專利名稱：核酸擴(kuò)增裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增裝置。具體地，本發(fā)明涉及用于基因表達(dá)分析、 傳染病篩查或SNP分析等基因分析的核酸擴(kuò)增裝置等。
背景技術(shù)：
近年來，以DNA芯片或DNA微陣列為代表的雜交檢測技術(shù)的實(shí)用 化進(jìn)展迅速。DNA芯片是將多種.多個(gè)DNA探針集中固定在基片表面。 使用該DNA芯片檢測其基片表面的雜交，可以綜合地分析細(xì)胞、組織 等中的基因表達(dá)等。由該微陣列獲得的數(shù)據(jù)通過進(jìn)行PCR (聚合酶鏈反應(yīng))等核酸擴(kuò)增 反應(yīng)來驗(yàn)證。這已成為痕量核酸定量分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。除PCR方法外， 用于痕量核酸定量分析的核酸擴(kuò)增技術(shù)還可采用其它方法，這里作為一 個(gè)例子，對實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行說明。實(shí)時(shí)PCR方法通過連續(xù)進(jìn)行"熱變性—與引物進(jìn)行退火—聚合酶延 伸反應(yīng)"的擴(kuò)增循環(huán)，可以對DNA等進(jìn)行數(shù)十萬倍的擴(kuò)增。該方法通 過實(shí)時(shí)監(jiān)測如此獲得的P C R擴(kuò)增產(chǎn)物，可以進(jìn)行前述的微量核酸定量分 析。在該實(shí)時(shí)PCR方法中，使用將熱循環(huán)儀和熒光分光光度計(jì)一體化的 專用裝置等對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。以下，對該實(shí)時(shí)PCR的4全測方法進(jìn)行說明。首先，可以列舉出使用SYBR(注冊商標(biāo))Green I的插入劑 (intercalator)法。在插入劑法中，使用插入劑，其與雙鏈DNA結(jié)合會發(fā) 出焚光。使該插入劑與PCR反應(yīng)過程中生成的雙鏈DNA結(jié)合，以激發(fā)光照射之，可以發(fā)出熒光。通過檢測該突光強(qiáng)度可以監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量。插入劑法無需設(shè)計(jì)、合成靶標(biāo)特異性的熒光標(biāo)記探針，可以 簡便地應(yīng)用于各種靶標(biāo)的測定。此外，在希望加以區(qū)分地檢測結(jié)構(gòu)相似的序列時(shí)，或者在諸如SNP 分型的情況中需要多重檢觀'Kmultiplex detection)時(shí)，可以釆用探針法。 作為探針法，可以列舉出例如TaqMan(注冊商標(biāo))探針法，該方法將5， 末端用熒光物質(zhì)修飾、3'末端用猝滅物質(zhì)修飾的寡核苷酸用作探針I(yè)I。TaqMan探針在退火步驟與模板DNA特異地雜交，而因?yàn)樵谔结樕?存在上述猝滅物質(zhì)，所以即使以激發(fā)光進(jìn)行照射也會因消光而不發(fā)出熒 光。但是，在延伸反應(yīng)階段，由于T叫DNA聚合酶具有5， — 3'外切核 酸酶活性，與模板DNA雜交的TaqMan探針被分解。這樣，上述熒光 物質(zhì)從探針上游離出來，猝滅物質(zhì)的抑制作用被解除，因而可以發(fā)出熒 光。通過檢測該熒光強(qiáng)度可以監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量。下面，較為詳細(xì)地說明采用實(shí)時(shí)PCR通過上述方法等定量分析基因 表達(dá)量的程序。首先，將濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行剃度稀釋后作為模板 進(jìn)行PCR,得到擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到指定量所需的循環(huán)數(shù)(threshold cycle, Ct 值)。