專利名稱：多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其應用的制作方法
多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其應用(一) 發(fā)明領域本發(fā)明涉及植物與動物多基因表達載體的構(gòu)建方法及其應用，具體涉及多 基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其在多基因表達載體構(gòu)建中的應 用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領域。(二) 技術(shù)背景自1984年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草(Herrera W W， 1984)以來，基因轉(zhuǎn)化技 術(shù)已廣泛應用于動、植物的遺傳改良中。轉(zhuǎn)基因技術(shù)克服了植物有性雜交的限 制，可將來源于不同物種甚至人工合成的基因?qū)胫参铮瑥亩牧贾参镄誀睿?培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物新品種?？茖W家們迄今已成功的創(chuàng)造了抗除草劑(VasiWa/， 1992; Wan e"/， 1994; Denise e"/， 1999)、抗病蟲害(Perlak e"入1990; Wilson " a人1993)、抗逆(Sheveleva " 1990; Fumjimoto "a/, 1993; Shen a/， 1997)、延遲果實成熟(0eller a7， 1991; Hamiton W a7， 1992; Picton W a/， 1993)、雄性不育(Mariani a/, 1990)及作為生物反應器 (Gasser W W 1989)等具有新性狀的轉(zhuǎn)基因植物，它們中絕大多數(shù)是通過單個 目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化而獲得的。然而在自然界中，生物的發(fā)育調(diào)控、代謝以及 生物的適應性與抗逆性等生物性狀常常是由多個基因共同控制的，需要多個相 關(guān)基因的協(xié)同表達，因此為了更有效的研究與改良生物性狀，將多個基因轉(zhuǎn)化 到同一生物中進行表達，就顯得勢在必行。多基因轉(zhuǎn)化的策略必將成為今后基 因工程在基礎理論與實際應用研究中的主流方向(李寶健等，2004 )。現(xiàn)在已有的多基因聚合方法主要包括雜交法(sexual crossing. Hitz W a/, 1999 )、多個表達載體多次轉(zhuǎn)化法也稱連續(xù)再轉(zhuǎn)化法(sequential re-transformation. Hird W W ， 1992)、 多個表達載體的共轉(zhuǎn)化法(co-transformation. Leszek e"/ ， 1989)等,雖然都有成功的先例，但大 都費時費力，共轉(zhuǎn)化頻率低，而且需要多種篩選標記基因，并存在著后代中目 的基因分離、重組等問題。為了克服以上問題，近年來研究者大都選擇多基因 單表達載體一次性轉(zhuǎn)化法，通過多個基因一個表達載體的方法一次性轉(zhuǎn)化植物， 從而獲得多基因聚合的轉(zhuǎn)基因植物，成功效率較高(Halpin W a/， 2005 )。目 前將多個基因克隆到同一個表達載體上主要釆取兩種途徑， 一是直接將多個基 因融合克隆到表達載體上(多聚蛋白酶法。Honee W s7， 1990)， 二是將多個 目的基因用表達結(jié)構(gòu)隔開(獨立表達盒法)。而后一種方法因避免了表達的多聚 融合蛋白失活等問題而更具優(yōu)勢。但由于多克隆位點上內(nèi)切酶位點是有限的， 并且按序排列，再加上載體或目的基因上酶切位點的影響，使得研究者不能按 需要連入多個基因，制約了多基因載體的構(gòu)建。為了避免酶切位點的限制，目 前開發(fā)的多基因單表達載體一次性轉(zhuǎn)化法主要包括借助稀有歸巢內(nèi)切酶的方法(Goderis et al， 2002 )、利用Cre/"xP重組系統(tǒng)的方法(Line"/, 1999)及 基于Gateway技術(shù)的方法(Chen W a/ , 2006)。雖然這些方法在一定程度上解 決了利用傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶所面臨的問題，但是由于其成本高，步驟繁瑣等 因素而使其應用推廣受到限制。因此，開發(fā)一種低成本、簡單易用的多基因聚合技術(shù)，是百前科學研究與 基因工程改良動、植物的生產(chǎn)實踐中所期待解決的技術(shù)難題。
