專利名稱：：種質(zhì)系山農(nóng)495矮稈基因的微衛(wèi)星標(biāo)記定位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：種質(zhì)系山農(nóng)495矮稈基因的微衛(wèi)星標(biāo)記定位，屬于分子生物學(xué)和小麥種質(zhì)資源研究的重要領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：在上世紀(jì)60年代，由于人們大量施肥，導(dǎo)致作物倒伏，大大降低了全世界作物產(chǎn)量。直到一些矮稈和半矮稈抗倒伏品種的出現(xiàn)，使作物產(chǎn)量有了大幅度的提高，引起了一場舉世矚目的"綠色革命"(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，37(3):359362)。在小麥中，來自農(nóng)林10號的Rht-Blb和Rht-Dlb和日本赤小麥的Rht8和Rht9矮稈基因已經(jīng)被廣泛引用到全世界小麥品種中。矮化育種引起了育種家們的高度重視，已經(jīng)成為高產(chǎn)育種中的一條主要途徑[2]。在小麥矮稈基因分子標(biāo)記中，RFLP標(biāo)記應(yīng)用得最多，其次是SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記，RAPD標(biāo)記應(yīng)用得較少。Ellis等(TheoreticalandAppliedGenetics,2002，105:10381042)設(shè)計的Rht-Blb和Rht-Dlb的STS特異引物，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛用于這兩基因的材料鑒定；Korzun等(TheoreticalandAppliedGenetics,1998,96:1104-1109)篩選出了與Rht8緊密連鎖的標(biāo)記Xgwm261，同樣被各國的科學(xué)家用來鑒定Rht8基因；Rht-Blc、Rht-Dlc、Rht12矮稈基因也已經(jīng)被不同類型的標(biāo)記定位。但是矮稈基因分子標(biāo)記多數(shù)與基因間遺傳距離較大，連鎖不緊密，選擇的準(zhǔn)確性受到影響。雖然小麥的微衛(wèi)星研究起步相對較晚，但發(fā)展迅速。因此，繼續(xù)進行矮稈基因的標(biāo)記特別是SSR標(biāo)記意義重大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在二倍體粗山羊草(DD)和四倍體硬粒小麥(AABB)合成的雙二倍體Am6(AABBDD)與普通小麥濟南17雜交后代中選育出了一矮稈種質(zhì)系山農(nóng)495，對其矮稈基因進行SSR分子標(biāo)記定位，以期為該基因的進一步研究和標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1小麥材料試驗所用材料為小麥品系山農(nóng)289，株高95-105cm;矮稈種質(zhì)系山農(nóng)495株高55-60cm.(經(jīng)過濟南17與Am6雜交后經(jīng)兩代與濟南17回交選育)；山農(nóng)495和山農(nóng)289進行雜交獲得巳，巳自交獲得^;以及兩材料的回交群體[(山農(nóng)495X山農(nóng)289)X山農(nóng)495]。以上材料均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國家小麥改良中心泰安分中心創(chuàng)制和保存。1.1.2試劑和SSR引物PCRBuffer、dNTPs和Taq酶等均為大連寶生物工程公司產(chǎn)品。小麥SSR引物包括Xgwm、Wmc、Xgdm、BARC、CFA、CFD、EST-KSUM、EST-CWES、EST-DuPw系列的引物共1589對，所用引物序列和定位信息見http:〃wheat.pw.usda.gov，引物由上海生物工程公司合成，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國家小麥改良中心泰安分中心保存提供。1.2研究方法1.2.l田間種植和考種按照行長2.5m，行距0.3m，株距8cm，第一年種植2親本及雜交F^次年種植2親本、162株回交群體及304株F2群體。單株收獲考種，均參照全國小麥育種攻關(guān)協(xié)作組小麥良種區(qū)域試驗田間記載及室內(nèi)考種項目和標(biāo)準(zhǔn)。