以該Ct值為橫坐標(biāo)、初始DNA量為縱坐標(biāo)作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 基于此，對未知濃度的樣品在相同的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到Ct值。 由該Ct值和上述標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品中目標(biāo)DNA的量。作為與此相關(guān)的技術(shù)，專利文獻(xiàn)l、專利文獻(xiàn)2中公開了與擴(kuò)增反 應(yīng)時(shí)的溫度控制等相關(guān)的技術(shù)。專利文獻(xiàn)1:特表2003-525617號7>凈艮專利文獻(xiàn)2:特表2001-136954號公報(bào)發(fā)明內(nèi)容本領(lǐng)域希望使用核酸擴(kuò)增裝置來高精度地分析目標(biāo)核酸的量。為此， 有必要使樣品(基因)的擴(kuò)增率保持恒定。因此，本發(fā)明的主要目的是提供可 以高精度地控制基因的擴(kuò)增率的核酸擴(kuò)增裝置。首先，本發(fā)明提供進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增裝置，其至少具備， 多個(gè)進(jìn)行所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的孔，為每個(gè)孔設(shè)置的加熱部件，以指定波 長的激發(fā)光照射所有孔的光學(xué)裝置，和為每個(gè)孔設(shè)置的熒光檢測部件。因?yàn)槊總€(gè)孔均具備加熱部件和熒光檢測部件，所以可以獨(dú)立地控制各孔 內(nèi)的反應(yīng)。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)至少使用PCR方法進(jìn)行。在PCR方法中通過指定的溫度循環(huán)來進(jìn)行核酸擴(kuò)增， 而本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置可以獨(dú)立地且高精度地控制在各孔中進(jìn)行的 溫度循環(huán)，因此可以進(jìn)行高精度的分析。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)在等溫 條件下進(jìn)行。當(dāng)作為所謂等溫核酸擴(kuò)增裝置來使用時(shí)，通過進(jìn)行各孔的 溫度控制，可以統(tǒng)一各孔核酸擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增率。其結(jié)果，雖然是等溫 擴(kuò)增方法，仍可以進(jìn)行高精度分析。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，該裝置通過對應(yīng)于各個(gè)孔的 加熱部件獨(dú)立地控制所述孔的加熱溫度和加熱時(shí)間。通過所述加熱部件 獨(dú)立地控制每個(gè)所述孔的加熱溫度和加熱時(shí)間，可以高精度地控制所述 孔內(nèi)的擴(kuò)增反應(yīng)等。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其中的加熱部件由薄膜晶體 管形成、并具有通斷控制(switch control)。利用薄膜晶體管的通斷 (switching),可以獨(dú)立地進(jìn)行各孔的溫度控制。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其中的加熱部件由發(fā)熱電阻 (heat generation resistor)形成、并受薄膜晶體管的通斷控制。利用薄膜晶 體管的通斷，通過控制流過發(fā)熱電阻的電流值等，可以獨(dú)立地進(jìn)行各孔 的溫度控制。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其具備用于恒溫控制的佩爾 捷元件。使用佩爾捷元件，可以容易地進(jìn)行所述孔內(nèi)的溫度控制。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其至少具備上文所述的光 學(xué)裝置，發(fā)出指定波長的激發(fā)光的光源，以及將所述激發(fā)光導(dǎo)入所有孔 的導(dǎo)光板。