專利名稱：：鹵醇脫鹵酶突變體菌株、鹵醇脫鹵酶突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，生產(chǎn)該鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌的構(gòu)建，生產(chǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：環(huán)氧化物被公認(rèn)為是有機合成中最重要、應(yīng)用最廣泛的合成中間體之一。此類化合物通過化學(xué)合成易于制備，但化學(xué)反應(yīng)立體選擇性差，針對手性碳相連的羥基和卣素進(jìn)行脫鹵環(huán)氧化過程中，化學(xué)反應(yīng)一般沒有立體選擇性，雖然可以在一些化學(xué)催化劑的幫助下進(jìn)行立體選擇性反應(yīng)，但一般反應(yīng)條件要求苛刻，結(jié)果也不理想。借助鹵醇脫鹵酶生物催化劑的使用，可以進(jìn)行高立體選擇性脫鹵環(huán)氧化，從而得到單一的環(huán)氧化物，為下一步合成奠定堅實的基礎(chǔ)，而且其也可以用于拆分不同手性的鄰鹵醇混合物。同樣，環(huán)氧化物在開環(huán)反應(yīng)中可以進(jìn)行立體選擇，其中立體選擇性開環(huán)反應(yīng)因產(chǎn)生兩個鄰近的手性中心，所以是不對稱合成中極為重要的方法之一。目前環(huán)氧化物開環(huán)過程中使用的親核試劑主要有含碳親核試劑、含硫親核試劑、含氧親核試劑、含卣素親核試劑、和含氮親核試劑等，化學(xué)手性開環(huán)需要添加化學(xué)手性催化劑，這些手性催化劑在手性選擇上的結(jié)果并不理想。借助鹵醇脫鹵酶生物催化劑的使用，可以進(jìn)行高手性選擇環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)，開環(huán)過程中可以加入親核基團(tuán)如氰基、硝基或者疊氮基等，來制備非常有用的化學(xué)中間體，使用這種方法也可以對環(huán)氧化物進(jìn)行手性拆分。使用化學(xué)催化劑進(jìn)行的化學(xué)合成費用昂貴，而且重金屬會對環(huán)境帶來污染，要求的反應(yīng)條件也很苛刻。而使用鹵醇脫鹵酶生物催化劑進(jìn)行的生物合成，具有反應(yīng)條件溫和，立體選擇性高，價格相對低廉，對環(huán)境沒有污染等特點，因此，卣醇脫卣酶生物催化在環(huán)氧化物合成中的應(yīng)用被大力推崇。近年來，國內(nèi)外有許多學(xué)者把環(huán)氧化物的合成和開環(huán)反應(yīng)的研究重心轉(zhuǎn)移到生物催化領(lǐng)域中，Jensen完成(CanJMicrobiol，1957.3:151-153)了a-鹵酸脫鹵酶的早期石開究，并把能使鹵族離子從鹵代有機化合物上釋放出來的酶統(tǒng)稱為脫鹵酶(dehalogenase)，人們發(fā)現(xiàn)脫鹵酶具有很好的立體選擇作用。脫鹵酶既可以進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)，同時又可以可逆地進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)過程中加入親核基團(tuán)，環(huán)氧和開環(huán)可以同時進(jìn)行，兩步反應(yīng)后親核基團(tuán)將取代鹵素，同時又不改變碳原子的手性。生物催化反應(yīng)所要求的反應(yīng)條件一般比較溫和常溫、常壓、中性或者接近中性pH。這樣對設(shè)備性能要求不高，投入資金相對較少，生產(chǎn)過程安全，并方便于工廠管理和員工的操作。目前針對鹵醇脫鹵酶在鄰鹵醇的脫鹵反應(yīng)，申請人在國內(nèi)還沒有發(fā)現(xiàn)用基因工程的方法來工業(yè)化生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容因此為了更好地實現(xiàn)鹵醇脫鹵酶的工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明提出的技術(shù)方案的目的之一在于提供一種鹵醇脫鹵酶突變體基因，并通過篩選得到生產(chǎn)該鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種鹵醇脫鹵酶突變體。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，構(gòu)建基因工程菌的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌BL21，MC1061，和JM105中的一種，其載體系統(tǒng)選自改造后的pGEF或改造后的pBAD，且其包括本發(fā)明所提供的鹵醇脫鹵酶突變體基因。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了一種利用該基因工程菌制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法，包括構(gòu)建該基因工程菌；篩選得到該基因工程菌；培養(yǎng)該基因工程菌；種子罐發(fā)酵該基因工程菌；以及收集和制備鹵醇脫鹵酶突變體。本發(fā)明的另一個目的在于將由基因工程菌生產(chǎn)出的鹵醇脫鹵酶突變體應(yīng)用到鄰鹵醇脫鹵環(huán)氧化和環(huán)氧化物的開環(huán)中。根據(jù)本發(fā)明提供的該基因工程菌的應(yīng)用，其中，底物的結(jié)構(gòu)式為其中可以是選自由氫，低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，芳基和取代芳基組成的組中的任意一種取代基，&可以是選自由低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，芳基，取代芳基和酯基組成的組中的任意一種取代基，X為Cl，Br或I。其中&、R2獨立地選自由氫，低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，雜芳基，芳基，取代芳基和酯基組成的組。本發(fā)明基因工程菌的保藏信息—種基因工程菌，名稱為大腸桿菌MC1061，屬于大腸埃希氏菌，拉丁學(xué)名EscherichiacoliMC1061，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2008-6-16，保藏編號CCTCCNO:M208089。具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明一個實施例的鹵醇脫鹵酶基因突變體，其來源于放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(PCR)方式從放射形土壤桿菌細(xì)胞基因組中得到基因序列，然后對某些位點進(jìn)行突變，從而獲得該目的基因，其基因序列為SEQIDNO.1根據(jù)本發(fā)明一個實施例的鹵醇脫鹵酶突變體的蛋白序列為SEQIDNO.2。根據(jù)本發(fā)明一個實施例的重組載體，包括根據(jù)本發(fā)明實施例的鹵醇脫鹵基因突變體，載體可以是改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，具有核苷酸序列SEQIDN0.3，所述改造后的pBAD，具有核苷酸序列SEQIDNO.4，其中pGEF采用乳糖啟動子，誘根據(jù)本發(fā)明提供的該基因工程菌的應(yīng)用，其中底物的結(jié)構(gòu)式為導(dǎo)劑為IPTG;pBAD采用阿拉伯糖啟動子，誘導(dǎo)劑為L-阿拉伯糖。根據(jù)本發(fā)明一個實施例的生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌具有包括鹵醇脫卣酶(halohydrindehalogenase)基因突變體的重組載體。具體地，本發(fā)明的基因工程菌為保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏編號為CCTCCNO:M208089的基因工程菌。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的基因工程菌發(fā)酵工藝，包括以下步驟A)將根據(jù)本發(fā)明實施例的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵；B)種子罐發(fā)酵；以及C)商品罐發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法，包括以下步驟A)將根據(jù)本發(fā)明實施例的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵；B)種子罐發(fā)酵；C)商品罐發(fā)酵；以及D)將商品罐發(fā)酵所獲得的菌體進(jìn)行處理，獲得液態(tài)鹵醇脫鹵酶突變體。