專利名稱：卷煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體說是一種巻煙主流煙氣 細(xì)胞毒性測(cè)定方法，是通過將細(xì)胞暴露于巻煙主流煙氣下，測(cè)定主流煙氣造成 的細(xì)胞死亡率來進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。
背景技術(shù)：
巻煙煙氣是由幾千種化學(xué)物質(zhì)組成的氣溶膠，其中許多組分對(duì)于細(xì)胞或人 體都具有一定的毒性作用?？茖W(xué)家們開展了很多關(guān)于巻煙煙氣或煙氣中的化學(xué)
成分的細(xì)胞毒性研究，C0RESTA體外毒理學(xué)特別工作組推薦選用合適的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞用中性紅方法評(píng)價(jià)巻煙煙氣的細(xì)胞毒性，中性紅評(píng)價(jià)方法已經(jīng)被廣泛用 于評(píng)定和比較不同焦油含量以及不同類型巻煙的煙氣冷凝物的細(xì)胞毒性 [Putnam KP， Bombick匿，DoolittleDJ. Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate. Toxicology F/"o[J] 2002， 16 (5): 599-607]。此外，中性紅方法還被應(yīng)用于巻煙煙 氣中 一些具有細(xì)胞毒性化合物的細(xì)胞毒性測(cè)定，以及被巻煙生產(chǎn)企業(yè)用來測(cè)定 比較添加和未添加巻煙添加劑巻煙煙氣粒相物和氣相物的細(xì)胞毒性[Roemer E.: F.J Tewes， T.J. Meisgen, et al. Evaluation of the potential effects of ingredients added to cigarettes. Part 3: in vitro genotoxicity and cytotoxicity. Food Chem Tox [J]. 2002， 40:105-111.]。寸旦以上研究測(cè)i式的 對(duì)象為主流煙氣粒相物，將主流煙氣用劍橋?yàn)V片進(jìn)行捕集，然后將捕集到劍橋 濾片的主流煙氣粒相物進(jìn)行萃取，再進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)試。這樣的測(cè)試方法要花 費(fèi)大量的時(shí)間，操作繁瑣，且由于測(cè)試的只是巻煙主流煙氣粒相物，沒有測(cè)試 主流煙氣中的氣相組分，不能反映真實(shí)地主流煙氣細(xì)胞毒性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，而專門開發(fā)的一種用 于巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，本方法針對(duì)上述巻煙煙氣細(xì)胞毒性測(cè)試中 僅僅測(cè)試捕集到劍橋?yàn)V片上的主流煙氣粒相物細(xì)胞毒性的不足之處，同時(shí)還可 以大幅度減少煙氣收集后進(jìn)行繁瑣的溶劑萃取過程，可以直接并全面的反映巻 煙主流煙氣細(xì)胞毒性，該方法操作簡單，靈萄丈度高，結(jié)果可靠。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的先將培養(yǎng)好的細(xì)胞直接置入 經(jīng)過潔凈空氣稀釋的巻煙主流煙氣中進(jìn)行暴露，然后通過中性紅染色，根據(jù)細(xì) 胞攝入中性紅的情況，利用可讀多孔培養(yǎng)板分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度值測(cè)定，與 潔凈空氣暴露對(duì)照樣品比較，進(jìn)而判斷巻煙主流煙氣毒性。本發(fā)明的具體測(cè)定方法包括以下步驟a. 細(xì)胞培養(yǎng)將測(cè)試細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 。C下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞繁殖到一定濃度時(shí)計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T-75mL培養(yǎng)瓶中， 濃度為5. Q x 105-1 0. 0 x 105細(xì)胞/瓶，添加培養(yǎng)液至總體積20mL,于(:02細(xì)胞培 養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)24h;b. 細(xì)胞主流煙氣暴露在ISO標(biāo)準(zhǔn)條件下抽吸巻煙，產(chǎn)生的主流煙氣用潔 凈空氣稀釋，煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物(TPM)濃度為指標(biāo)進(jìn)行 控制，稀釋后的煙氣直接導(dǎo)入長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行主流煙氣暴露。暴露時(shí) 間為60min,整個(gè)暴露過程才艮據(jù)監(jiān)測(cè)的TPM/L值進(jìn)行控制，正常對(duì)照組通入潔凈空氣暴露。c. 煙氣暴露后細(xì)胞培養(yǎng)暴露結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液換成新鮮的培 養(yǎng)液，并置于C02培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)24h,對(duì)照為通入潔凈空氣并經(jīng)過相同 條件培養(yǎng)的平行樣品；d. 中性紅染色煙氣暴露過的細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，用37。C下 預(yù)熱的含Ca2+、 Mg^磷酸鹽緩沖液10mL-30mL漂洗2遍，加入20mL中性紅培養(yǎng) 液，放入C02培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)3h,然后，除去中性紅培養(yǎng)液，加入5mL-15 mL 1%曱醛固定液，室溫下放置2min-10min,吸去固定液，加入20mL中性紅溶 解液，室溫下》i:置2min-10min,顛倒幾次培養(yǎng)瓶，Y吏中性紅充分溶解，吸取