1.2.2F2群體株高劃分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)山農(nóng)289和山農(nóng)495株高特點，確定回交群體株高劃分標(biāo)準(zhǔn)為《69cm為矮稈株，>69cm為高稈株；確定山農(nóng)495/山農(nóng)289F2群體株高劃分標(biāo)準(zhǔn)為《69cm為矮稈株，69cm-90cm為中稈株，>90cm為高稈株。1.2.3總DNA提取采用酚-氯仿法(DevosK.M.，MillanT.，GaleM.D.。TheoreticalandAppliedGenetics,1993,85:784792)1.2.4SSR擴增PCR反應(yīng)總體積25ii1，由ddH2013.5ii1、10XPCRBuffer2.5ii1、25mMdNTPs0.2iil、30mMMg2+1.5iil、2iiMPrimerpair3.0ii1、5.0U/ii1Taq酶0.3ii1禾口20ng/y1模板DNA4.0ii1組成。擴增程序與Roder等(MolGenGenet，1995，246:327333)的相同。1.2.5電泳檢領(lǐng)lJ采用6%聚丙烯酰胺變性測序膠，玻璃板垂直電泳，恒定功率100w，1.5h，硝酸銀染色。1.5PSG(preferredsmallg麗p，優(yōu)選小群體)分析優(yōu)選小群體由IO株典型的高稈單株和IO株典型的矮稈單株組成，稍微不同于Michelmore等(ProcNatlAcadSciUSA，1991，88:98289832)提出的BSA(分離群體分組分析法)，不再將單株DNA混合，直接對20個單株進行PCR擴增和基因型檢測。尋找表現(xiàn)型(高矮性狀)和基因型(擴增帶型)基本一致的Marker,進一步在大的分離群體中進行驗證，計算標(biāo)記與基因之間連鎖遺傳距離(標(biāo)準(zhǔn)是在優(yōu)選小群體中估算的遺傳重組率低于40%)。1.6數(shù)據(jù)分析卡方檢驗(x2)用來確定分離群體中觀測值和理論期望值的擬合度。微衛(wèi)星標(biāo)記與抗病基因間的重組率用MAPMAKER/Expversion3.Ob(Cambridge,1993)進行計算，使用Kosambi(AnnEugen，1944，12:172175)作圖函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳距離(cM)，連鎖的標(biāo)記位點排序使用"sequence"和"compare"命令，LOD>3.0。最后用M即Draw，在EXCEL中繪制遺傳連鎖圖譜(劉仁虎等，遺傳，2003，25(3):317321)。2結(jié)果與分析2.1山農(nóng)495的株高遺傳特點對山農(nóng)495X山農(nóng)289的后代及2親本株高進行測量，平均株高為98.2cm，62.lcm，103.3cm;對[(山農(nóng)495X山農(nóng)289)X山農(nóng)495]的回交群體單株進行株高測量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有的162個單株中有79個單株為表現(xiàn)為矮稈，83個單株表現(xiàn)為高稈，經(jīng)x2檢驗，符合l:1分離比例(x2=0.0988<x2。。5—P>0.05);對山農(nóng)495X山農(nóng)289的F2群體測量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在304個單株中79個表現(xiàn)為矮稈，157個表現(xiàn)為中稈，68個表現(xiàn)為高稈，經(jīng)x2檢驗，符合l:2:l分離比例(x2=0.3225<x2。。5—P>0.05)。以上實驗結(jié)果表明山農(nóng)495所含矮稈基因?qū)χ旮呓档托?yīng)不太明顯，與山農(nóng)289相比雜種巳株高僅降低了5.lcm，降低率達到4.94%，因此我們可以推測此矮稈基因可能為一對主效隱性基因。4個標(biāo)記經(jīng)過xs檢驗也均符合理論分離比例。如表l所示2.2矮稈基因連鎖標(biāo)記的篩選選用1589個SSR引物對山農(nóng)495和山農(nóng)289進行基因組DNA多態(tài)性分析，共獲得502個多態(tài)性引物。經(jīng)BQ回交群體高矮DNA池的進一步篩選，選出4個引物對具有高矮池的多態(tài)性，它們分別是Gwml13、Wmc511、Wmc233及Dupw23，均定位在4B上。