發(fā)明內(nèi)容
l.本發(fā)明目的本發(fā)明的目的是發(fā)明一種多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其 在多基因表達載體構(gòu)建中的應用，即構(gòu)建一個含有特定啟動子與終止子的多基 因聚合輔助載體，-啟動子的上游為同尾酶X特定識別序列，終止子的下游為同尾酶X和Y的特定識別序列，啟動子和終止子之間為多克隆位點(MCS)。利用 同尾酶酶切后可獲得相同的粘性末端，所得DNA片段經(jīng)重組連接后，重組位點 上的原酶切位點消失而不能再被原同尾酶切開的原理，借助該輔助載體，只用 一對同尾酶X和Y即可解決多基因表達載體的構(gòu)建難題，為科學研究與轉(zhuǎn)基因 技術(shù)改良動、植物的生產(chǎn)實踐提供了一種簡單、易用、低成本的多基因表達載 體構(gòu)建的新方法。2.本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)與過程輔助載體pCR35STnos構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)輔助載體pCR35STnos構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)特征是該載體上待建基因表達盒的兩 端含有一對同尾酶的特異識別序列結(jié)構(gòu)，即5'-同尾酶X-啟動子-MCS-終止子-同尾酶Y-同尾酶X-3' ,其中X與Y為任意一對同尾酶，啟動子和終止子分別 為任意所需啟動子和終止子，MCS為多克隆位點。輔助載體pCR35STnos構(gòu)建包括以下步驟(1) 首先設計合成含有多個酶切位點的兩段單鏈核苷酸序列，分別為 片段l: 5' -AGCTTCTAGAGCTCAGGATCCGAATTCCTAGGTCTAGAGGGCC-3' 片段2:5' —CTCTAGACCTAGGAATTCGGATCCTGAGCTCTAGA -3'(2) 經(jīng)變性退火獲得5'末端帶有限制性內(nèi)切酶W/2din的粘性末端、3'末端帶有限制性內(nèi)切酶^oal的粘性末端、中間依次帶有1&1、 S"I、 fcdll、 J&I限制性內(nèi)切酶酶切位點的多克隆位點序列(MCS)。(3) 利用^//7dlII和^7al限制性內(nèi)切酶酶切位點，將該MCS重組到質(zhì)粒 pCR2. 1-T0P0 ( invitrogen)上，得到質(zhì)粒pCRMCS (約3. 9kb )(圖1 )。(4 ) 與AcoRI酶切載體pCB302-l ( Xiang et al， 1999 ),獲得CamV 35S 啟動子(大約900bp)，與同樣經(jīng)過&cl與AcoRI酶切后的pCRMCS重組，獲得pCR35S (約4, 8kb )過渡載體(圖2 )。(5 )以pCB302-l ( Xiang et al， 1999 )為模板，以5' -tac tcg agg etc gaa ttt ccc cga tc-3' 與-aac gac ggc cag tga att-3'為弓l物擴增出 300bp的DNA片段(即Tnos終止子)，克隆到pGEM-T Easy載體上，經(jīng)測序正 確后，AcoRI酶切回收，與同樣經(jīng)過&oRI酶切并去磷酸化的pCR35S連接，獲 得上游帶35S啟動子，下游帶Tnos終止子，兩者之間為多克隆位點序列的輔助 載體pCR35STnos (-Wal-P35S-MCS-Tnos-W/ I-i^1-) (5. lkb)。多克隆位點序 列包含&力I、戶WI、 勘/hHI、 5toal、和fcoRI等酶切位點(圖3 )。pCR35STnos輔助載體在多基因表達載體構(gòu)建中的應用利用pCR35STnos輔助載體可輕松完成多基因表達載體的構(gòu)建。