210中。軸芯的取出可以手動(dòng)完成，或者借助于自動(dòng)化設(shè)備，可以使用從極慢到極快的不同速度進(jìn)行。其它變化可以包括在冷凍狀態(tài)下從生物人工微血管中取出軸芯，用熱反應(yīng)性聚合物涂覆軸芯，或牽拉軸芯的任一端使它變細(xì)直至斷裂?；衔锟梢哉T導(dǎo)親代血管形成萌芽而進(jìn)入凝膠210中，所述化合物例如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、和12-肉豆蔻酸_13_佛波乙酯(PMA)，它們被加入到凝膠和/或灌注液(例如生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中?？梢酝ㄟ^(guò)在兩個(gè)相鄰的親代生物人工微血管間形成壓力差來(lái)生成復(fù)雜的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)222，從而模擬動(dòng)脈和靜脈血流。液體流將改向，從“動(dòng)脈”生物人工血管通過(guò)相互連接的萌芽進(jìn)入“靜脈”生物人工微血管。有利地，所述灌注液可以含有含氧細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，不含血清、和促血管生成或抗血管生成的物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述灌注液可以是補(bǔ)充了血清和/或影響血管生成的化合物的含氧細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述灌注液可以是含氧的生理鹽溶液。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述灌注液可以包括含氧血液、血液組分、或血液替代品。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述灌注液可以是不含氧的，并通過(guò)基質(zhì)擴(kuò)散來(lái)實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的充氧。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以在灌注液中加入促血管生成或抗血管生成的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，在所述基質(zhì)中加入促血管生成或抗血管生成的化合物等。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包括基因修飾的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠向灌注液中或基質(zhì)中釋放產(chǎn)物。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述基質(zhì)可以優(yōu)選含有纖維蛋白、膠原、基底膜蛋白基質(zhì)和明膠。一種可用的基質(zhì)是Matrigel凝膠。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述基質(zhì)可以包括瓊月旨、瓊脂糖、藻酸鹽或硅膠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可以選自由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、外周細(xì)胞、人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、和基因修飾的細(xì)胞所組成的組中。類似地，細(xì)胞可以位于所述基質(zhì)中，所述細(xì)胞可以選自由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、外周細(xì)胞、人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞和基因修飾的細(xì)胞所組成的組中，所述細(xì)胞可以分散在整個(gè)基質(zhì)中，或者局部集中。在一些情況下，健康或病態(tài)組織(例如癌組織)的片段被植入到基質(zhì)中。源自親代血管的萌芽可以在體外以切片材料或整體標(biāo)本(whole-mount)的形式進(jìn)行顯微鏡研究。以熒光溶液(例如熒光右旋糖酐)灌注生物人工微血管可以輔助分析萌芽直徑、萌芽?jī)?nèi)腔的開放(patency)、和吻合(anastomization)的程度。萌芽形態(tài)的三維重建可以通過(guò)將由共聚焦顯微鏡得到的熒光圖像的ζ軸重疊來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^(guò)使用抗層粘連蛋白和IV型膠原的第一抗體和熒光或過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體的免疫標(biāo)記在整體標(biāo)本和組織(石蠟)切片對(duì)通過(guò)萌芽220的細(xì)胞外周基底膜基質(zhì)的合成進(jìn)行監(jiān)控。