專利名稱：小麥抗白粉病基因復壯30的ssr標記及其獲得方法
技術領域：
本發(fā)明小麥抗白粉病基因復壯30的SSR標記及其獲得方法，提供了與小麥 抗白粉病基因復壯30緊密連鎖的分子標記，屬于作物遺傳育種學領域?？梢杂?效用于復壯30的跟蹤檢測和標記輔助育種。
二背景技術：
由專性寄生真菌小麥白粉菌引起的小麥白粉病是危害小麥生產(chǎn)的一種世界 性病害。小麥白粉菌具有小種多、變異快、適應范圍廣等特點，小麥生產(chǎn)中使 用抗性基因時，白粉菌群體往往會因寄主抗性基因的選擇作用而發(fā)生協(xié)同進化， 克服抗性基因，導致病害大流行(植物病理學報，1995， 25: 116)。近年來白粉 病在我國各大麥區(qū)常有發(fā)生和流行，危害程度日趨嚴重，已成為影響和限制小 麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的一大障礙?；瘜W防治白粉病雖有一定成效，但需花費大量的人 力、物力，而且還會引起環(huán)境污染等生態(tài)問題。培育和推廣抗病品種被公認為 是防治小麥白粉病最經(jīng)濟、有效、安全的途徑(張增艷等2002中國農(nóng)業(yè)科學,2002, 35(7) :789-793)。隨著分子標記技術的產(chǎn)生和不斷發(fā)展完善，利用分子標記技術 標記抗病基因，并用于標記輔助育種已成為篩選抗病基因聚合體、選育抗病品 種的有效方法(張慶利等2004 Agricultural Science in China, 2004， 3(6): 409-415)。而建立與抗病基因緊密連鎖的分子標記，是進行分子標記輔助育種的 基礎。尋找基因分子標記的最常用方法之一是Michelmore(1991 /Voce饑iV"f""/. JowfeWc.&z>we.t/5^,.1991， 88: 9828-9832)提出的分離群體分組分析法(BSA)。在小麥中，SSR已被證實是一種非常有效的分子標記，它與其 它標記技術相比能檢測到更高的多態(tài)性(Roder等1995 Mol.Gen.Genet. 1995, 248:163-167)。
小麥品種復壯30是由陜西涇惠農(nóng)場從涇陽30系統(tǒng)選育而成，它攜帶的抗 白粉病基因?qū)Ξ斍拔覈鞔篼渽^(qū)流行的小麥白粉菌優(yōu)勢小種表現(xiàn)高抗或免疫， 本研究經(jīng)田間和溫室抗性鑒定，證明其對白粉病的抗性達到高抗至免疫水平， 因此是小麥抗白粉病育種中的一個優(yōu)良抗源。該基因已被定位到7B染色體上， 現(xiàn)己被定名為戶m5e。目前，已報道的尸m^基因的SSR標記的研究報道較少。 而與其緊密連鎖的分子標記還未見報道。
本研究利用F2分離群體分組法(BSA)對抗白粉病基因復壯30進行了 SSR 標記分析，尋找與復壯30連鎖的SSR標記。
本研究以復壯30、感病品種Chancellor為材料，配制雜交組合復壯 30xChancellor，獲得雜種F,， Fi代自交，獲得F2分離群體。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是:提供了與小麥抗白粉病基因復壯30緊密連鎖的分子標記， 有效用于復壯30的跟蹤檢測和標記輔助育種；而且利用該分子標記在早代就可 以進行選擇，提高選擇的準確性，縮小育種群體，并且不受環(huán)境、生長季節(jié)的 限制，結合加代技術能大大縮短育種年限、提高育種效率。
1、小麥抗白粉病基因復壯30的SSR標記，其特征在于.'