其關(guān)鍵技術(shù) 特征是首先將目的基因分別亞克隆到該輔助載體的MCS上，獲得相應基因表達 盒。然后利用同尾酶X從一輔助載體上酶切獲得的基因表達盒1可重組到另一 輔助載體上基因表達盒2下游的Y同尾酶酶切位點上，而獲得的新重組載體上 仍保留"-X—Y-X-"這一結(jié)構(gòu)特點，從而實現(xiàn)多基因表達盒的聚合。最后用X 或其它限制性內(nèi)切酶酶切下多基因表達盒，重組到表達載體中，獲得多基因表 達載體。即首先將目的基因l、 2、 3......分別亞克隆到該輔助載體的MCS上，獲得相應帶有目的基因的重組質(zhì)粒pCRECl (-X-啟動子-基因l-終止子-Y-X-)、 pCREC2 (-X-啟動子-基因2-終止子-Y-X-)、 pCREC3 (-X-啟動子-基因3-終止子 -Y-X-)......。由于X和Y是同尾酶，二者酶切后可獲得相同的粘性末端，而所連接后生成的序列卻不能再被X或Y切開，所以X酶切pCREC2得到基因表達盒 EC2 (-啟動子-基因2-終止子-Y-)，可以克隆到pCRECl的Y酶切位點上，獲得 帶有兩個基因表達盒的新重組質(zhì)粒pCR(-X-EC1-EC2-Y -X-)。新重組質(zhì)粒上原 pCRECl上的Y酶切位點消失，由于新連入的EC2基因表達盒3'末端帶有Y酶切位點，從而在新質(zhì)粒上又獲得一個新Y酶切位點。于是可以再重組由同尾酶X 從pCREC3質(zhì)粒酶切而來的第三個基因表達盒EC3。利用這種方式，可以依次連 入多個基因表達盒。最后用X或其它限制性內(nèi)切酶從該輔助載體上酶切下構(gòu)建 好的包含多個基因表達盒的DNA片段，連接到表達載體上，從而獲得包含多個 基因表達盒的表達載體。輔助載體pCR35STnos的進一步改良方法輔助載體pCR35STnos最重要的特征是充分利用了同尾酶X與Y識別序列的 特殊排列方式"-X—Y-X-",從而只利用X與Y這兩個同尾酶就可以實現(xiàn)多個基 因表達盒的聚合。在使用過程中，可根據(jù)目的基因上酶切位點的具體情況靈活 選擇替換輔助載體上的同尾酶?？捎猛裁负芏?，如J&I除了與W/ I是一對 同尾酶外，它們還與^el和順el互為同尾酶?？?z 肌與^^/n, 與J/尸el等也是常用的同尾酶，此外也可以根據(jù)Gateway克隆方法的原理，在MCS上添 加一段cc必基因和a"位點序列片段，從而徹底解決基因亞克隆過程中酶切位 點的問題，增加該輔助載體的適用范圍。同時可以通過更換輔助載體pCR35STnos 上的啟動子與終止子，進一步擴大該輔助載體的適用范圍。3.發(fā)明效果本發(fā)明開發(fā)了一種新型多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其在 多基因表達載體構(gòu)建中的應用方法，利用輔助載體pCR35STnos構(gòu)建多基因表達 載體的方法，成功解決了多基因表達載體構(gòu)建難題，為今后科學研究與轉(zhuǎn)基因 技術(shù)改良動、植物的生產(chǎn)實踐提供了一種簡單、易用、靈活、高效、低成本的 多基因表達載體構(gòu)建的新方法。

圖l:載體pCRMCS構(gòu)建示意2:載體pCR35S構(gòu)建示意3 :輔助載體pCR35STnos的獲得圖4 : Xbal酶切驗證輔助載體pCR35STnos圖5: GUS基因的亞克隆圖6: GFP基因的亞克隆圖7: BAR基因的亞克隆圖8:帶有GUS, GFP及BAR三個基因表達盒的輔助載體pCRGUSGFPBAR (pCR3EC)的構(gòu)建圖9: Xbal分別酶切pCRGUS, pCRGUSGFP和pCRGUSGFPBAR驗證 圖10: 植物表達載體pCambia3EC PCR擴增檢測圖1中1是合成兩段依次帶有#//7dIII、 J6al、 Sacl、 fcoRI、 A//2l、 J&I、 等限制性內(nèi)切酶位點的單鏈DNA片段。等摩爾比混合后退火形成雙鏈DNA片段。2是用#// dIII和Jpal雙酶切的載體pCR2. l-T0P0。3是將雙鏈DNA片段與上述酶切載體pCR2. 1-T0P0連接，獲得依次帶有〃/"(1111、 J&I、 5"acl、 fcdll、汐// 1、 "al、 J/)sI等限制性內(nèi)切酶位點的新載體pCRMCS。