0. lmL-O. 3 mL溶解液，置于96孔培養(yǎng)板中，以中性紅溶解液作空白、空氣暴 露樣品作對(duì)照，用可讀96孔培養(yǎng)板分光光度計(jì)測(cè)定溶解液在MOnm處的吸光值； e.數(shù)據(jù)處理和分析，評(píng)^介巻煙主流煙氣細(xì)力包毒性。在本發(fā)明中，中性紅培養(yǎng)液是由中性紅染液和細(xì)胞培養(yǎng)液按體積比1:" 比例混合配制而成，需當(dāng)日配制并過濾除菌。曱醛固定液是由曱醛和蒸餾水按 體積比1:99混合而成。中性紅溶解液是由乙醇、水和水醋酸按體積比50: 49: 1本發(fā)明依據(jù)的測(cè)試原理在于將培養(yǎng)好的細(xì)胞直接置入巻煙主流煙氣中進(jìn) 行暴露，細(xì)胞攝入中性紅的水平與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，巻煙主流煙氣的毒性 作用越大，暴露于巻煙主流煙氣中存活的細(xì)胞就越少，染料吸收量也相應(yīng)越少， 其吸光度值就低。這一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較客觀地反映了巻煙主流煙氣的毒性作用， 且能定量評(píng)價(jià)受試物的細(xì)胞毒性，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有操作筒單，靈敏度高， 結(jié)果可靠的特點(diǎn)，開創(chuàng)了 一種新的用于巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定的方法。


圖1為試驗(yàn)過程所用儀器的示意圖。圖中1為吸煙機(jī)，2為流量計(jì)，3為泵，4為細(xì)胞培養(yǎng)弁瓦。 圖2為實(shí)施例1巻煙煙氣細(xì)胞毒性劑量響應(yīng)曲線圖。 圖3為實(shí)施例2巻煙煙氣細(xì)胞毒性劑量響應(yīng)曲線圖。 圖4為實(shí)施例3巻煙煙氣細(xì)胞毒性劑量響應(yīng)曲線圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合以下實(shí)施例做進(jìn)一步描述，但并不限制本發(fā)明。 實(shí)施例1對(duì)國產(chǎn)某巻煙(盒標(biāo)焦油15mg)進(jìn)行評(píng)價(jià)。樣品巻煙在ISO標(biāo)準(zhǔn)條件下抽 吸，抽吸容量為每口 35ml,持續(xù)時(shí)間2s，每分鐘抽吸一口。巻煙燃燒產(chǎn)生的主 流煙氣用潔凈的空氣進(jìn)行稀釋，并調(diào)節(jié)煙氣總粒相物濃度至30|ag/L、 60 ja g/L 、 90jig/L和120jig/L,將稀釋后的煙氣直接導(dǎo)入長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶進(jìn)行
暴露，每個(gè)濃度暴露時(shí)間為60min。試驗(yàn)中所用吸煙機(jī)與細(xì)胞培養(yǎng)瓶連接及煙 氣控制方式參見圖1。此外，將長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶通入潔凈空氣作為對(duì)照樣品。暴露結(jié)束后，將 培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液換成新鮮的培養(yǎng)液并置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后吸出培 養(yǎng)液并用預(yù)熱的含Ca2+、 Mg"磷酸鹽緩沖液20mL漂洗2遍，加入20mL中性紅培 養(yǎng)液(由培養(yǎng)液加入中性紅配置而成，要當(dāng)日配置并過濾除菌)，放入CCh培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)3h。然后將中性紅培養(yǎng)液移除，加入5mL-lSmLl。/。曱醛固定液并放置 2min-5min,吸去固定液，加入20mL中性紅溶解液(乙醇水冰醋酸50: 49: 1 )， 放置2min-5min后顛倒幾次培養(yǎng)瓶，使中性紅充分溶解，吸取Q. lmL-O. 3 mL 溶解液至96孔培養(yǎng)板。用中性紅溶解液作為空白、空氣暴露樣品作為對(duì)照，用物統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。 LC5。 (LCs。是某主流煙氣使受試細(xì)胞死亡一 半所需的濃度)計(jì)算結(jié)果為49. 2jLig/L。實(shí)施例2本實(shí)施例基本同于實(shí)施例1,僅是巻煙樣品和煙氣暴露濃度不同。巻煙樣 品為盒標(biāo)焦油8mg國產(chǎn)某巻煙，煙氣暴露濃度為20|ag/L、 60jug/L、 80|ag/L、 100|ug/L、 120jug/L和150jig/L。結(jié)果見圖3。 ZG。計(jì)算結(jié)果為78. 0 n g/L。實(shí)施例3本實(shí)施例基本同于實(shí)施例1,僅是巻煙樣品和煙氣暴露濃度不同。巻煙樣 品為盒標(biāo)焦油3mg國產(chǎn)某巻煙，煙氣暴露濃度為60|ug/L、 90jig/L、 120pg/L 和160ng/L。結(jié)果見圖4。 ZG。計(jì)算結(jié)果為95. lyg/L。