根據(jù)本發(fā)明實施例的制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法可以進(jìn)一步包括E)將獲得的液態(tài)鹵醇脫鹵酶突變體進(jìn)行干燥，以獲得固態(tài)鹵醇脫鹵酶突變體。下面對本發(fā)明的各個步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。—、基因工程菌構(gòu)建過程1.放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1基因組DNA的抽提1)5mlLB培養(yǎng)基細(xì)菌過夜培養(yǎng)，取1.5ml培養(yǎng)物離心12000rpm/3min;2)將離心得到的沉淀物用567ii1TE緩沖液(10mMTris.HCl，pH8.0;lmMEDTA)溶解，加入30iU10X的SDS和3iU20mg/ml的蛋白酶K，混勻，37攝氏度溫育lh;3)加入100ill的5MNaCl，充分混勻，再加入80ii1CTAB麵C1溶液(10%CTAB、0.7MNaCl)，混勻，65攝氏度溫育lOmin;4)加入等體積的氯仿/異戊醇(24:l)，混勻離心12000rpm/5min。將上清液轉(zhuǎn)入一個新離心管中；5)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)，混勻離心12000rpm/5min。將上清液轉(zhuǎn)入一個新離心管中；6)加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心后沉淀用70%乙醇洗滌；以及7)離心棄上清液，沉淀干燥后用lOOulTE緩沖液溶解。2.引物的設(shè)計以NCBI登錄號為AF397296的片段為模板，以primmer5引物設(shè)計軟件為基礎(chǔ)進(jìn)行引物設(shè)計正引物:ATCTGACCATGGCAACCGCAATTG(下劃線代表Ncol限制性酶切位點)；以及反引物:CCCAACGGATCCACGAACCACGGC(下劃線代表BamHI限制性酶切位點)。3.目的基因片段的獲得PCR反應(yīng)獲得原始鹵醇脫鹵酶基因片段，對序列進(jìn)行測序分析，基因序列為SEQIDNO.5。BLAST比對后確定片段為鹵醇脫鹵酶基因，然后，限制性酶NcoI和BamHI酶切后和表達(dá)載體改造后的pGEF和改造后的pBAD相連，轉(zhuǎn)化BL21、MC1061或JM105，通過抗生素、酶切、測序等方式篩選得到重組后的目的菌株。二、突變體文庫建立和篩選針對野生態(tài)鹵醇脫鹵酶在催化由S-3-羥基-4-氯-丁酸乙酯合成R-3-羥基_4-氰基_丁酸乙酯反應(yīng)中的低轉(zhuǎn)換數(shù)，對該酶進(jìn)行設(shè)計與改造。酶的催化效率可用酶的轉(zhuǎn)換數(shù)表示。在酶濃度一定，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度[Et]的情況下，酶對特定底物的最大反應(yīng)速度(Vmax)也是一個常數(shù)。此時Vmax=K3[Et]。K3表示酶被底物完全飽和時，每單位時間內(nèi)每個酶分子所能轉(zhuǎn)化底物的分子數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover皿mbeTN)，也稱為催化常數(shù)kcat。它相當(dāng)于一旦底物_酶中間物形成后，酶將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的效率，Kcat值愈大表示酶的催化效率愈高。在本發(fā)明中，改善酶的催化效率主要依靠大引物PCR技術(shù)，對鹵離子結(jié)合區(qū)(Prol75-Tyr187)進(jìn)行突變，構(gòu)建相應(yīng)的突變體文庫，并對所構(gòu)建的文庫進(jìn)行篩選以獲得具有優(yōu)良特性的突變體。1、簡并引物設(shè)計與合成將175-178位四個相鄰的突變位點設(shè)計在同一引物上，合成兩條互補的簡并引物(見表l)。由于引物中引入的突變位點較多，因此所合成的引物較普通的PCR引物長很多，以保證引物可以很好地進(jìn)行退火。表1用于構(gòu)建突變體文庫的兩條互補大引物(應(yīng)用primerpremier5)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)在0.2毫升的PCR管中進(jìn)行，將模板、上述引物、底物、和MgCl2按照一定比例混合，加雙蒸水至各個PCR管的終體積為50微升，最后加入高保真pfuDNA聚合酶，在95t:下預(yù)變性2分鐘，95t:變性1分鐘，55t:退火30秒，72。C延伸2分鐘，PCR循環(huán)數(shù)為33，隨后72t:再延伸5分鐘。加入甘油增加pfuDNA聚合酶的穩(wěn)定性，同時提高反應(yīng)體系的pH值，為擴(kuò)增反應(yīng)提供良好的環(huán)境。額外加入了鎂離子，增強聚合酶的擴(kuò)增能力。3、電擊轉(zhuǎn)化實驗為了保證所構(gòu)建文庫具有足夠的多樣性，因此，需要非常高的轉(zhuǎn)化效率，為此選擇電擊轉(zhuǎn)化。對此方法，轉(zhuǎn)化時所加DNA的體積要足夠小。實驗前要對經(jīng)Dpnl(購自MBI公司)處理過的上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃縮。采用傳統(tǒng)的乙丙醇/乙醇沉淀法。實驗證明，在4t:冰箱過夜沉淀的DNA濃縮效果最好。電擊轉(zhuǎn)化后鋪板培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)化菌落數(shù)極大(大約107—8個)。4、突變體文庫保存突變體文庫保存的方法有多種，理論上應(yīng)在電轉(zhuǎn)化鋪板培養(yǎng)后進(jìn)行單克隆菌種保存，但是該方法不適合較大突變體文庫的保存，目前比較常用的方法是突變體文庫質(zhì)粒的保存。因此，需對轉(zhuǎn)化后的菌落進(jìn)行洗滌，采用中量質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥铡Ｍ瑫r，為了證明所構(gòu)建文庫的質(zhì)量，進(jìn)行了酶切實驗。在含有野生型HheC基因的質(zhì)粒中，只含有唯一一個限制性內(nèi)切酶PpuMI酶切位點，因此，含有野生態(tài)HheC基因的質(zhì)粒經(jīng)該酶切后形成線形DNA。該酶切位點正好位于編碼Pro175的密碼子處，因此，該酶切位點會因為Pro175的突變而消失，因而在經(jīng)該酶切后不會形成線形DNA。5、突變體文庫篩選突變體表達(dá)后的篩選a.毒性試驗法由于HheC作用的大多數(shù)底物具有毒性，因而可在含有一定濃度底物的培養(yǎng)基中進(jìn)行文庫篩選。含有高催化活性的突變體的菌株可分解有毒底物而可以生存且繁殖，而含野生態(tài)或含具有低催化活性的突變體的菌株將不能生存。該方法不僅快速，而且適用的底物范圍廣。b.pH指示法通過pH指示劑的顯色反應(yīng)來檢測酶催化底物的反應(yīng)速率。三、具有高催化活性的鹵醇脫鹵酶突變體的獲得在特定條件下，催化效率是參考特定質(zhì)量的酶在特定時間特定體積內(nèi)催化特定底物轉(zhuǎn)化為實際產(chǎn)物質(zhì)量與理論產(chǎn)物質(zhì)量(100%轉(zhuǎn)化)的百分比值來進(jìn)行評定的，比值越大，催化效率越高。這里是指在p朋.5-8.0的10-100mMTris_H2S04緩沖液中，底物為(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯，反應(yīng)液中底物初始濃度5-50mM，鹵醇脫鹵酶(0.01-100mg/100ml)在20-5(TC下催化反應(yīng)20-60小時后得到的實際產(chǎn)物質(zhì)量與理論產(chǎn)物質(zhì)量的比值。通過該方法，最后篩選得到催化效率提高3倍以上的正突變體，突變體的催化效率在表2中示出。表2鹵醇脫鹵酶突變體催化特性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四、基因工程菌發(fā)酵工藝A)搖瓶發(fā)酵搖瓶種子培養(yǎng)基成分酵母抽提物5g/1;蛋白胨10g/1;NaCl:10g/1;氨芐青霉素(簡稱氨芐)100iig/ml。