各引物于高矮池中電泳圖如說明書附圖所示(圖1、圖2、圖3、圖4)。表1SSR標(biāo)記和山農(nóng)495矮桿基因的相關(guān)和遺傳分析<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注P=0.05時差異顯著值x2=3.84，df=1;x2=5.99，df=2a表現(xiàn)型或基因型A.純合高稈；H.雜合型；B.純合矮稈b'A'和'H'單株數(shù)的總和，在MAPMAKER3.0中用默認(rèn)符號'D'表示2.3矮稈基因的標(biāo)記定位為了進一步檢測上述4個引物是否與矮稈基因連鎖，對回交群體162個單株和F2群體304個單株分別進行了PCR擴增、電泳分析和MAPMAKER3.0軟件遺傳距離計算分析。結(jié)果表明，在回交群體中，Gwml13、Wmc511、Wmc238及Dupw23與矮稈基因的連鎖距離分別為3.9cM、5.2cM、11.lcM、21.6cM，如圖5(a);將以上4個引在F2群體群體中進一步分析，記過顯示Gwml13、Wmc511、Wmc238及Dupw23與矮稈基因的連鎖距離分別為4.lcM、5.OcM、10.7cM、19.8cM，與回交群體計算結(jié)果相差不大，基本一致。如圖5(b)。3討論目前研究表明，位于4B染色體上的隱性矮稈基因有Rht-Blb和Rhtls兩個，本研究的矮稈基因也定位在4B染色體上，而且經(jīng)過查看小麥4B圖譜發(fā)現(xiàn)，在位點上與Rht-Blb位置大致相同；從山農(nóng)495的兩個親本濟南17和Am6看，經(jīng)追查系譜可知，濟南17含有Rht-Blb基因，而Am6不含，兩親本均不帶有Rhtls基因；運用Ellis等鑒定Rht-Blb基因方法，利用引物BF-MR1和BF-WR1進行鑒定并未發(fā)現(xiàn)237bp的多態(tài)性片段；因此，我們可以推測山農(nóng)495上的矮稈基因有可能是一個新基因。本研究獲得的與山農(nóng)495中的矮稈基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記Gwml13和Wmc511分別距離4.0cM和5.lcM左右，遺傳距離較近，可以用于山農(nóng)495中矮稈基因的標(biāo)記輔助選擇；山農(nóng)495作為一個新矮源是個新基因，可能來自Am6，也有可能是由自然突變產(chǎn)生的，我們暫時定名為RhtSn495。小麥株高和抗倒伏遺傳改良中具有一定的利用價值。圖1引物Gwml13在回交群體10個典型高稈單株和10個典型矮稈單株中的擴增結(jié)果1-10.矮稈單株11-20.高稈單株A.山農(nóng)289B.山農(nóng)495M.Marker圖2引物Wmc511在BCJO個典型高稈單株和10個典型矮稈單株中的擴增結(jié)果1-10.矮稈單株11-20.高稈單株A.山農(nóng)289B.山農(nóng)495M.Marker圖3引物Wmc238在BCJ0個典型高稈單株和10個典型矮稈單株中的擴增結(jié)果1-10.矮稈單株11-20.高稈單株A.山農(nóng)289B.山農(nóng)495M.Marker圖4引物DuPw23在BCJ0個典型高稈單株和10個典型矮稈單株中的擴增結(jié)果1-10.矮稈單株11-20.高稈單株A.山農(nóng)289B.山農(nóng)495M.Marker圖5在小麥染色體4B上矮稈基因在(a)和F2(b)上的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳連鎖圖譜具體實施方式1.1材料1.1.1小麥材料試驗所用材料為小麥品系山農(nóng)289，株高95-105cm;矮稈種質(zhì)系山農(nóng)495株高55-60cm.(經(jīng)過濟南17與Am6雜交后經(jīng)兩代與濟南17回交選育)；山農(nóng)495和山農(nóng)289進行雜交獲得巳，巳自交獲得^;以及兩材料的回交群體[(山農(nóng)495X山農(nóng)289)X山農(nóng)495]。以上材料均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國家小麥改良中心泰安分中心創(chuàng)制和保存。1.1.2試劑和SSR引物PCRBuffer、dNTPs和Taq酶等均為大連寶生物工程公司產(chǎn)品。