采用已定位在7B染色體上的56對SSR引物分析結果表明，8個引物能在
親本間穩(wěn)定的揭示多態(tài)性差異，3個引物Xwmc364 、 Barc065和Xwmc517在
抗、感親本，抗、感池間和F2分離群體的抗、感單株間擴增出特異 帶，經(jīng)5 次以上重復擴增，結果穩(wěn)定。3對引物所擴增的特異譜帶分別記為Xwmc364175、Barc0659o和Xwmc517細，它們與復壯30中的抗白粉病基因/>m5e間的遺傳距離 分別為4.9cM， 5.1cM和18.5cM，可作為戶w5e的SSR標記。其中標記 Xwmc364175和Barc06590與抗病基因緊密連鎖，在對戶/w^的標記輔助選擇中具 有利用價值。
2、權利要求1所述小麥抗白粉病基因復壯30的SSR標記的獲得方法，包
括-
步驟一分離群體的創(chuàng)建
復壯30xChancellor獲得Fi種子，^自交，得F2分離群體。 步驟二白粉病抗性接種及鑒定
用當前小麥白粉菌的優(yōu)勢小種Nai5號小種對抗、感親本、所有的F2單株 進行兩次接種， 一次在三葉期， 一次在拔節(jié)期，同時以感病親本Chancellor為感 病對照。在感病對照充分發(fā)病的條件下，調(diào)査抗、感分離情況，每隔2-3天重復 調(diào)査一次，病級鑒定按盛寶欽等(盛寶欽等1988植物保護，1988， l'. 49-501988) 提出的反應型標準(0-4級)進行。
步驟三F2代群體的分子標記分析
(1) 用Devos (Theor.Appl.Genet， 1992， 84:567-572)的酚-氯仿提取法,稍有 改動，適于1.5ml離心管提取。
提取抗、感親本及F2代群體各單株的DNA;
(2) 首先用已定位在7B染色體上的56對SSR引物在抗病親本復壯30和 感病親本Chancellor間進行多態(tài)性篩選，利用第一輪篩選出的在抗、感材料間具 有多態(tài)性差異的引物在抗、感池間進行第二輪篩選-
建立抗病池和感病池從復壯30 x Chancellor的F2代分離群體中隨機選取 10個抗病單株的DNA等量混合，隨機選取10個感病單株的DNA等量混合。SSR-PCR反應體系:PCR反應體積為25nl，其中含有2.5nl 10xPCRBuffer(100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.3), 500 mmoi/L KCI)， 2pl 30 ng膜板DNA， 0. 2^1 (5U4U) Taq酶,2nl (25Mm) MgCI2,3pl (2.5nmol/L)引物，2pl (2.5mmol/L )dNTP。
SSR擴增程序擴增反應在Thermal Cycler 9600 PCR上進行。先進行一次 預擴增95'C變性5分鐘，然后進行30個循環(huán)的擴增，每個循環(huán)95'C變性1分 鐘，55'C (復性溫度因引物不同而異)復性l分鐘，72'C延伸1分鐘，最后 72'C延伸5分鐘。
擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩(wěn)壓110V電泳， 銀染顯色，然后用TancmGis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，記錄結果
選擇在親本間和F2代群體的抗、感池間擴增出相同有多態(tài)性的引物為與復 壯30連鎖的SSR分子標記3對，將這3對分子標記在F2代群體單株中擴增獲 取群體各單株的抗、感反應型資料。
步驟四分子標記獲得
根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用擴增獲得的F2代群體各單株基因型資料與田間鑒 定獲得的對應各單株的抗、感反應型資料構建3對SSR標記與復壯30的連鎖圖 譜，利用MAPMARKER3.0計算各標記與復壯30中的抗白粉病基因戶附5e間 的遺傳距離分別為4.9cM， 5.1cM和18.5cM，其中標記Xwmc364175和Barc065 與復壯30基因表現(xiàn)為緊密連鎖。
本發(fā)明的有益效果是
1、 本發(fā)明在國際上首次獲得了 2個與小麥抗白粉病基因復壯30緊密連鎖 的SSR標記；