搖瓶種子培養(yǎng)基制備取5g酵母抽提物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到7，用蒸餾水定容到1000ml，12rC保持15min，，在12rC下保持15min，溶液冷卻到60°C以下后加入氨芐至終濃度100iig/ml。發(fā)酵步驟從斜面接種到搖瓶，30-37t:，轉(zhuǎn)速150-200rpm攪拌，過夜培養(yǎng)1012h。B)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基成分蛋白胨5-15g/1、酵母抽提物5-20g/1、葡萄糖8_20g/l(或者甘油5-10g/l)、KH2P0410-15g/l、(NH4)2HP044.0_5.0g/l、(NH4)2S04l_2g/l、MgS04.7H201-1.5g/l、擰檬酸1.5-2.0g/l、CoCl2*6H202_3mg/l、MnCl2*4H2012-15.0mg/l、CuCl2.4H201-2mg/l、生物素4-5mg/l、維生素B14_5mg/1。底料培養(yǎng)基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、CoCl2.6H20、MnCl2.4H20、CuCl2.4H20攪拌溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6-7，121°C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)、MgS047H20單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素Bl采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖(或者甘油)，MgS047H20，生物素，和維生素B1加入底料培養(yǎng)基中。種子罐發(fā)酵控制按照5%_10%的接種量從搖瓶接種到種子罐中，發(fā)酵溫度控制在27-32。C，pH控制在6-8，D0X(溶解氧，dissolvedoxygen)控制在20%以上。C)商品罐發(fā)酵培養(yǎng)基分底料培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基。其中底料培養(yǎng)基成分如下葡萄糖2-20g/l(或者甘油5-10g/l)、蛋白胨5-15g/l、酵母抽提物5-20g/l、KH2P0410_15g/1、(NH4)2HP044.0-5.0g/l、(NH4)2S04l-2g/l、MgS04.7H201-1.5g/l、擰檬酸1.5-2.Og/1、CoCl26H202-3mg/l、MnCl24H2012—15.Omg/l、CuCl24H20l_2mg/l、Na2Mo042H202-3mg/l、Zn(CH3C00)22H2010-20mg/l、擰檬酸鐵80-100.Omg/l、生物素4-5mg/l、維生素B14-5mg/1。底料培養(yǎng)基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、CoCl2.6H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、擰檬酸鐵攪拌溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6-7，12rC下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素Bl采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖、MgS(^71120、生物素、和維生素Bl加入底料培養(yǎng)基中。流加培養(yǎng)基成分如下葡萄糖400g/l(或者甘油700g/l)、CoCl26H204.0-6.Omg/l、MnCl24H2020_30mg/l、CuCl24H202_3mg/l、H3B035_8mg/l、Na2Mo042H204-5mg/l、Zn(CH3C00)22H2010-20mg/l、擰檬酸鐵40_50mg/l。流加培養(yǎng)基配制:CoCl26H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、檸檬酸鐵攪拌溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6-7，121。C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖和MgS0^7H20單獨滅菌，12rC下保持20min。然后將無菌的葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20加入流加培養(yǎng)基中。商品罐發(fā)酵控制整個過程控制DO20%以上，通風(fēng)比為1:l-4(VVM)，葡萄糖(或者甘油)殘余含量O.001%。-1%。(w/v)，整個發(fā)酵時間25-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體干重可以達(dá)到20-80g/l左右。商品罐誘導(dǎo)控制在發(fā)酵過程中，通過誘導(dǎo)劑的添加表達(dá)目的蛋白酶，誘導(dǎo)劑有IPTG或者L-阿拉伯糖，誘導(dǎo)劑用量為0.1°;-5°;(w/v)，誘導(dǎo)時期為發(fā)酵前期或者中后期。五、發(fā)酵液處理和酶制備發(fā)酵完畢后，將發(fā)酵液送入連續(xù)分離機、板框或者真空轉(zhuǎn)鼓進(jìn)行菌液分離，濃縮菌體，濃縮菌體單獨或者結(jié)合采用物理、化學(xué)和生物破壁方法進(jìn)行細(xì)胞破碎。物理方法主要采用均質(zhì)機破碎，菌液濃度控制在50-200g/l，破碎壓力控制在30-60Mpa;化學(xué)方法開始用稀硫酸將濃菌體(50-200g/l)的pH調(diào)到7-8，攪拌均勻，用10X-20X的CaCl2下調(diào)pH到6-7，充分?jǐn)嚢韬笥孟aOH調(diào)節(jié)pH到7_8;生物方法主要采用溶菌酶進(jìn)行細(xì)胞破壁，溶菌酶濃度l-2mg/ml，菌液濃度50-200g/l，攝氏37度處理4_20小時。細(xì)胞處理液板框過濾或者離心后取上清，上清進(jìn)行微濾和超濾濃縮，向濃縮液中添加1%_10%甘油，0.02%。-2%。苯甲酸鈉，制備液態(tài)酶。按照產(chǎn)品酶活，將濃縮液中添加適量的淀粉、面粉、糊精等，在進(jìn)風(fēng)溫度120-180。C、出風(fēng)溫度70-80。C、風(fēng)速l士O.5mVmin、壓力:12-15X10kPa條件下進(jìn)行噴霧干燥，制備固態(tài)酶。鹵醇脫鹵酶突變體的應(yīng)用1.鹵醇脫鹵酶的作用機理鹵醇脫鹵酶和SDR家族在活性位點上存在相似性，其中132位絲氨酸(Serl32)和145位酪氨酸(Tyrl45)在蛋白氨基酸組成中非常保守，這些氨基酸在催化過程中所起的作用和SDR家族類似。Tyr作用于底物中的鄰鹵羥基，獲取質(zhì)子，同時Ser通過氫氧鍵和底物的羥基中的氧結(jié)合，固定底物和穩(wěn)定反應(yīng)液。鹵醇脫鹵酶HheC在pH7-8、30-5(TC條件下，145位的蘇氨酸，132位的絲氨酸，和149位的Arg與底物反應(yīng)，生成單一手性環(huán)氧化物。開環(huán)過程類似，是環(huán)氧化物合成的逆反應(yīng)。通過氨基酸位點突變來證明酶的作用機理(底物2-溴-1-苯乙醇)，結(jié)果在表3中示出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表3中我們可以看出，對于絲氨酸(Serl32)和145位酪氨酸(Tyrl45)進(jìn)行突變后，其對底物的反應(yīng)速度明顯下降，證明這兩個位點對于鹵醇脫鹵酶的催化作用起到了至關(guān)重要的作用。反應(yīng)式l如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>反應(yīng)式1關(guān)于鹵醇脫鹵酶作用底物的廣泛性，可以通過以下實驗結(jié)果得到證實(見表4)。表4催化速度(以每毫克蛋白每分鐘從1、3-二氯-2-丙醇中釋放20.71111101鹵素計為100%)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表4中可知，鹵醇脫鹵酶對多種鹵醇都具有脫鹵催化作用。環(huán)氧化物合成的作用底物鄰鹵醇其中，&可以是選自由氫，低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，芳基和取代芳基組成的組中的任意一種取代基，&可以是選自由低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，芳基，取代芳基和酯基組成的組中的任意一種取代基，X為Cl，Br或I。