權(quán)利要求
1、一種卷煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，其特征在于先將培養(yǎng)好的細(xì)胞直接置入經(jīng)過潔凈空氣稀釋的卷煙主流煙氣中進(jìn)行暴露，然后通過中性紅染色，根據(jù)細(xì)胞攝入中性紅的情況，利用可讀多孔培養(yǎng)板分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度值測(cè)定，與潔凈空氣暴露對(duì)照樣品比較，進(jìn)而判斷卷煙主流煙氣毒性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，其特征在 于其具體測(cè)定方法包括以下步驟a. 細(xì)胞培養(yǎng)將測(cè)試細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 。C下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞繁殖到一定濃度時(shí)計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T-75mL培養(yǎng)瓶中， 濃度為5. Ox 105-10. Ox 105細(xì)胞/瓶，添加培養(yǎng)液至總體積20mL,于。02細(xì)胞培 養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)24h;b. 細(xì)胞主流煙氣暴露在ISO標(biāo)準(zhǔn)條件下抽吸巻煙，產(chǎn)生的主流煙氣用潔 凈空氣稀釋，煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物(TPM)濃度為指標(biāo)進(jìn)行 控制，稀釋后的煙氣直接導(dǎo)入長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行主流煙氣暴露，暴露時(shí) 間為60min;c. 煙氣暴露后細(xì)胞培養(yǎng)暴露結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液換成新鮮的培 養(yǎng)液，并置于C02培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)24h,對(duì)照為通入潔凈空氣并經(jīng)過相同 條件培養(yǎng)的平行樣品；d. 中性紅染色煙氣暴露過的細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，用37。C下 預(yù)熱的含Ca2-、 Mg2+"磷酸鹽緩沖液10mL-30mL漂洗2遍，加入20mL中性紅培養(yǎng) 液，放入C02培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)3h,然后，除去中性紅培養(yǎng)液，加入5mL-15 mL 1%曱醛固定液，室溫下方欠置2min-10min，吸去固定液，加入20mL中性紅溶 解液，室溫下放置2min-10min，使中性紅充分溶解，吸取0. lmL-0. 3 mL溶解液， 置于96孔培養(yǎng)板中，以中性紅溶解液作空白、空氣暴露樣品作對(duì)照，用可讀 96孔培養(yǎng)板分光光度計(jì)測(cè)定溶解液在54Qnm處的吸光值；e. 數(shù)據(jù)處理和分析，評(píng)價(jià)巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，其特征在 于中性紅培養(yǎng)液是由中性紅染液和細(xì)胞培養(yǎng)液按體積比1:"比例混合配制而 成，當(dāng)曰配制并過濾除菌。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，其特征在 于曱醛固定液是由曱酪和蒸餾水按體積比1: 99混合而成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，其特征在 于中性紅溶解液是由乙醇、水和冰醋酸按體積比50: 49: 1配制而成。
全文摘要
一種卷煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，其特征在于先將培養(yǎng)好的細(xì)胞直接置入經(jīng)過潔凈空氣稀釋的卷煙主流煙氣中進(jìn)行暴露，然后通過中性紅染色，根據(jù)細(xì)胞攝入中性紅的情況，利用可讀多孔培養(yǎng)板分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度值測(cè)定，與潔凈空氣暴露對(duì)照樣品比較，進(jìn)而判斷卷煙主流煙氣毒性。本發(fā)明依據(jù)的測(cè)試原理在于將培養(yǎng)好的細(xì)胞直接置入卷煙主流煙氣中進(jìn)行暴露，細(xì)胞攝入中性紅的水平與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，卷煙主流煙氣的毒性作用越大，暴露于卷煙主流煙氣中存活的細(xì)胞就越少，染料吸收量也相應(yīng)越少，其吸光度值就低。本發(fā)明能定量評(píng)價(jià)受試物的細(xì)胞毒性，具有操作簡單，靈敏度高，結(jié)果可靠的特點(diǎn)，開創(chuàng)了一種新的用于卷煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101393190SQ200810230659
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者盧斌斌, 孫世豪, 宗永立, 軍 胡 申請(qǐng)人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院