2、 鑒定方便，提高效率。SSR標記的特點是多態(tài)性強、共顯性、在整個基因組中隨機分布、穩(wěn)定性好、操作簡單；在小麥中，SSR已被證實是一種非 常有效的分子標記。利用緊密連鎖標記在早代就可以進行選擇，提高選擇的準 確性，縮小育種群體，并且不受環(huán)境、生長季節(jié)的限制，結合加代技術能大大 縮短育種年限、提高育種效率。
3、可用于克隆抗白粉病基因尸m^的研究。圖位克隆Pm5e基因的前提在 于獲得與/^&基因緊密連鎖的分子標記。標記Xwmc364ns和Barc065與復壯 30基因表現(xiàn)為緊密連鎖。
以下結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
四

圖l從左至右分別為引物Barc065、 Xwmc364和Xwmc517在抗、感親本，抗、 感池間的擴增結果。(M:標準分子量，S:感病池，R:抗病池，SP:感病親 本Chancellor, RP:抗病親本復壯30)。
圖2引物Xwmc364在F2分離群體中的部分擴增結果(S表示感病單株，R表 示抗病單株，M表示標準分子量)。
圖3引物Barc065在F2分離群體中的部分擴增結果(S表示感病單株，R表示 抗病單株，M表示標準分子量)。
圖4引物Xwmc517在F2分離群體中的部分擴增結果(S表示感病單株，R表 示抗病單株，M表示標準分子量)。
圖5小麥染色體7B上戶m^基因與SSR標記的連鎖圖譜。
五具體實施例方式
本試驗所用材料冬小麥品種復壯30來源于陜西涇惠農(nóng)場，從涇陽30系統(tǒng) 選育而成，它攜有一對抗白粉病隱性基因，該基因?qū)ξ覈餍械陌追鄄⌒》N表現(xiàn)為高抗或免疫。本研究以復壯30、感病品種Chancellor為材料，利用&分離 群體分組分析法(BSA)對復壯30的抗白粉病基因進行SSR標記分析。
目前獲得的Pm5e的SSR標記很少，而與其緊密連鎖的分子標記還未見報道。
本研究篩選出3個與基因連鎖的SSR標記，其中2個為緊密連鎖標 記，它們可有效地用于戶附5e基因的標記輔助選擇。以該標記為路標，可以進行 P加^基因的精細定位或通過染色體步移法接近戶w5e基因，從而為P附5e基因 的克隆打下基礎。
步驟一分離群體的創(chuàng)建
復壯30xChancellor獲得F,種子，R自交，得F2分離群體。 步驟二白粉病抗性接種及鑒定
用當前小麥白粉菌的優(yōu)勢小種N0.15號小種對抗、感親本、所有的F2單株 進行兩次接種， 一次在三葉期， 一次在拔節(jié)期，同時以感病親本Chancellor為感 病對照。在感病對照充分發(fā)病的條件下，調(diào)査抗、感分離情況，每隔2-3天重復 調(diào)査一次，病級鑒定按盛寶欽等提出的反應型標準(0-4級)進行。
步驟三F2代群體的分子標記分析
(1) 用Dews (1992)的酚-氯仿提取法，稍有改動，適于1.5ml離心管提取。 提取抗、感親本及F2代群體各單株的DNA;
(2) 首先用已定位在7B染色體上的56對SSR引物在抗病親本復壯30和 感病親本Chancellor間進行多態(tài)性篩選，利用第一輪篩選出的在抗、感材料間具 有多態(tài)性差異的引物在抗、感池間進行第二輪篩選
建立抗病池和感病池從復壯30 x Chancellor的F2代分離群體中隨機選取10個抗病單株的DNA等量混合，隨機選取10個感病單株的DNA等量混合。
SSR-PCR反應體系PCR反應體積為25jil，其中含有2.5nl 10xPCRBuffer(100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.3)， 500 mmol/L KCI)， 2|il 30 ng膜板DNA， 0. 2^1 (5UV1) Taq酶,2^(25Mm)MgCl2，3nl (2.5nmol/L)引物,2^1 (2.5mmol/L)dNTP。
SSR擴增程序擴增反應在Thermal Cyder 9600 PCR上進行。先進行一次 預擴增95'C變性5分鐘，然后進行30個循環(huán)的擴增，每個循環(huán)95'C變性1分 鐘，55'C (復性溫度因引物不同而異)復性l分鐘，72'C延伸1分鐘，最后 72'C延伸5分鐘。
擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩(wěn)壓110V電泳， 銀染顯色，然后用TaiionGis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，記錄結果
選擇在親本間和F2代群體的抗、感池間擴增出相同有多態(tài)性的引物為與復 壯30連鎖的SSR分子標記3對，將這3對分子標記在F2代群體單株中擴增獲 取群體各單株的抗、感反應型資料。
步驟四分子標記獲得
根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用擴增獲得的F2代群體各單株基因型資料與田間鑒 定獲得的對應各單株的抗、感反應型資料構建3對SSR標記與復壯30的連鎖圖 譜，利用MAPMARKER3.0計算各標記與復壯30中的抗白粉病基因P附56間 的遺傳距離分別為4.9cM， 5.1cM和18.5cM，其中標記Xwmc364175和Barc065 與復壯30基因表現(xiàn)為緊密連鎖。 步驟五結果與分析
采用定位于小麥7B染色體上的56對SSR引物，在抗病親本復壯30和感 病親本Chancellor間進行多態(tài)性篩選，均能擴增出明顯可辨的帶,其中8對引物、的擴增產(chǎn)物在抗、感材料間具有多態(tài)性差異，經(jīng)多次重復結果穩(wěn)定。從復壯30x Chancellor的F2代分離群體中隨機選取10個抗病單株將其DNA等量混合，隨 機選取10個感病單株將其DNA等量混合，分別建立抗病池和感病池。利用第 一輪篩選出的8對引物在抗、感池間進行第二輪擴增檢測，結果有3個引物 Xwmc364、 Barc065和Xwmc517在抗、感親本，抗、感池間和F;j分離群體的 抗、感單株間擴增出特異譜帶，經(jīng)5次以上重復擴增，結果穩(wěn)定。引物Xwmc364、 Barc065和Xwmc517，擴增的差異片段長分別約為:175bp、 90bp和200bp。
將復壯30 xChancellorF2分離群體，種植于試驗網(wǎng)室，并在12月上旬移栽于 溫室內(nèi)。利用15號白粉病菌種在苗期和拔節(jié)期分別接種，待充分發(fā)病后進行抗 病性調(diào)査并記載反應型。在調(diào)查的F2群體中，苗期共調(diào)査191株，其中62株表 現(xiàn)抗病，129株表現(xiàn)感病，經(jīng)chi-squaref檢驗，抗病株感病株符合1: 3分離 比例(X2=2.126<x2-3.841)。成株期(灌漿期)共調(diào)査154株，其中，55株表現(xiàn) 抗病，99株表現(xiàn)感病，經(jīng)chi-squaref檢驗，抗病株感病株符合l: 3分離比 例(3.536<x2(0,o5> -3.841)。進一步證明Pm5e是1個抗白粉病隱性基因。利用篩 選出的3對特異引物對154株F2植株進行擴增，獲得了穩(wěn)定的特異標記帶，分 別記為Xwmc364175、 Barc065鄰和Xwmc517200，利用MAPMARKER3.0計算各 標記與復壯30中的抗白粉病基因P附5e間的遺傳距離分別為4.9cM、 5.1cM和 18.5cM (圖5)，其中標記Xwmc364175和Barc065與復壯30基因表現(xiàn)為緊密連 鎖。引物Xwmc364、 Barc065和Xwmc517在抗、感親本，抗、感池間及F2分 離群體中的部分擴增結果分別見圖l、圖2、圖3和圖4。
權利要求
1、小麥抗白粉病基因復壯30的SSR標記，其特征在于采用已定位在7B染色體上的56對SSR引物分析結果表明，8個引物能在親本間穩(wěn)定的揭示多態(tài)性差異，3個引物Xwmc364、Barc065和Xwmc517在抗、感親本，抗、感池間和F2分離群體的抗、感單株間擴增出特異譜帶，經(jīng)5次以上重復擴增，結果穩(wěn)定；3對引物所擴增的特異譜帶分別記為Xwmc364175、Barc06590和Xwmc517200，它們與復壯30中的抗白粉病基因Pm5e間的遺傳距離分別為4.9cM，5.1cM和18.5cM，可作為Pm5e的SSR標記；其中標記Xwmc364175和Barc06590與抗病基因緊密連鎖，在對Pm5e的標記輔助選擇中具有利用價值。