2.環(huán)氧化物開環(huán)的作用底物環(huán)氧化物o其中，R2獨立地選自由氫，低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，雜芳基，芳基，取代芳基和酯基組成的組。開環(huán)過程中，可以通過NaCN、NaN02、NaN3引入_CN、_冊2、或者_(dá)N3親核基團(tuán)，從而合成各種非常有用的中間體化合物。在一種優(yōu)選的具體實施方式中，&為H，R2為乙酸乙酯基。在另一種優(yōu)選的具體實施方式中，&為H，R2為乙酸甲酯基。在另一種優(yōu)選的具體實施方式中，&為H，R2為氯甲基。在另一種優(yōu)選的具體實施方式中，&為對硝基_苯基，R2為H。在本申請的上下文中，烷基可以是含有1至IO個碳原子的直鏈或支鏈飽和基團(tuán)，具有包括1至10個碳原子在內(nèi)的烷基基團(tuán)的實例是甲基，乙基，丙基，異丙基，叔丁基，正丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，2-乙基己基，2_甲基丁基，2_甲基戊基，l-甲基己基，3_甲基庚基，以及它們的其他異構(gòu)形式。優(yōu)選地，烷基基團(tuán)具有1至6個碳原子，實例是甲基，乙基，丙基，異丙基，叔丁基，正丁基，戊基，己基等。如下所述，這些烷基基團(tuán)可以被取代，例如被芳基或烷氧基基團(tuán)取代。術(shù)語烷氧基表示如上文定義的烷基基團(tuán)，其通過一個氧原子連接于分子的其余部分。術(shù)語鏈烯基表示直鏈或支鏈基團(tuán)，這些基團(tuán)包含2至6個碳原子，并且存在至少一個C=C雙鍵。鏈烯基基團(tuán)的實例尤其包括烯丙基基團(tuán)。術(shù)語炔基表示直鏈或支鏈基團(tuán)，其包含2至8個碳原子，并且存在至少一個Cec三鍵。炔基基團(tuán)的實例尤其包括乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基和己炔基基團(tuán)。如下所述，這樣的基團(tuán)可以被取代，尤其是被烷氧基、NHCOR'或如下定義的芳基取代。術(shù)語芳基包括任何包含6至18個碳原子，優(yōu)選6至14個碳原子的芳族基團(tuán)。最優(yōu)選的芳基基團(tuán)是單環(huán)或雙環(huán)的，并且包含6至10個碳原子，如苯基、或a-萘基、或者|3-萘基。另一種最優(yōu)選的芳基基團(tuán)是三環(huán)的，并且包括蒽基、或芴基基團(tuán)。當(dāng)&或者12是芳基基團(tuán)時，它優(yōu)選是苯基、l-萘基、或2-萘基基團(tuán)。術(shù)語雜芳基包括任何包含4至18個碳原子，優(yōu)選4至14個碳原子，并且被選自N、0、S的一個或幾個雜原子所中斷的芳族基團(tuán)。最優(yōu)選的雜芳基基團(tuán)是噻吩基或苯并噻吩基，苯并呋喃基，吡啶基，嘧啶基，噠嗪基，異喹啉基，喹啉，噻唑基，呋喃基，吡喃基，吡咯基，2H-吡咯基，咪唑基，苯并咪唑基，吡唑基，異噻唑基，異噁唑基，以及噴哚基基團(tuán)。術(shù)語芳烷基(或芳(C「Ce)烷基)基團(tuán)總體上表示通過如上文定義的烷基基團(tuán)連接于分子的芳基基團(tuán)，如芐基或苯乙基。術(shù)語(C「Ce)烷芳基基團(tuán)總體上表示通過如上文定義的芳基基團(tuán)連接于分子的烷基基團(tuán)。術(shù)語"環(huán)烷基"表示環(huán)狀的飽和烴基體系，其優(yōu)選為具有3至6個碳原子的單環(huán)或多環(huán)。這類基團(tuán)的典型實例是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基基團(tuán)。術(shù)語"雜環(huán)"包括任何烴基化的芳族或非芳族的環(huán)，并具有一個或多個環(huán)雜原子。尤其是，一個雜環(huán)存在4至18個碳原子和一個或多個環(huán)雜原子，如N、0、或S。它們包括雜芳基基團(tuán)，如噻吩基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，吡啶基，嘧啶基，噠嗪基，異喹啉基，喹啉基，噻唑基，呋喃基，妣喃基，妣咯基，2H-妣咯基，咪唑基，苯并咪唑基，妣唑基，異噻唑基，異唑基，以及吲哚基基團(tuán)。它們還包括非芳族雜環(huán)，如嗎啉，哌啶，哌嗪，四氫呋喃基，以及吡咯烷基團(tuán)。鹵素應(yīng)理解為是指氟、氯、溴或碘。雜原子應(yīng)理解為是指0、N或S。下面將結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例I.本發(fā)明基因工程菌的構(gòu)建依靠大引物PCR技術(shù)，對鹵醇脫鹵酶的鹵離子結(jié)合區(qū)(Prol75-Tyr187)進(jìn)行突變，將突變體和載體pBAD進(jìn)行構(gòu)建，轉(zhuǎn)化到宿主MC1061中構(gòu)建突變體文庫，對突變體文庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)P175H和Y177W突變效果比較理想，突變體氨基酸序列為SEQIDNO.2，進(jìn)一步得到能生產(chǎn)該突變體的基因工程菌，該基因工程菌保藏編號為CCTCCNO:M208089。II.基因工程菌的發(fā)酵將本發(fā)明的菌株按照以下條件進(jìn)行發(fā)酵。A)搖瓶發(fā)酵取5g酵母抽提物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到7，用蒸餾水定容到1000ml，12rC下保持15min，溶液冷卻到60°C以下后加入氨芐至終濃度lOOiig/ml。從斜面接種到搖瓶，溫度37t:，轉(zhuǎn)速150rpm攪拌，過夜培養(yǎng)12h。B)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基成分葡萄糖8g/l(或者甘油10g/l)、蛋白胨10g/l、酵母抽提物15g/1、KH2P0410g/l、(NH4)2HP044.0g/l、(NH4)2S04lg/l、MgS04.7H20lg/l、擰檬酸1.5g/l、CoCl26H202mg/l、MnCl24H2012mg/l、CuCl2.4H20lmg/l、生物素4mg/l、維生素Bl4mg/1。底料培養(yǎng)基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、CoCl2.6H20、MnCl2.4H20、CuCl2.41120攪拌溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7，121。C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)、MgS0^7H20單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素Bl采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖，MgS0^7H20，生物素和維生素Bl加入底料培養(yǎng)基中。種子罐發(fā)酵控制按照5%的接種量從搖瓶接種到種子罐中，發(fā)酵溫度控制在30°C，pH控制在7，DO控制在20%以上。C)商品罐發(fā)酵其中底料培養(yǎng)基成分如下葡萄糖20g/l(或者甘油10g/l)、蛋白胨10g/l、酵母抽提物15g/l、KH2P0410g/l、(NH4)2HP044.0g/l、(NH4)2S04lg/l、MgS04.7H20lg/l、檸檬酸1.5g/l、CoCl26H202mg/l、MnCl24H2012mg/l、CuCl24H20lmg/l、Na2Mo042H202mg/l、Zn(CH3C00)22H2010mg/l、擰檬酸鐵80mg/l、生物素4mg/l、維生素Bl4mg/l。底料培養(yǎng)基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、13CoCl2.6H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3C00)221120、擰檬酸鐵攪拌溶解，用Na0H調(diào)節(jié)溶液pH至7，12rC下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS0^7H^單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素B1采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖(或者甘油)，MgS047H20，生物素和維生素Bl加入底料培養(yǎng)基中。