在復(fù)合的EC/SMC萌芽中，可以通過(guò)使用人CD31(克隆P2Bl-Chemicon公司)的FITC單克隆抗體(MAb)或FITC-UEA1凝集素(一種用于人類內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物)標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)兩種細(xì)胞型之間的空間關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。可以用人的α-SM肌動(dòng)蛋白的單克隆抗體并隨后用RITC抗小鼠第二抗體對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)以及內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的相互作用，可以從用前述試劑標(biāo)記的石蠟切片中獲得。所描述的構(gòu)建方法是具有高重復(fù)性的，可作為商業(yè)上大量生產(chǎn)血管生成設(shè)備的基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)谋４?例如冷凍保存)，研究人員能夠以現(xiàn)貨的方式獲得預(yù)生長(zhǎng)的親代血管或整個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)。冠狀動(dòng)脈的替代品為了生成冠狀動(dòng)脈的替代品，挑選具有一定外徑的軸芯來(lái)制備冠狀動(dòng)脈替代品，該冠狀動(dòng)脈替代品具有內(nèi)徑約為4-5.5毫米的血管內(nèi)腔?？蛇x地，所述軸芯可以是空心管，其可被灌注且它的滲透性足以滿足在冠狀動(dòng)脈的替代品的生長(zhǎng)期間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體的交換。冠狀動(dòng)脈的替代品可以只由平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)得到，因此，生成的結(jié)構(gòu)類似于血管中的中膜層，或可以由兩種或三種細(xì)胞型形成復(fù)合結(jié)構(gòu)。將平滑肌細(xì)胞接種在軸芯上，并生長(zhǎng)至300-400微米的環(huán)形層。為了加速冠狀動(dòng)脈替代物的生成，可以用下述方式操縱SMC表型在初始的生長(zhǎng)階段，使細(xì)胞進(jìn)入高度增殖的表型；然后在血管壁達(dá)到期望的厚度后轉(zhuǎn)換成分化狀態(tài)。表型轉(zhuǎn)換(switch)將導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率顯著地減緩，并誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(例如膠原和彈性蛋白)的產(chǎn)生，這些蛋白影響血管的機(jī)械性能。可以通過(guò)控制特定基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)表型的轉(zhuǎn)換。例如，在四環(huán)素反應(yīng)性啟動(dòng)子的幫助下，基因表達(dá)(例如彈性蛋白)受到抑制直到管壁達(dá)到期望的厚度(ClontechLaboratoriesInc.)。從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中除去四環(huán)素，可以激活插入的基因。例如，彈性蛋白的過(guò)度表達(dá)，將進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖以及執(zhí)行管壁的結(jié)構(gòu)功能和信號(hào)功能。機(jī)械調(diào)節(jié)(例如脈動(dòng)流)可以用于強(qiáng)化冠狀動(dòng)脈替代品，并誘導(dǎo)細(xì)胞的生理排列(physiologicalalignment)。也可以使用其它外部或內(nèi)部的“表型轉(zhuǎn)換”。在取出軸芯后或在平滑肌細(xì)胞的調(diào)整(conditioning)和重建后，可以直接將內(nèi)皮細(xì)胞接種在SMC套管上。內(nèi)皮細(xì)胞的接種可以通過(guò)將內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液灌注到SMC套管中來(lái)完成。然后停止流動(dòng)一段時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的適當(dāng)附著。如果需要，為了促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞平均分布，可以旋轉(zhuǎn)或重復(fù)地上下倒轉(zhuǎn)血管?？蛇x地，可以先將內(nèi)皮細(xì)胞接種在軸芯上。在這種情況下，平滑肌細(xì)胞被接種在匯合的內(nèi)皮細(xì)胞層上。使用這個(gè)方法，需要防止內(nèi)皮細(xì)胞向富含氧氣和養(yǎng)分的冠狀動(dòng)脈代替品的外圍遷移。