圖2中4是i^cl與化oRI酶切載體pCB302-1,得到35S啟動子。 5是5^1與fcoRI酶切載體載體pCRMCS。6是將上述所得35S啟動子與酶切載體pCRMCS連接，獲得新的載體pCR35S。圖3中7是fcoRI酶切載體pCR35S。8是fcoRI酶切PCR獲得的Tnos終止子。9是Tnos終止子與酶切載體pCR35S連接，獲得新的載體pCR35STnos。圖4中M是DNA分子量標記DL2000。10是質(zhì)粒pCR2. 1-T0P0骨架片段。 11是35S/MCS/Tnos片段。 圖5中12是酶切的輔助載體pCR35STnos。13是5WI和JAW酶切pMDGUS得到(7M基因片段。 14是6^S"基因片段與酶切的輔助載體pCR35STnos連接，獲得帶有 6Y/5"基因表達盒的新載體pCR35S/GUS/Tnos。圖6中12是酶切的輔助載體pCR35STnos。15 和酶切pMDGFP得到6T^基因片段。16 67 基因片段與酶切的輔助載體pCR35STnos連接，獲得帶有 6T^基因表達盒的新載體pCR35S/GFP/Tnos。圖7中12是酶切的輔助載體pCR35STnos。17是酶切pMDBAR得到W/ 基因片段。 18是Wv 基因片段與酶切的輔助載體pCR35STnos連接，獲得帶 有WW基因表達盒的新載體pCR35S/BAR/Tnos。圖8中以5//7l酶切pCR35S/GUS/Tnos 19為接受載體，與經(jīng)過酶 切pCR35S/GFP/Tnos后得到的35S/GFP/Tnos片段20連接。獲得帶有 35S/GUS/T謂和35S/GFP/Tnos兩個表達盒的新質(zhì)粒pCRGUSGFP 21。以飽I 酶切并去磷酸化的pCRGUSGFP為接受載體，與經(jīng)過T&I酶切pCR35S/BAR/Tnos 后得到的35S/BAR/Tnos片段22連接，獲得帶有35S/GUS/Tnos、 35S/GFP/Tnos和35S/BAR/Tnos三個表達盒的新質(zhì)粒pCRGUSGFPBAR 23。 圖9中M是DNA分子量標記DL15000。 24是pCRGUS。 25是pCRGUSGFP。 26是pCRGU，GFPBAR。 圖10中M是DNA分子量標記DL2000。 27是GUS片段。 28是GFP片段。 29是BAR片段。 具體實施方式
實施例l:輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建 輔助載體骨架的來源輔助載體pCR35STnos的骨架來源于invitrogen的克隆載體pCR2. l-TOPO (3. 9kb)。此克隆載體含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neomycin Phosphotransferase n,/7^/"和抗氨節(jié)的標記基因，帶有M13(-48)、 M13 (-47)和T7啟動子測序 引物，方便亞克隆的測序。多克隆位點序列(MCS)人工合成及與pCR2. l-TOPO連接的步驟如下(圖1):(1) 設計兩段單鏈核苷酸序列，分別為片段l: 5' -AGCTTCTAGAGCTCAGGATCCGAATTCCTAGGTCTAGAGGGCC-3' 片段2:5' -CTCTAGACCTAGGAATTCGGATCCTGAGCTCTAGA -3'。委托上海生 物工程公司合成。(2) 將合成的兩段單鏈核酸片段等摩爾比混合，95C水浴變性2分鐘，然后 自然冷卻到室溫，獲得5'末端帶有限制性內(nèi)切酶W/7d111的酶切粘性末端、3'末端帶有限制性內(nèi)切酶^^1的酶切粘性末端、中間依次帶有X&I、 Acl、 化ORI、》/"1、 Z&I限制性內(nèi)切酶酶切位點的多克隆位點序列。(3) 利用#//7dIII和^ al限制性內(nèi)切酶酶切pCR2. 1-T0P0, 37。C酶切1.5 小時，回收線性化pCR2. l-T0P0質(zhì)粒。(4) T4連接酶16。C連接MCS與回收的線性化pCR2. 1-T0P0質(zhì)粒12小時， 得到重組質(zhì)粒pCRMCS (約3. 9kb )。,輔助載體pCR35STnos的獲得與五coRI 37。C酶切載體pCB302-1 (Xiang et al， 1999 ) 1. 5小時， 凝膠電泳回收大約900bp的片段，即35S啟動子。用Acl與fcoRI 37。