流加培養(yǎng)基成分如下葡萄糖400g/l(或者甘油700g/l);CoCl26H204.Omg/1;MnCl24H2020mg/l;CuCl24H202mg/l;H3B035mg/l;Na2Mo042H204mg/l;Zn(CH3COO)22H2010mg/l;擰檬酸鐵40mg/1。流加培養(yǎng)基配制:CoCl26H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、檸檬酸鐵攪拌溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6-7，121。C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20單獨滅菌，12rC下保持20min。然后將無菌的葡萄糖和MgS047H20加入流加培養(yǎng)基中。商品罐發(fā)酵控制整個過程控制DO20%以上，空氣流量1:1.5vvm，控制葡萄糖(或者甘油)殘余含量1%。以下，發(fā)酵結(jié)束后菌體干重可以達(dá)到20g/l。商品罐誘導(dǎo)控制在發(fā)酵過程中，通過誘導(dǎo)劑的添加表達(dá)目的蛋白酶，誘導(dǎo)劑為IPTG(pGEF表達(dá)載體)或者L-阿拉伯糖(pBAD表達(dá)載體)，誘導(dǎo)劑用量為2%。(w/v)，誘導(dǎo)時期為發(fā)酵前期。III.鹵醇脫鹵酶突變體的制備及鑒定將CCTCCM208089按上述條件發(fā)酵完畢后，將發(fā)酵液進(jìn)入連續(xù)分離機進(jìn)行菌液分離，濃縮菌體，濃縮菌體采用均質(zhì)機破碎，菌液濃度控制在100g/l，破碎壓力控制在50MPa。細(xì)胞處理液板框過濾后取上清，上清進(jìn)行微濾和超濾濃縮，濃縮液添加1%甘油，1%。苯甲酸鈉，制備液態(tài)酶。按照產(chǎn)品酶活，將淀粉和面粉(淀粉面粉=i:i)混合物按照一定比例加入濃縮酶液中，在進(jìn)風(fēng)溫度15(TC、出風(fēng)溫度7(TC、風(fēng)速1±0.5mVmin、壓力12-15X10kPa條件下進(jìn)行噴霧干燥，制備固態(tài)酶。IV.鄰鹵醇的脫鹵實例1:(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的催化合成將反應(yīng)緩沖液(50mMTrisH2S04，pH:8)力B熱恒溫到30°C;將底物加入反應(yīng)緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為10g/l，攪拌均勻。先將30%NaCN的溶液稀釋10-20倍，然后用稀硫酸調(diào)節(jié)NaCN溶液pH到8.0，按照底物和NaCN的摩爾數(shù)比1:2比例添加稀釋的NaCN，攪拌均勻；加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯二1:100(w/w))進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)過程中通過補加NaCN調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值。3(TC下反應(yīng)24小時，催化效率達(dá)到97%，目的產(chǎn)物的光學(xué)純度(ee)值達(dá)到99%。實例2-l:(S)-氯甲基-環(huán)氧乙烷的催化合成將反應(yīng)緩沖液(50mMTris*H2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將1，3-二氯-2-丙醇加入反應(yīng)緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為10g/l，攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體1，3-二氯-2-丙醇=1:500(w/w))進(jìn)行催化反應(yīng)。3(TC下反應(yīng)24小時，催化效率達(dá)到90%，目的產(chǎn)物光學(xué)純度達(dá)到95%。實例2-2:(lS，2R)-2-甲基_1_苯基_環(huán)氧乙烷的催化合成將反應(yīng)緩沖液(50mMTris*H2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將(1S，2R)_2-氯(或者溴)-1-苯基-1-丙醇加入反應(yīng)緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為80g/l，攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體(lS，2R)—2-氯(或者溴)-l-苯基-l-丙醇=1:500(w/w))，進(jìn)行催化反應(yīng)。3(TC下反應(yīng)24小時催化效率達(dá)到92X，目的產(chǎn)物光學(xué)純度達(dá)到96%。V.環(huán)氧化物開環(huán)實例3-l:(S)-氯甲基環(huán)氧乙烷的手性拆分將反應(yīng)緩沖液(50mMTrisH2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將混旋的氯甲基環(huán)氧乙烷加入反應(yīng)緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為10g/l，然后加入40%NaN3到終濃度為10g/l，攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體對應(yīng)于氯甲基環(huán)氧乙烷=1:500(w/w))進(jìn)行催化反應(yīng)。3(TC下反應(yīng)24小時催化效率達(dá)到45X，目的產(chǎn)物光學(xué)純度達(dá)到95%。實施例3-2:(1S，2R)-1_甲基-l-苯基環(huán)氧乙烷的手性拆分將反應(yīng)緩沖液(50mMTris*H2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將混旋1_甲基+苯基環(huán)氧乙烷加入反應(yīng)緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為80g/l，然后加入40%NaN3到終濃度為10g/l攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體(1S，2R)—1-甲基-1-苯基環(huán)氧乙烷=1:500(w/w))進(jìn)行催化反應(yīng)。3(TC下反應(yīng)24小時催化效率達(dá)到45%，目的產(chǎn)物光學(xué)純度達(dá)到96%。綜上所述，雖然本發(fā)明已以一個優(yōu)選實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可以作各種更動與修改。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附的申請權(quán)利要求書所限定的為準(zhǔn)。序列表〈110〉安琪酵母股份有限公司〈120〉鹵醇脫鹵酶突變體的菌株、鹵醇脫鹵酶突變體及其制備方法和應(yīng)用〈130〉P20220ANGEL〈160>5〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>765〈212>DNA〈213〉鹵醇脫鹵酶基因突變體〈400>1atgtcaaccgcaattgtaaccattttggggg^tggggtctgcacttcgt60ctctcggaagagtggcttgcgcttcaaaca120cttgaagcctttgccgaaacctatccacaatgtcgg肌ca3g^CC3gCg180gaactcatcgctccgcttatggt固gttgatgtacttgtg3gC33Cg3C240atettcgcaccagagttccaacccategattcgcggtgcg300gtcgaggcgcaccatttgcactggtcaacgccgttgcaag360^gcgc皿^gcggacatettetctttattacctctgcaacgcccttcgggccttgg啷420gaactttctacctacacgtc3gCCCg3gC3ggtgratgcaccttggcaaatgccctttcg■朋gg朋ctcggtg朋tec朋cattccggtgttcgcaataggacacaattggcttcacagtgaagatagtccctacttctaccccacagaaccgtgg朋朋cgaatccagaacacgttgcccatgtcaaaaaagtcactgcgctccagcggttaggtacac3g朋3g朋ttgggag朋ctcgtcgcgtttctcgcgtctggtegttgtgactatctgaccggccaggtgttctggttggccggcggattcccaatgatcgagcgttggcctggtatgcccgagtag〈210>2〈211>254〈212>PRT〈213〉鹵醇脫鹵酶突變體〈400>2MetSerThrAlalieValThrAsnValLysHisPheGlyGlyMetGly151015SerAlaLeuArgLeuSerGluAlaGlyHisThrValAlaCysHisAsp202530GluSerPheLysGinLysAspGluLeuGluAlaPheAlaGluThrTyr354045ProGinLeuLysProMetSerGluGinGluProAlaGluLeulieGlu505560AlaValThrSerAlaTyrGlyGinValAspValLeuValSerAsnAsp65707580liePheAlaProGluPheGinProlieAspLysTyrAlaValGluAsp859095TyrArgGlyAlaValGluAlaLeuGinlieArgProPheAlaLeuVal100105110AsnAlaValAlaSerGinMetLysLysArgLysSerGlyHislielie115120125PhelieThrSerAlaThrProPheGlyProTrpLysGluLeuSerThr130135140TyrThrSerAlaArgAlaGlyAlaCysThrLeuAlaAsnAlaLeuSer145150155160LysGluLeuGlyGluTyrAsnlieProValPheAlalieGlyHisAsn165170175TrpLeuHisSerGluAspSerProTyrPheTyrProThrGluProTrp180185190LysThrAsnProGluHisValAlaHisValLysLysValThrAlaLeu195200205GinArgLeuGlyThrGinLysGluLeuGlyGluLeuValAlaPheLeu210215220AlaSerGlySerCysAspTyrLeuThrGlyGinValPheTrpLeuAla13/17頁76516225230235240GlyGlyPheProMetlieGluArgTrpProGlyMetProGlu245250〈210〉3〈211〉3089〈212〉DNA〈213〉改造后的pGEF〈400〉3attg^gcatttatcagggttettgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttaga60皿teggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgtatgcggtg120C3C3g3tgCgteaggag3^ateccgcatcaggcg^att180atettttgtt皿^ttcgcgttaaatetttgttaaatcagctcatttttt240ccg^atcggcaaaatccctcg卿tegggttgagtgttg300ttccagtttgg^c^gagtccactettea3g^cgtgg3ctccaacgtc■agggcg^360aaaccgtctatc鄉(xiāng)gcgatggcccactacgtgaaccatcagttttttgc420ggtcg郷tgccgtaaagctcte^tcgga3cccte33gggagcccccgatttagagctt480gacgggg^agCCggCg33Cgtggcg卿a鄉(xiāng)^ggg^ggagcgggcg540ctegggcgctggc卿tgtegcggtcacgctgcgcgtaacC3CC3C3CCCgccgcgctte600atgcgccgctac鄉(xiāng)gcgcgtccagtcgccattcaggctgcgcaactgttggg皿gggcg660atcggtgcgggcctcttcgctettacgccaggatctcgatcccgcgaaattaatecgact720cacteteggg3g3CC3C^Cggtttccctctagaaataattttgtttaac780tggctagcatg3Ctggtgg3C3gC皿3tgggtcggatccggctgctaaca840皿gcccga皿gg皿gctgagttggctgctgccaccgctgagc皿teactegcataacccc■ttggggcctcte皿cgggtcttgaggggttttttgctgaaatetccggat960gggttcg腿tcgateagctctgcctcgcgcgtttcggtgaaacctctga1020cacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgteagcggatgccggg3gC3g3C朋1080gcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtca1140cgtegcgategcggagtgtetectggctteactetgcggcattgtectga1200g3gtgC3CC3tatetgcggtgtga皿teccgcacagatgcgteaggag皿aateccgcat1260caggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcg13203gcggtetcagctcactc皿aggcggteatacggttetccgggateacgc13803tgtg3gC皿朋ggCC3gC3皿3ggCC3gg皿ccgtea皿aggccgcgtt1440gctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatgacgctc皿g1500tc卿ggtggcg皿3cccgacaggactete皿gatecc3ggcgtttccccctggaagctc1560cctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctteccggatecctgtccgcctttctccc1620ttcggg朋gcgtggcgctttctcategctcacgctgteggtetctcagttcggtgteggt1680cgttcgctcc朋gctgggctgtgtgracgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcctt1740atccggtaactatcgtcttgagtccaacccggteagacacgacttetcgccactggcagc1800agccactggt朋caggattegcag3gcgaggtetgteggcggtgct織gagttcttgaa1860gtggtggcctaactecggct3cacteg朋ggacagtetttggtetctgcgctctgctg朋1920gccagttaccgagttggtegctcttgatccggcaaacaaaccaccgctgg1980tegcggtggtttttttgtttgc朋gcagc3gattecgcgc3ga朋朋朋ggatctc朋ga2040agatcctttgatcttttctecggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgtteagg2100gattttggtcatgagattetc朋3朋ggatcttcacctegatcctttt朋atte朋朋tg2160朋gtttte朋tcaatcteaagtetetatgagteaacttggtctgacagttaccaatgctt2220朋tcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctetttcgttcatccategttgcctgact2280ccccgtcgtgtagateactecgatecgggagggctteccatctggccccagtgctgcaat2340gateccgcgagacccacgctcaccggctccagatttetcagcaateaaccagccagccgg2400朋gggCCgElgcgcagaagtggtcctgcaactttetccgcctccatccagtctetteattg2460ttgccggg朋gctegagteagtegttcgccagtteategtttgcgcaacgttgttgccat2520tgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtetggcttcattcagctccggttc2580ccaacgatcaaggcgagttecatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttegctcctt2640cggtcctccgatcgttgtcagaagteagttggccgcagtgttetcactcatggttetggc2700agcactgcataattctcttectgtcatgccatccgteagatgcttttctgtgactggtga2760gtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtetgcggcgaccgagttgctcttgcccggc2820gtc朋tecgggateateccgcgccarategcag皿ctttea^gtgctcatcattgga朋2880acgttcttcggggcg朋皿ctctcaaggatctteccgctgttgagatccagttcgatgta2940acccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttectttcaccagcgtttctgggtg3000gg皿ggra皿atgccgc皿3皿3ggg皿te3gggcg3cacgg朋atgttg3060ctcttccttt-ttcaatatt3089〈210〉4〈211〉4094〈212〉DNA〈213〉改造后的pBAD〈400〉4ttgtccatettgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttectggctct60tctcgcteacca皿ccggteaccccgcttette朋3gcattctgteac朋agcgggacca120皿gCC3tg3C朋c朋朋gtgtcteteatcacggcag朋朋gtccacattg180attetttgcacggcgtcacactttgctetgccategcatttttetccateagattegcgg240atcctecctgacgctttttetcgcaactctctectgtttctccatecccgttttttgggc300teacaggaggggatccgagctcgagatctgcagctggteccatetgggaa360ttcgaagcttgggcccg皿c3朋朋ctcatctcag朋gaggatctg朋tegcgccgtcga420ccatcatcatcatcatcattgagttteaacggtctccagcttggctgttttggcggatga■gag皿gattttcagcctgat3cagatte朋tcag朋cgc3g朋gcggtctgate朋3C3g540aatttgcctggcggragtegcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtg600a皿cgccgtegcgccgatggtegtgtggggtctccccatgcgagagtegggaactgccag660ctcagtcgaaagactgggcctttcgttttetctgttgttt720gtcggtg雄gctctcctgagteggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaa780gcaacggcccgg郷gtggcgggc郷acgcccgccateaactgccaggc840gcag皿ggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctecaaactcttttgtttetttt■ttcaaatetgtatccgctcatgagac皿teaccctgateaatgcttcaat960朋gg皿gagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttt1020ttgcggcattttgccttcctgtttttgctc3CCC3g皿3Cgctggtg咖1080gttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggteaga1140tccttgagagttttcgccccg皿g皿cgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgc1200tetgtggcgcggtettatcccgtgttgacgccgggc皿gagcaactcggtcgccgcatec1260actettctcag皿tgacttggttgagtectcaccagtcaccttecggatg1320gratgacagttgcagtgctgccateaccatgagtgateacactgcggcca1380acttecttctgac皿cgatcgg郷紅gaaggagcteaccgcttttttgC3C朋C3tgg1440gggatratgtaactcgccttgatcgttggg皿ccggagctg皿tg皿gccatecc皿3cg15003Cg3gCgtg3caccacgatgcctgtegcaatggc朋c皿cgttgcgca皿ctetteactg1560gcgaactacttactctagcttcccggcaacctggatggaggcggate皿g1620ttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgate皿tctg1680g賜ccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggcc卿tggteagccct1740cccgtetcgtagttetctec3Cg3Cgggg3gtcaggc皿ctetggatg皿cga朋tegac1800agatcgctgagateggtgcctcactgatte3gcattggteactgtcagaccaagtttect1860catetetactttegattgattteaaacttcattttteatttea朋ggatcteggtga卿1920tcctttttgataatctcatgctteacgtgagttttcgttccactgagcgt1980cagaccccgt朋aggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgteatct2040gctgcttgcaccaccgcteccagcggtggtttgtttgccggatengage2100teccaactctttttccgaaggteactggcttcagragagcgcagateccaaatectgtcc2160ttctegtgtegccgtegtteggccaccacttcaagaactctgtegcaccgcctecatecc2220tcgctctgctaatcctgtteccagtggctgctgccagtggcgateagtcgtgtctteccg2280ggttggactc朋gacgategtteccggate郷cgragcggtcgggctgaaeggggggtt2340cgtgcacacagcccagcttggagcg朋cgacctecaccgaactgagatecctecagegtg24003gctetgag3朋gcgccacgcttcccgaaggg卿皿ggcgg織ggtetccggteagcg2460gc郷gtcgg朋C3gg3g3gcgracg郷gagcttccaggggg朋acgcctggtatcttt2520atagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcag2580gggggcggagcctetgga皿朋CgCC3gC3acgcggcctttttecggttcctggcctttt2640gctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttetcccctgattctgtggat朋ccgte2700ttaccgcctttgagtgagctgateccgctcgccgcagccg皿cgaccgagcgcagcgagt2760C3gtg3gCg3gg皿gcgg皿gagcgcctgatgcggtettttctccttecgcatctgtgcg2820gtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtecaatctgctctgatgccgcategttea2880gccagtetecactccgctetcgctecgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgcc2940aacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgctt3C3g3C皿gC3000tgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccga朋cgcgc3060atcaattcgcgcgcg朋ggcg皿gcggcatgcateatgtgcctgtcaaat3120gg3Cg皿gC3gggattctgcaaaccctetgctectccgtcaagccgtcaattgtctgatt3180cgtteccaattatgacaacttgaeggctecatcattcactttttcttcacaaccggcacg3240gaactcgctcgggctggccccggtgcatttttteaatecccgcgagaaatagagttgatc3300acattgegaecgacggtggcgateggcatccgggtggtgctc皿皿grag3360cttcgcctggctgatecgttggtcctcgcgccagctteagacgcteatcccteactgetg3420gcgg皿朋gatgtgacagacgCg3CggCg3C皿gC皿3C3tgctgtgcgacgctggcgat3480ctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtecccgatt3540atccatcggtggatggagcgactegtteatcgcttccatgcgccgcagteacaattgetc3600atcgccagcagctccgaategcgcccttccccttgcccggcgttaatgat3660ttgcccaaac郷tcgctgaaatgcggctggtgegctteateegggegaaagaaccccgt3720attggc朋atattgaeggeeagtteagcc3ttratgeragteggegegeggacg皿3gte3780aacccactggtgateccattcgcgagcctceggatgaegaccgtagtgatgaatctctcc3840tggcggg雄cacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcac3900caccccctgaccgcg朋tggtgagattgagaatetaacctttcattcccagcggtcggtc3960tcgagateaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggc4020atte皿cgagtatcccggcagcaggggatcattttgegettcagccatecttttcatect4080cccgccattcagag4094〈210〉5〈211〉765〈212〉DNA〈213〉原始鹵醇脫鹵酶基因片段〈400〉5atgtcaaccgcaattgtaaccattttgggggaatggggtctgcacttcgt60ctctcggaagagtggcttgcC3Cg3tg^3gCttC^3C33皿gg3Cg^120cttgaagcctttgecgaaacctatccacaaCtC3皿CC^tgtCgg33C33g^CC3gCg180gaactcatcgaggcagttecctccgcttatggtc皿gttgatgtecttgtgagc^cgac240atettcgcaccagagttccaacccategata^tecgctgtegaggactetcgcggtgcg300gtcgaggcgcaccatttgeaCtggtC33CgCCgttgC33gtca皿tg^g360■gcgc^^geggacatettetctttattacctctgcaacgcccttcgggccttggaag420gaactttctacctacacgtc3gCCCg3gC3ggtgcatgcaccttggcaaatgccctttcg480■gg^ctcgcattceggtgttcgcaataggacccaattatcttcacagt540cctacttctaCCCC3C3g^ccgtgg^^Cg^tCC3g33C3CgttgCC600aagtcactgcgctccagcggtteggtecac3ga^g^ttgggag^ctc660gtcgcgtttctcgcgtctggtegttgtgactatctgaccggccaggtgttctggttggcc720ggcggattecc^tgatcgagcgttggcctggtetgcccgagteg76權(quán)利要求一種鹵醇脫鹵酶突變體基因，其包括序列SEQIDNO.1。2.—種由權(quán)利要求l所述的基因編碼的鹵醇脫鹵酶突變體，其具有序列SEQIDNO.2。3.—種生產(chǎn)權(quán)利要求2所述的鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中包含權(quán)利要求1所述的突變體基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌BL21，MC1061，和JM105中的一種。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的載體系統(tǒng)選自改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，其具有核苷酸序列SEQIDNO.3;所述改造后的pBAD，其具有核苷酸序列SEQIDNO.4。6.—種利用權(quán)利要求3所述的基因工程菌制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法，其特征在于包括以下步驟(a)構(gòu)建所述基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細(xì)胞，載體系統(tǒng)以及鹵醇脫鹵酶突變體基因；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養(yǎng)所述基因工程菌；(d)種子罐發(fā)酵所述基因工程菌；以及(e)收集和制備鹵醇脫鹵酶突變體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌BL21，MC1061，和JM105中的一種。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的載體系統(tǒng)選自改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，其具有核苷酸序列SEQIDNO.3;所述改造后的pBAD，其具有核苷酸序列SEQIDNO.4。9.根據(jù)權(quán)利要求68中任一項所述的方法，還包括在一定商業(yè)罐發(fā)酵條件下，進(jìn)行工業(yè)化制備所述鹵醇脫鹵酶突變體的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述商業(yè)罐發(fā)酵條件是DO20%以上，空氣流量1:l-4vvm，葡萄糖或者甘油的殘余含量為0.001。；-lQ;。11.根據(jù)權(quán)利要求35任一項所述的基因工程菌在鄰鹵醇脫鹵環(huán)氧化反應(yīng)中的應(yīng)用，所述底物的結(jié)構(gòu)式為其中A是選自由氫，低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，芳基和取代芳基組成的組中的任意一種取代基，R2是選自由低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，芳基，取代芳基和酯基組成的組中的任意一種取代基，X為Cl，Br或I。12.根據(jù)權(quán)利要求35任一項所述的基因工程菌在環(huán)氧化合物開環(huán)反應(yīng)中的應(yīng)用，所述環(huán)氧化合物的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ri、R2獨立地選自由氫，低級烷基，環(huán)烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環(huán)，雜芳基，芳基，取代芳基和酯基組成的組。全文摘要本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的基因工程菌，并且通過培養(yǎng)該基因工程菌和發(fā)酵工藝，使得鹵醇脫鹵酶的生產(chǎn)工業(yè)化。本發(fā)明還提供了該基因工程菌的應(yīng)用，由該基因工程菌生產(chǎn)出的鹵醇脫鹵酶可以應(yīng)用到鄰鹵醇脫鹵環(huán)氧化和環(huán)氧化物的開環(huán)反應(yīng)中。文檔編號C12N1/21GK101760468SQ20081018657公開日2010年6月30日申請日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者余華順,余明華,俞學(xué)鋒,姚鵑,李知洪,楊海珍,熊茂盛,石雨申請人:安琪酵母股份有限公司