如果期望，在SMC套管外面接種成纖維細(xì)胞能夠形成外膜層。用于生成冠狀動(dòng)脈替代品的細(xì)胞可以源自自體同源的(autologous)、異源的、或異種的材料。所述細(xì)胞可以是干細(xì)胞、前體細(xì)胞(precursorcells)、或分化細(xì)胞。所述細(xì)胞可以進(jìn)行基因修飾，以獲得特定的表型或降低宿主生物體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明公開的CPD方法提供了用于大量生產(chǎn)可現(xiàn)貨供應(yīng)的血管替代品或?yàn)槭荏w定制設(shè)計(jì)的血管替代品的選擇。本發(fā)明公開的CPD方法還適用于組織工程化的冠狀動(dòng)脈替代品模型的開發(fā)，動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈生成的研究，不同的血管細(xì)胞類型彼此之間以及與細(xì)胞外基質(zhì)組分之間的相互作用的研究，一氧化氮效應(yīng)的研究，和多種藥物的研究。不同大小或類型的血管和淋巴管本發(fā)明公開的CPD方法還可以用于生成在直徑和類型上不同于冠狀動(dòng)脈的血管。軸芯直徑的改變將改變血管的直徑?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞的表型和/或抑制細(xì)胞增殖的時(shí)間點(diǎn)來(lái)改變血管的類型(例如動(dòng)脈、靜脈、淋巴管)。例如靜脈僅含有小的平滑肌細(xì)胞層。其它管狀組織本發(fā)明公開的CPD方法可以被用于其它管狀組織的工程化，例如膽管、淚管、咽鼓管(pharyngotympanytube)、輸卵管、輸精管、輸尿管、尿道、肺氣管等。本發(fā)明公開的CPD方法也證明可用于由包括膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的不同類型細(xì)胞生成神經(jīng)導(dǎo)管，并指導(dǎo)神經(jīng)的生長(zhǎng)和修復(fù)。用于工程化組織的BAV系統(tǒng)本發(fā)明公開的CPD方法可以用于通過(guò)使用可去除的軸芯陣列作為骨架的組織和器官的工程化。將期望的組織/器官(肌肉、肝臟、腎臟、肺、皮膚等)的細(xì)胞接種到涂覆有附著蛋白的軸芯上。這些軸芯可由固體纖維或線材制成，或可選地由可灌注的、滲透性的管制成，例如纖維素。所述軸芯以允許結(jié)合單細(xì)胞套管的精確間距相互分離。使用這個(gè)方法可以形成片狀或塊狀的組織。然后取出軸芯(或以不同方法去除)，通過(guò)灌注系統(tǒng)的幫助向生物人工組織進(jìn)行內(nèi)部灌注。創(chuàng)傷愈合設(shè)備預(yù)制的生物人工血管系統(tǒng)可以用于幫助創(chuàng)傷愈合，例如糖尿病人的慢性潰瘍(ulcers)。生物人工毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)可以被植入片狀的載體材料中(例如來(lái)自富含血管生成生長(zhǎng)因子的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠)，并放置在創(chuàng)傷處。用含氧的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行自動(dòng)灌注，所述生物人工血管將會(huì)促進(jìn)供體血管和皮膚的萌發(fā)?？蛇x地，這樣的生物人工血管修復(fù)片段可以?shī)A在創(chuàng)傷和皮膚移植物之間，并促進(jìn)移植物的向內(nèi)生長(zhǎng)。基因治療設(shè)備生物人工血管可以用于植入式給藥設(shè)備。從病人體內(nèi)取得的細(xì)胞，能夠在體外進(jìn)行基因修飾以生成特定的蛋白(激素、酶等)。使用上述方法，可以使這些細(xì)胞生長(zhǎng)成生物人工血管或血管網(wǎng)絡(luò)。重新植入到宿主中，所述細(xì)胞可以繼續(xù)產(chǎn)生目標(biāo)物質(zhì)并將它釋放到局部或全身。人工組織和器官如上所述，組織工程化的血管網(wǎng)絡(luò)可以用于生成組織或乃至整個(gè)器官。一個(gè)方法是生成一個(gè)或多個(gè)體外可灌注的親代血管。將從期望的組織或器官中得到的實(shí)質(zhì)(parenchymal)細(xì)胞接種在所述親代血管的周圍，例如，在凝膠中。通過(guò)所述親代血管給實(shí)質(zhì)細(xì)胞供應(yīng)養(yǎng)分和氧氣。隨著實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖，養(yǎng)分和氧氣的需求量將增加。所述細(xì)胞釋放血管生成因子，并刺激血管萌發(fā)。血管系統(tǒng)以與組織生長(zhǎng)相同的速率萌發(fā)，其非常類似于自然生長(zhǎng)。因此，這個(gè)系統(tǒng)也將是一個(gè)用于發(fā)育生物學(xué)研究的良好模型。另一個(gè)方法利用平行排列的軸芯陣列作為基質(zhì)細(xì)胞的骨架。