這樣就可以將激發(fā)光由光源導(dǎo)入所有孔。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其還具備，位于所述孔和所 述熒光檢測部件之間的、能透過指定波長的光的濾膜。通過設(shè)置所述濾 膜，可以有效地采集檢測到的熒光。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其還具備，位于所述孔和所 述導(dǎo)光板之間的、能透過指定波長的光的濾膜。通過設(shè)置所述濾膜，可以有效地釆集照射到各孔中的激發(fā)光。此外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增裝置，其中的光源為發(fā)光二極管。 使用發(fā)光二極管作為光源，可以簡便地獲得不包含不必要的紫外線、紅 外線等的光。根據(jù)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置，可以綜合地高精度分析基因表達(dá)量。


圖1本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的第一實(shí)施方式的側(cè)視圖。圖2本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的第二實(shí)施方式的側(cè)視圖。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
以下，參照附圖對本發(fā)明的方法的實(shí)施方式進(jìn)行說明。而且，附圖 所示的實(shí)施方式僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并非據(jù)此對本發(fā)明進(jìn)行狹 義的解釋。圖1為本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的第一實(shí)施方式的側(cè)視圖。而且，在 下面使用的附圖中，為了方便進(jìn)行說明，在裝置構(gòu)成等方面做了簡化顯示。圖1中的符號1表示本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置。該核酸擴(kuò)增裝置1的 尺寸和層結(jié)構(gòu)可以^見目的而適宜地選擇，可以在本發(fā)明目的的范圍內(nèi)對 核酸擴(kuò)增裝置1的構(gòu)造進(jìn)行設(shè)計(jì)和變化。核酸擴(kuò)增裝置1的配置具體舉例說明如下。核酸擴(kuò)增裝置1具備反應(yīng)基片11、加熱部件12、佩爾捷元件(Peltier element) 13、光源14、導(dǎo)光 寺反15、熒光4全測部件16、濾膜17和測量基片18,其中，加熱部件12對 所述反應(yīng)基片ll進(jìn)行加熱，導(dǎo)光板15向所述反應(yīng)基片ll導(dǎo)入激發(fā)光， 熒光檢測部件16檢測熒光，濾膜17僅透過指定波長的光。反應(yīng)基片11具備多個(gè)孔(反應(yīng)區(qū))A1，在孔A1內(nèi)進(jìn)行指定反應(yīng)。在 本發(fā)明中，對于孔Al的形狀沒有特別限定，可以選擇合適的形狀和容 量。對孔Al的容量沒有特別限定，其優(yōu)選為微空間，具體優(yōu)選其容量 在lpL以下。這樣的微空間可以保證孔Al中必要的反應(yīng)溶液量為少量， 因此可以高精度地進(jìn)行溫度控制等，還可以縮短反應(yīng)時(shí)間。例如，將所述孔Al設(shè)定為300pm x 300(im x 300pm(容積27nL)時(shí)， 即使在反應(yīng)基片11上設(shè)置約4萬個(gè)孔Al，也僅僅需要面積為約6cm見 方的裝置。這樣的裝置可以小型化，因而可以在反應(yīng)基片11上矩陣式 配置數(shù)目與人類基因數(shù)相當(dāng)?shù)目譇l，容易且簡便地進(jìn)行綜合分析。對反應(yīng)基片11的材料等沒有特別限定，只要該材料可以透過激發(fā) 光L1，可以在考慮測定目的、易加工性等的基礎(chǔ)上適宜地選擇。