C酶酶切 pCRMCS,用T4連接酶連接回收的線性化pCRMCS質(zhì)粒與35S啟動子，獲得pCR35S (約4. 8kb)過渡載體(圖2)。以pCB302-l為模板，以5' -tac tcg agg etc gaa ttt ccc cga tc-3' 與-aac gac ggc cag tga att-3'為引物，94。C熱變性30秒，56。C復性30 秒，72。C延伸40秒，35循環(huán)，擴增出300bp的DNA片段，即Tnos終止子，將 Tnos終止子克隆到pGEM-T Easy載體上。經(jīng)測序驗證后，fcoRI酶切回收，與 同樣經(jīng)過化dll酶切并去磷酸化的線性pCR35S載體連接，獲得上游帶35S啟動 子，下游帶Tnos終止子，兩者之間為多克隆位點序列的輔助載體pCR3SSTnos (-J&I-P35S-MCS-Tnos-W/2l-J6al-)。輔助載體pCR35STnos大小約5. lkb,多 克隆位點序列包含&力I、 A"、 5WI、 A/hHI、 S鵬I、 J力oI和&dlI等酶切位 點(圖3 )。輔助載體pCR35STnos的酶切鑒定J&I酶切輔助載體pCR35STnos后，通過凝膠電泳來檢測，獲得大約3. 9kb 和1. 2kb大小的目的片段，分別為質(zhì)粒pCR2. 1-T0P0骨架片段和35S/MCS/Tnos片段(圖4),證明輔助載體pCR35STnos構(gòu)建正確。實施例2:利用pCR35STnos輔助載體構(gòu)建包含CM與CF戶報告基因及AW 篩選標記基因的3基因表達盒的植物表達載體CY^、 C戶、A^基因的亞克隆首先分別以pBI121，pMD18T-GFP和pAHC25為模板分別PCR克隆^A5( 1. 9kb )、 " ( 800bp)和WA ( 540bp)基因片段，并分別亞克隆到pMD18-T載體上，經(jīng) 測序驗證正確后，用iWI和i7 o1在37。C下雙酶切分別帶有目的基因的pMD18-T 載體2小時，將獲得的基因片段分別連接到經(jīng)過i7^1酶切并去磷酸化的輔助載 體pCR35ST謂，得到相應重組載體pCR35S/GUS /Tnos (簡稱pCRGUS )(圖5 )、 pCR35S/GFP /Tnos (簡稱pCRGFP )(圖6 )及pCR35S/BAR /Tnos (簡稱pCRBAR ) (圖7)。輔助載體pCRGUSGFPBAR的組裝(圖8 )(1) X&I酶切輔助載體pCR35S/GFP/Tnos獲得35S/GFP/Tnos片段，與用 單酶切并去磷酸化的pCR35S/GUS/Tnos載體在T4連接酶催化下連接，溫度16°C，時間12小時。獲得帶有35S/GUS/Tnos和35S/GFP/Tnos兩個基因表達盒 的新載體pCRGUSGFP。原輔助載體上的W/2/酶切位點由于連入新的片段而消失， 新載體上由于新連入的35S/GFP/Tnos片段末端含有W/ I酶切位點而重新獲得 一個新的酶切位點，從而可以繼續(xù)進行下一輪的基因連接。(2) 同樣方式，用Wal酶切pCR35S/BAR/Tnos獲得35S/BAR/Tnos片段， 與用單酶切并去磷酸化的新載體pCRGUSGFP重組連接，獲得帶有 35S/GUS/Tnos和35S/GFP/Tnos及35S/BAR/Tnos三個基因表達盒的新載體 pCRGUSGFPBAR。并且該輔助載體上還帶有一個酶切位點，可以繼續(xù)進行下 一輪的基因連接。輔助載體pCRGUSGFPBAR酶切鑒定pCRGUS、 pCRGUSGFP和pCRGUSGFPBAR在基因表達盒的兩端都各有J&I酶切 位點。經(jīng)J&I酶切后通過凝膠電泳來檢測，分別獲得大約3. lkb、 5. lkb和6. 8kb 大小的目的片段，表明輔助載體pCRGUSGFPBAR構(gòu)建正確。(圖9)植物表達載體的構(gòu)建pCambia2300 ( 8. 7kb),帶有一個卡那霉素細菌篩選標記基因，T-DNA上帶 有一個新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neomycin Phosphotransferase II, ";^/7)植物篩選 基因，來自pUC18的多克隆位點上帶有一個1&1酶切位點(www.cambia.org)。