2、 權利要求1所述小麥抗白粉病基因復壯30的SSR標記的獲得方法，包括步驟一分離群體的創(chuàng)建復壯30xChancellor獲得F,種子，F(xiàn),自交，得F2分離群體； 注Chancellor為感白粉病親本；步驟二白粉病抗性接種及鑒定用當前小麥白粉菌的優(yōu)勢小種N0.15號小種對抗、感親本、所有的F2單株 進行兩次接種， 一次在三葉期， 一次在拔節(jié)期，同時以感病親本Chancellor為感 病對照，在感病對照充分發(fā)病的條件下，調(diào)查抗、感分離情況，每隔2-3天重復 調(diào)查一次，病級鑒定按盛寶欽等(l訴8)提出的反應型標準(04級)進行；步驟三F2代群體的分子標記分析U)用Devos (1992)的酚-氯仿提取法，稍有改動，適于L5ml離心管提取， 提取抗、感親本及F2代群體各單株的DNA;(2)首先用已定位在7B染色體上的56對SSR引物在抗病親本復壯30和 感病親本Chancellor間進行多態(tài)性篩選，利用第一輪篩選出的在抗、感材料間具有多態(tài)性差異的引物在抗、感池間進行第二輪篩選-建立抗病池和感病池從復壯30 x Chancellor的F2代分離群體中隨機選取 10個抗病單株的DNA等量混合，隨機選取10個感病單株的DNA等量混合；SSR-PCR反應體系PCR反應體積為25nl，其中含有2.5nl 10xPCR Buffer(lOO mmol/L Tris-HCI (pH 8.3)， 500 mmol/L KCI)， 2^1 30 ng膜板DNA, 0. 2^1 (5U/pl) Taq酶，2nl (25Mm) MgCI2, 3^1 (2.5pmol/L)引物，2^1 (2.5mmol/L )d^fTP;SSR擴增程序擴增反應在Thermal Cyder 9600 PCR上進行，先進行一次 預擴增95X:變性5分鐘，然后進行30個循環(huán)的擴增，每個循環(huán)95"C變性1分 鐘，55°C (復性溫度因引物不同而異)復性l分鐘，72'C延伸1分鐘，最后 72t:延伸5分鐘；擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩(wěn)壓110V電泳， 銀染顯色，然后用TanonGis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，記錄結果-選擇在親本間和F2代群體的抗、感池間擴增出相同有多態(tài)性的引物為與復 壯30連鎖的SSR分子標記3對，將這3對分子標記在F2代群體單株中擴增獲 取群體各單株的抗、感反應型資料；步驟四；分子標記獲得根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用擴增獲得的F2代群體各單株基因型資料與田間鑒定獲得的對應各單株的抗、感反應型資料構建3對SSR標記與復壯30的連鎖圖 譜，利用MAPMARKER3,0計算各標記與復壯30中的抗白粉病基因戶w5e間 的遺傳距離分別為4.9cM, 5.1cM和18.5cM，其中標記Xwmc364175和Barc065與復壯30基因表現(xiàn)為緊密連鎖。
全文摘要
本發(fā)明小麥抗白粉病基因復壯30的SSR標記及其獲得方法，屬于作物遺傳育種學領域。本研究篩選出3個與復壯30中的抗白粉病基因Pm5e連鎖的SSR標記，其中2個為緊密連鎖標記，它們可有效地用于復壯30中抗白粉病基因Pm5e的標記輔助選擇。以該標記為路標，可以進行Pm5e基因的精細定位或通過染色體步移法接近Pm5e基因，從而為Pm5e基因的克隆打下基礎。
文檔編號C12Q1/68GK101659988SQ20081013907
公開日2010年3月3日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權日2008年8月29日 公開號200810139073.發(fā)明者祥 李 申請人:祥 李 被以下專利引用 (1),