例如， 可以使用低熒光激發(fā)型塑料、玻璃等作為反應(yīng)基片ll的材料。此外，反應(yīng)基片11與加熱部件12、熒光檢測部件16、濾膜17等 之間可以是可拆卸的?；蛘?，雖未圖示，但反應(yīng)基片11與加熱部件12 之間可以是一體結(jié)構(gòu)，也可以是可拆卸的。加熱部件12對反應(yīng)基片11內(nèi)的各孔Al進(jìn)行加熱。由此，進(jìn)行孔 Al的溫度控制。而且，優(yōu)選由對應(yīng)于各個(gè)孔Al的加熱部件12各自獨(dú) 立地控制所述孔Al的加熱溫度和加熱時(shí)間。通過所述加熱部件12獨(dú)立 地控制每個(gè)所述孔Al的加熱溫度和加熱時(shí)間，可以更高精度地控制所 述孔Al內(nèi)的擴(kuò)增反應(yīng)等。在先的實(shí)時(shí)PCR方法通過熱循環(huán)儀等進(jìn)行溫度控制，雖然有些情況 下該溫度控制也帶有梯度機(jī)制，但存在的問題是不能獨(dú)立地進(jìn)行各樣品 的溫度控制。與此相對，本發(fā)明中，對于每個(gè)孔Al分別設(shè)置了加熱部 件12,可以獨(dú)立地控制各孔溫度。而且，對于每個(gè)孔Al相應(yīng)地設(shè)置加 熱部件12,可以獨(dú)立i也控制擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的加熱時(shí)間。對于加熱部件12的結(jié)構(gòu)等沒有特別限定，優(yōu)選其為由薄膜晶體管 (TFT: Thin Film Transistor)構(gòu)成、并具有通斷控制的加熱器。利用薄膜晶 體管的通斷功能，可以獨(dú)立地控制各孔Al的溫度。溫度控制可以是， 控制加載于薄膜晶體管的電壓、以使源極-漏極(source-drain)之間產(chǎn)生可 變電流，也可以是控制源極-漏極之間的電流，使其為恒流電源。特別是， 優(yōu)選用一個(gè)薄膜晶體管作為熱源，并用另一薄膜晶體管作為通斷元件， 使這些薄膜晶體管處在同一環(huán)路中。這樣就可以在同一環(huán)路中一并控制 熱源和通斷?；蛘撸跓岵考?2可以是由發(fā)熱電阻(heat generation resistor)構(gòu)成、 并受薄膜晶體管的通斷控制的加熱器。更具體地，薄膜晶體管可以僅用 于通斷控制。所述發(fā)熱電阻可以使用鉑(Pt)、鉬(Mo)、鉭(Ta)、鎢(W)、碳化硅、鉬硅化物、鎳-鉻合金、鐵-鉻-鋁合金等。這種情況下，通過控 制流過發(fā)熱電阻的電流值，可以進(jìn)行溫度控制。對于在本發(fā)明中使用的薄膜晶體管的種類沒有特別限定，可以適宜地使用例如多晶硅、a-硅等。在本發(fā)明中，優(yōu)選提供佩爾捷元件13以進(jìn)行孔Al的溫度控制?？?以用佩爾捷元件對全部孔總體上進(jìn)行溫度控制，而用各自的加熱部件12 對各孔Al的溫度進(jìn)行更為精密的控制。由此，可以精確地控制各孔A1 的溫度以避免微小的變化和偏差。使用佩爾捷元件13，可以容易地進(jìn)行 恒溫控制。其結(jié)果是，可以進(jìn)行高精度的溫度控制。此外，在進(jìn)行PCR循環(huán)時(shí)，必須相應(yīng)于"熱變性—退火(引物雜交) —延伸反應(yīng)"的步驟進(jìn)行溫度控制。例如，可以預(yù)先將孔A1內(nèi)的溫度 保持在PCR循環(huán)的最低溫度(例如55°C)。然后，通過佩爾捷元件13控 制全部孔的溫度循環(huán)，再進(jìn)一步通過各加熱部件12獨(dú)立地校正或控制 各孔Al的溫度變化和偏差。這樣分別進(jìn)行全部孔的溫度控制和各孔獨(dú) 立的溫度控制，可以進(jìn)行更精確的溫度控制。在本發(fā)明中，作為可以以指定波長的激發(fā)光照射全部所述多個(gè)孔 Al的光學(xué)裝置，可以使用光源14或用于將激發(fā)光導(dǎo)入各孔Al的導(dǎo)光 板15。對于光源14的種類沒有特別限定，只要其可以發(fā)出指定波長的光。 優(yōu)選使用發(fā)白光或發(fā)單色光的發(fā)光二極管(LED)。使用發(fā)光二極管，可 以簡便地獲得不包含不必要的紫外線或紅外線等的光。在本發(fā)明中，對于光源14的安裝位置和數(shù)量沒有特別限定。