小麥SSR引物包括Xgwm、Wmc、Xgdm、BARC、CFA、CFD、EST-KSUM、EST-CWES、EST-DuPw系列的引物共1589對，所用引物序列和定位信息見http:〃wheat.pw.usda.gov，引物由上海生物工程公司合成，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國家小麥改良中心泰安分中心保存提供。1.2研究方法1.2.l田間種植和考種按照行長2.5m，行距0.3m，株距8cm，第一年種植2親本及雜交F^次年種植2親本、162株回交群體及304株F2群體。單株收獲考種，均參照全國小麥育種攻關(guān)協(xié)作組小麥良種區(qū)域試驗田間記載及室內(nèi)考種項目和標(biāo)準(zhǔn)。1.2.2F2群體株高劃分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)山農(nóng)289和山農(nóng)495株高特點，確定回交群體株高劃分標(biāo)準(zhǔn)為《69cm為矮稈株，>69cm為高稈株；確定山農(nóng)495/山農(nóng)289F2群體株高劃分標(biāo)準(zhǔn)為《69cm為矮稈株，69cm-90cm為中稈株，>90cm為高稈株。1.2.3總DNA提取采用酚-氯仿法(DevosK.M.，MillanT.，GaleM.D.TheoreticalandAppliedGenetics,1993,85:784792)1.2.4SSR擴增PCR反應(yīng)總體積25ii1，由ddH2013.5ii1、10XPCRBuffer2.5iil、25mMdNTPs0.2iil、30mMMg2+1.5iil、2iiMPrimerpair3.0ii1、5.OU/ii1Taq酶0.3ii1禾口20ng/y1模板DNA4.0ii1組成。擴增程序與Roder等(MolGenGenet，1995，246:327333)的相同。1.2.5電泳檢測采用6%聚丙烯酰胺變性測序膠，玻璃板垂直電泳，恒定功率100w，1.5h，硝酸銀染色。1.5PSG(preferredsmallg麗p，優(yōu)選小群體)分析優(yōu)選小群體由IO株典型的高稈單株和IO株典型的矮稈單株組成，稍微不同于Michelmore等(ProcNatlAcadSciUSA，1991，88:98289832)提出的BSA(分離群體分組分析法)，不再將單株DNA混合，直接對20個單株進行PCR擴增和基因型檢測。尋找表現(xiàn)型(高矮性狀)和基因型(擴增帶型)基本一致的Marker,進一步在大的分離群體中進行驗證，計算標(biāo)記與基因之間連鎖遺傳距離(標(biāo)準(zhǔn)是在優(yōu)選小群體中估算的遺傳重組率低于40%)。1.6數(shù)據(jù)分析卡方檢驗(x2)用來確定分離群體中觀測值和理論期望值的擬合度。微衛(wèi)星標(biāo)記與抗病基因間的重組率用MAPMAKER/Expversion3.Ob(Cambridge,1993)進行計算，使用Kosambi(AnnEugen，1944，12:172175)作圖函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳距離(cM)，連鎖的標(biāo)記位點排序使用"sequence"和"compare"命令，LOD>3.0。最后用M即Draw，在EXCEL中繪制遺傳連鎖圖譜(劉仁虎等，遺傳，2003，25(3):317321)。權(quán)利要求本研究獲得的與山農(nóng)495中的矮稈基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記Gwm113和Wmc511分別距離4.0cM和5.1cM左右，遺傳距離較近，可以用于山農(nóng)495中矮稈基因的標(biāo)記輔助選擇；山農(nóng)495作為一個新矮源在小麥株高和抗倒伏遺傳改良中具有一定的利用價值。全文摘要本發(fā)明的目的是在二倍體粗山羊草(DD)和四倍體硬粒小麥(AABB)合成的雙二倍體Am6(AABBDD)與普通小麥濟南17雜交后代中選育出了一矮稈種質(zhì)系山農(nóng)495，對其矮稈基因進行SSR分子標(biāo)記定位，以期為該基因的進一步研究和標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。文檔編號C12Q1/68GK101736075SQ200810160540公開日2010年6月16日申請日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者朱玉麗申請人:朱玉麗