I&I酶切輔助載體pCRGUSGFPBAR,獲得包含3個基因表達盒的基因片段， 與J&I酶切并去磷酸化的植物表達載體pCambia2300重組連接，獲得包含兩個 報告基因WM、 670和一個篩選標記基因的三基因表達盒的植物表達載 體，命名為pCambia3EC。pCambia3EC植物表達載體驗證以pCambia3EC為模板，分別用ftty、 C尸尸和WA基因的上下游引物PCR擴 增目的基因片段，凝膠電泳檢測目的基因，分別得到750bp、 750bp和460bp的 目的帶，證明表達載體中已經(jīng)連接上^^、 6T^ 和3個基因(圖10)。pCambia3EC植物表達載體轉(zhuǎn)擬南芥表達驗證通過根癌農(nóng)桿菌GV3101分別轉(zhuǎn)化到擬南芥中，用除草劑Basta進行初步篩 選，用RT-PCR分別檢測到CM、 C尸尸和似v 三個基因的表達，并通過"M染色 鑒定及"？熒光檢測實驗檢測到了 CM、 W 報告基因的表達，證明利用多基因 聚合輔助載體pCR35STnos構(gòu)建多基因表達載體的方法實踐上是完全可行性的。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其應用，其特征在于多基因聚合輔助載體pCR35STnos上待建基因表達盒的兩端含有一對同尾酶的特異識別序列結(jié)構(gòu)，即“5′-同尾酶X-啟動子-MCS-終止子-同尾酶Y-同尾酶X-3′”，其中X與Y為任意一對同尾酶，啟動子和終止子分別為任意所需啟動子和終止子，MCS為多克隆位點。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及 其應用，其特征是首先將目的基因分別亞克隆到該輔助載體的MCS上，獲得相 應基因表達盒。然后用同尾酶X酶切輔助載體獲得基因表達盒l(wèi),并重組到帶有 基因表達盒2的輔助載體的Y同尾酶酶切位點上，獲得含有兩個基因表達盒的 輔助載體，而新獲得的輔助載體上仍保留"-X--Y-X-"這一結(jié)構(gòu)特點。同理可 以將多個基因表達盒聚合到該輔助載體上。最后用X或其它限制性內(nèi)切酶酶切 下多基因表達盒，重組到表達載體中，獲得包含有多個基因表達盒的表達載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其 應用，其特征在于利用一對同尾酶i^I和5/M,以pCR2. 1-T0P0 ( invitrogen) 為骨架，選用CamV 35S啟動子和Tnos啟動子，構(gòu)建了多基因聚合輔助載體 pCR35STnos (-J&I-P35S-MCS-Tnos-"7"I-) ( 5. lkb )， MCS多克隆位點序 列包含&力I、尸"I、 iWI、 "a/7zHI、 5"鵬I、 J力oI和fcoRI等酶切位點。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其 應用，其特征在于可根據(jù)目的基因上酶切位點的具體情況靈活選擇更換輔助載 體上的同尾酶?？捎猛裁负芏啵鏙&I與W刀I是一對同尾酶外，另外它們還 與分el和順el互為同尾酶；A/z M與勘/11, &0/ 1與#/^1等也是常用的同尾酶。 此外也可以根據(jù)Gateway克隆方法的原理，在MCS上添加一段ccc^基因和a〃位點 序列片段，從而徹底解決基因亞克隆過程中酶切位點的問題。
全文摘要
本發(fā)明涉及多基因聚合輔助載體pCR35STnos的構(gòu)建方法及其應用。輔助載體pCR35STnos的技術(shù)特征是含有“5′-X-啟動子-MCS-終止子-Y-X-3′”表達盒，其中X與Y互為同尾酶，MCS為多克隆位點。輔助載體pCR35STnos的應用特征是首先將各目的基因分別亞克隆到該輔助載體的MCS上，獲得相應基因表達盒。然后用同尾酶X酶切輔助載體獲得基因表達盒1，并重組到帶有基因表達盒2的輔助載體的Y同尾酶酶切位點上，獲得含有兩個基因表達盒的輔助載體。同理可以將多個基因表達盒聚合到該輔助載體上。最后用X或其它限制性內(nèi)切酶酶切下多基因表達盒，重組到表達載體中，獲得多基因表達載體。
文檔編號C12N15/66GK101402967SQ20081016011
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者亓寶秀, 孫全喜, 李新征 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學