隨著基質(zhì)細(xì)胞的增殖，環(huán)繞軸芯形成細(xì)胞層。最終，所有軸芯之間的空間被實(shí)質(zhì)細(xì)胞充滿，生成了片狀組織。在取出軸芯后，該組織可以通過(guò)在軸芯處留下的通道進(jìn)行灌注。通過(guò)內(nèi)腔接種，這些通道能夠變成內(nèi)皮狀。該方法不限于在二維空間?？梢远逊e多個(gè)片狀組織，或使用三維骨架。本發(fā)明的發(fā)明人使用了用于肌肉組織的工程化的二維陣列和三維陣列。而在另一個(gè)方法中，能夠獨(dú)立地生成組織層和血管網(wǎng)絡(luò)層，然后間歇地進(jìn)行堆積。所有的這些方法能夠生成具有一種或兩種細(xì)胞型的簡(jiǎn)單模型，或者能夠生成含有多個(gè)細(xì)胞型的復(fù)合構(gòu)型。在植入后，以這些方法工程化的組織或器官可直接與血流接觸，或通過(guò)灌注系統(tǒng)持續(xù)灌注直至宿主脈管系統(tǒng)生長(zhǎng)進(jìn)移植物中。灌注組織工程化肌肉結(jié)構(gòu)的實(shí)施例現(xiàn)在參考圖8a，描述了在體外接種平滑肌細(xì)胞后的多個(gè)軸芯的圖片。多個(gè)軸芯與收縮管單元M被夾在Mylar框架中。軸芯M之間的距離可以調(diào)整到約100微米。所有收縮管片段的末端結(jié)合在一個(gè)上游多支管和一個(gè)下游多支管中(圖中未示出)。所述Mylar框架是經(jīng)過(guò)滅菌的，內(nèi)腔被覆蓋并使用每毫升5X106個(gè)的大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞SM(RASMCs)的懸浮液進(jìn)行接種。所述SM細(xì)胞附著在每個(gè)單獨(dú)的軸芯M上并增殖，因而形成了環(huán)狀層。10天后，獨(dú)立的層結(jié)合到一起并最終形成了平滑肌細(xì)胞的厚片或厚盤。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中再放置7天后，向培養(yǎng)基中補(bǔ)充50U/毫升的肝素(heparin)，并再培養(yǎng)7天。然后，取出所有的軸芯，并用肝素培養(yǎng)基以10毫升/天的速度對(duì)組織進(jìn)行灌注。灌注的腔室被固定在填充有肝素培養(yǎng)基的100毫米Petri盤的底部。對(duì)SMC盤灌注11天。灌注結(jié)束后，通道CH的功能仍被保留，并在體外清晰可見(jiàn)(如圖8b所示)?，F(xiàn)在參考圖8b，描述了灌注肌板MP的實(shí)例。所示的灌注流體通過(guò)管道末端(T)進(jìn)入由除去的軸芯留下的通道(CH)中。現(xiàn)在參考圖9，示意性描述了CPD的可選實(shí)施方式。在一個(gè)實(shí)施例中，CPD900包括并列放置在第一載玻片904和第二載玻片920之間的一層902。該層902的厚度適宜于植入以通道922相接的多個(gè)流通口。所述多個(gè)流通口包括細(xì)胞懸浮液口914、多個(gè)入口912和多個(gè)出口918。以通道922相接的口可以流通并類似地分享流體功能。排布了多個(gè)口(例如口912)以提供多個(gè)出入點(diǎn)。優(yōu)選地，其它應(yīng)用可采用帶流體腔和以微流體材料形成的口的微流體設(shè)計(jì)。同樣地，所述層可含有硅酮或適宜用于顯微鏡或微流體應(yīng)用的其它材料。膠原腔906優(yōu)選由一對(duì)空的、柔韌的毛細(xì)管916定位用于出入。所用毛細(xì)管的數(shù)量從一到遠(yuǎn)大于二，這由CPD的大小和生成血管的數(shù)量所調(diào)節(jié)。通過(guò)管入口940A、940B可由一個(gè)或多個(gè)注射泵通過(guò)層出入每個(gè)口和腔，其中所述注射泵依附在具有針的注射器上。雖為了簡(jiǎn)化附圖只顯示兩個(gè)注射泵管入口940A、940B，但可以理解的是根據(jù)情況可采用分離的注射泵、注射器或等同物來(lái)注入或抽取材料至每個(gè)腔和/或口。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述注射泵與氣密注射器連接。描述了可選實(shí)施方式CPD900的特征，可幫助理解本發(fā)明現(xiàn)在要描述的構(gòu)建CPD的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，層902采用硅酮層，在硅酮層上鉆孔得到洞和通道的模型，并以粘合頂層943和粘合底層945覆蓋硅酮層。然后，以空心針刺穿所述硅酮，之后將它用于指引聚酰亞胺涂覆的熔融石英毛細(xì)管916進(jìn)入膠原腔906以及進(jìn)入一個(gè)入口912。以小口徑管910支撐兩個(gè)毛細(xì)管，引導(dǎo)從主腔進(jìn)入出口908。然后在粘合層的幫助下將所述硅酮層902夾在兩個(gè)載玻片之間。然后將CPD900高壓滅菌并保存?zhèn)溆?。為獲得準(zhǔn)備生成血管的腔906，制備膠原溶液，通過(guò)注射針直接將該溶液注入膠原腔906中，并在培養(yǎng)箱中過(guò)夜形成凝膠。再通過(guò)將注射針插入兩個(gè)入口將CPD900與注射泵相接。依次將注射針與氣密管相接，形成兩個(gè)氣密注射器，充入調(diào)節(jié)好PH的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并安裝注射泵。以相似的方式將兩個(gè)出口908A、908B與廢液儲(chǔ)池相接。然后按操作灌注泵一樣打開注射泵，由此充進(jìn)入口繼而填充入口、毛細(xì)管和出口。當(dāng)所有空氣被排出體系時(shí)，以鑷子夾取每個(gè)毛細(xì)管，將伸入膠原腔的端部通過(guò)膠原凝膠往回拉直至毛細(xì)管端部到達(dá)基質(zhì)腔中。按這個(gè)程序，在膠原凝膠中形成了兩個(gè)可灌注通道。為了將細(xì)胞接種至膠原通道中，將高度濃縮的內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液注入到細(xì)胞懸浮液口中。然后關(guān)掉注射泵，其它毛細(xì)管端部被拉回至含有細(xì)胞的小儲(chǔ)池914R中，這導(dǎo)致大量細(xì)胞立即回流進(jìn)入所述膠原通道。通過(guò)廢液儲(chǔ)池的高度，可嚴(yán)密控制細(xì)胞的流動(dòng)速率。然后將CPD在培養(yǎng)箱中放置45分鐘，使細(xì)胞附著到膠原通道的壁上?？蓪PD倒轉(zhuǎn)幾次或以其它操作使細(xì)胞呈最佳分布。最后，毛細(xì)管被拉出細(xì)胞儲(chǔ)池進(jìn)入作為入口的一部分的儲(chǔ)池，打開注射泵并設(shè)定期望的灌注速率。過(guò)量的細(xì)胞被洗出。這個(gè)接種程序可在生長(zhǎng)一段時(shí)間之后獲得具有同源單細(xì)胞層的兩個(gè)親代血管，其中注入更加高度濃縮的細(xì)胞數(shù)會(huì)使所需時(shí)間更短。應(yīng)注意的是依據(jù)所用的軸芯類型，可通過(guò)抽取和/或降解從基質(zhì)中去除軸芯?，F(xiàn)在參考圖10，描述了單個(gè)親代血管1050生長(zhǎng)萌發(fā)1052進(jìn)入周圍基質(zhì)1054中。當(dāng)將人臍帶靜脈細(xì)胞(HUVECs)接種至膠原通道中時(shí)，生成的親代血管開始形成萌芽進(jìn)入膠原中。這些萌芽延伸并開始分枝。最終這些分枝與來(lái)自另一親代血管的分枝相吻合，從而形成血管網(wǎng)絡(luò)。現(xiàn)在參考圖11，描述了第一親代血管1102通過(guò)萌芽1106網(wǎng)絡(luò)與第二親代血管1104相接。所述萌芽1106具有內(nèi)腔并且是可灌注的。生成親代血管的方案現(xiàn)在參考圖12，描述了通過(guò)在膠原基質(zhì)的通道中接種來(lái)生成親代血管的可選方法。已經(jīng)描述了采用硅酮層的可選CPD，將描述用于生成微血管系統(tǒng)的應(yīng)用的特定實(shí)施例以促進(jìn)本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。將CPD在高壓滅菌鍋中滅菌，并保存在無(wú)菌環(huán)境中備用。制備膠原溶液并在冰上保存。將膠原充入小注射器中。在注射器中固定30G的注射針，并通過(guò)注射針將膠原溶液注入膠原腔中直至腔中完全充滿了膠原1002。從該腔的對(duì)面插入第二注射針作空氣出口。然后通過(guò)將注射針插入兩個(gè)入口，將CPD與注射泵相連1004。依次將注射針與氣密管相接，形成兩個(gè)氣密注射器，充入調(diào)節(jié)好PH的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并安裝注射泵。以相似的方式將兩個(gè)出口與廢液容器相接(即將注射針插入出口，該注射針帶有引導(dǎo)至廢液容器的管)1006。通過(guò)操作作為灌注泵的注射泵來(lái)灌注CPD，由此充進(jìn)入口繼而填充入口、毛細(xì)管和出口1008。當(dāng)所有空氣被排出體系時(shí)(例如以小口徑注射針充當(dāng)可去除的空氣出口)，然后以鑷子夾取每個(gè)毛細(xì)管，將伸入膠原腔的端部通過(guò)膠原凝膠往回拉直至毛細(xì)管端部到達(dá)基質(zhì)腔中。按這個(gè)程序，在膠原凝膠中形成了兩個(gè)可灌注通道1010。為了將細(xì)胞接種至膠原通道中，將高度濃縮的內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液注入到細(xì)胞懸浮液口中1012。然后關(guān)掉注射泵，其它毛細(xì)管端部被拉回至含有細(xì)胞的小儲(chǔ)池中，這導(dǎo)致大量細(xì)胞立即通過(guò)毛細(xì)管回流進(jìn)入膠原通道1014。通過(guò)背壓(廢液儲(chǔ)池的高度)可嚴(yán)密控制細(xì)胞的流動(dòng)速率。然后將所述毛細(xì)管進(jìn)一步拉回進(jìn)入與入口相接的儲(chǔ)池中。再將CPD在培養(yǎng)箱中放置45分鐘，使細(xì)胞附著到膠原通道的壁上1016?？蓪PD倒轉(zhuǎn)幾次或以其它操作使細(xì)胞呈最佳分布。最后，打開注射泵并設(shè)定期望的灌注速率1020。過(guò)量的細(xì)胞被洗出。這個(gè)接種程序可獲得具有同源單細(xì)胞層的兩個(gè)親代血管1022。通過(guò)灌注如上所述的親代血管可生成一個(gè)或多個(gè)微血管網(wǎng)絡(luò)。可選地，用于生成親代血管的程序也可包括將軸芯植入膠原基質(zhì)中，抽取軸芯，將細(xì)胞注入至軸芯留下的通道中，也可以如上所述參照?qǐng)D1A-1C和其它將細(xì)胞接種在軸芯上。兩種方法的組合可實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞類型形成層。本發(fā)明在這里所描述的相當(dāng)多的細(xì)節(jié)是為了遵守專利法，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的新原理而提供信息，并構(gòu)建和使用所需要的這些示例性的和專門的組分。但是，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明可以通過(guò)不同的專用設(shè)備和裝置以及構(gòu)建法則進(jìn)行實(shí)施，在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行包括具體設(shè)備和操作程序在內(nèi)的多種改變。說(shuō)明書中所引用的所有參考文獻(xiàn)的全文在此一并引入作為參考。如果發(fā)生其它方面的不可調(diào)和的沖突，以本說(shuō)明書為準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)AkhtarN,DickersonEB,AuerbachR.2002.Thesponge/Matrige1angiogenesisassay.Angiogenesis5:75_80·AlgireGH,ChalkleyHW.LegallaisFY,ParkHD.1945.Vascularreactionsofnormalandmalignanttissuesinvivo.I.Vascularreactionsofmicetowoundsandtonormalandneoplastictransplants.JNatlCancerInst6:73-85.AndradeSP,MachadoRD,TeixeiraAS,BeloAV,TarsoAM.BeraldoWT.1997.Sponge-inducedangiogenesisinmiceandthepharmacologicalreactivityoftheneovasculaturequantitatedbyafluorimetricmethod.MicrovascRes54:253_261.ArthurWT,VernonRB,SageEH,ReedMJ.1998.Growthfactorsreversetheimpairedsproutingofmicrovesselsfromagedmice.MicrovascRes55:260—270·AusprunkDH,KnightonDR,FolkmanJ.1974.Differentiationofvascularendotheliuminthechickchoroallantolsastructuralandautoradiographicstudy.DevBiol38:237-248.ClarkER,ClarkEL.1939.Microscopicobservationsonthegrowthofbloodcapillariesinthelivingmammal.AmJAnat64:251—301·DavisGE,CamarilloCW.1996.Analpha2beta1integrin-denendentpinocyticmechanisminvolvingintracellularvacuoleformationandcoalescenceregulatescapillarylumenandtubeformationinthree-dimensionalcollagenmatrix.ExpCellRes224:39-51.ElsdaleT，BardJ.1972.Collagensubstataforstudiesoncellbehavior,JCellBiol54:626_637.FederJiMarasaJCiOlande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)胞(1)被注入通道中(1014)。培育基質(zhì)(1054)以使細(xì)胞(1)附著到通道內(nèi)部(1016)。灌注(1020)通道，以去除未附著細(xì)胞并生成親代血管(1022)，其中所述親代血管(1102)包括由基質(zhì)(1054)中的細(xì)胞(1)排列而成的可灌注的空通道。親代血管(1102)被誘導(dǎo)生成進(jìn)入周圍基質(zhì)凝膠(1054)的萌芽(1106)以便形成微血管網(wǎng)絡(luò)(222)。通過(guò)親代血管(1102)對(duì)微血管網(wǎng)絡(luò)(222)進(jìn)行內(nèi)腔灌注。文檔編號(hào)C12N5/00GK101835888SQ200880108504公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2007年9月24日發(fā)明者T·諾伊曼申請(qǐng)人:諾荑思公司