雖未 圖示，但可以采取下述結(jié)構(gòu)相應(yīng)于多個(gè)孔Al設(shè)置多個(gè)光源14，由各 光源14向所對應(yīng)的各個(gè)孔A1直接照射激發(fā)光。這種情況下，例如由于 各孔Al被相應(yīng)光源直接照射，可以更多地采集激發(fā)光量，或者獨(dú)立地 控制激發(fā)光量來對所有孔進(jìn)行均 一 的激發(fā)照射。導(dǎo)光板15用于將由光源14發(fā)出的激發(fā)光L1導(dǎo)向反應(yīng)基片11內(nèi)的 各孔A1。光源14發(fā)出的激發(fā)光L1凈皮導(dǎo)入所述導(dǎo)光板15內(nèi)部的間隔區(qū) (spacer)151。在所述導(dǎo)光板15上部設(shè)置有反射膜152,例如可以使用分 色鏡等向反應(yīng)基片11導(dǎo)入激發(fā)光L2。由此，可以以均一的光量激發(fā)各 孔A1內(nèi)的反應(yīng)液中的熒光物質(zhì)。此外，在本發(fā)明中，優(yōu)選在導(dǎo)光板15的底部設(shè)置僅透過所述激發(fā) 光L1、 L2的波長的光的濾膜153。由此，可以從光源14發(fā)出的光中有 效地采集激發(fā)光L2,并將其導(dǎo)向孔Al。作為該濾膜153，可以使用例 如偏光濾光片(polarizing filter)等。熒光檢測部件16對熒光進(jìn)行檢測和測定，所述焚光是激發(fā)光L2照 射孑L Al、使插入的探針(intercalated probe)中的熒光染料激發(fā)而發(fā)射的 熒光。在本發(fā)明中，對于熒光檢測部件16的構(gòu)造等沒有限定，例如可 以使用光電二極管。熒光;f企測部件16與加熱部件12可以位于同一玻璃基片15上，也 可以位于不同基片上，或者熒光檢測部件16與加熱部件12還可以是層 疊的狀態(tài)。在本發(fā)明中，優(yōu)選在各孔Al和與之對應(yīng)的各熒光4全測部件16之間 設(shè)置僅透過熒光L3的波長的光的濾膜17。在孑L Al和熒光檢測部件16 之間設(shè)置僅透過指定波長的光的濾膜17,可以更有效地采集所檢測到的 熒光L3，因而可以進(jìn)行更高精度的分析。作為該濾膜17，可以使用例 如偏光濾光片等。這樣，因?yàn)楸景l(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置1具有焚光檢測部件16,可以實(shí) 時(shí)地進(jìn)行熒光4全測。而且，對應(yīng)于各孔Al獨(dú)立地設(shè)置熒光4全測部件16, 可以獨(dú)立且高精度地對各個(gè)孔Al進(jìn)行檢測。而且，因?yàn)榭梢詫?shí)時(shí)地進(jìn)行焚光^r測，所以能夠?qū)晒?f企測部件16 的檢測結(jié)果反饋給加熱部件12的溫度控制機(jī)制。例如，可以設(shè)計(jì)成如 下形式基于熒光檢測部件16檢測到的孔Al中的反應(yīng)結(jié)果(基因擴(kuò)增 量)來控制加熱部件12的加熱量。這樣，通過將熒光檢測部件16的檢測 結(jié)果反饋給加熱部件12，可以更高精度地控制各孔Al的基因擴(kuò)增反應(yīng)。此外，可以將加熱部件12、熒光檢測部件16設(shè)置在測量基片18上。 此外，在本發(fā)明中，所述測量基片18不限于設(shè)置在加熱部件12、焚光 檢測部件16的下方，可以適宜地設(shè)置在合適的位置。對本發(fā)明中使用 的所述測量基片18的材料沒有特別限定，可以使用例如玻璃基片或各 種樹脂基片等。使用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置1可以進(jìn)行一般采用的PCR方法。具體 地，例如可以使用(l)待擴(kuò)增的DNA、 (2)至少兩種與目標(biāo)DNA特異性結(jié)9合的寡核苷酸引物、(3)緩沖液、(4)酶、(5)諸如dATP、 dCTP、 dGTP 、 dTTP等脫氧核苷三磷酸，重復(fù)由"熱變性—退火(引物雜交)—延伸反應(yīng)" 組成的循環(huán)，從而將所述目標(biāo)DNA擴(kuò)增至希望的量。以下，說明一個(gè)使用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置1的測定程序的例子。向各孔Al中加入具有預(yù)先設(shè)計(jì)的不同的石威基序列的引物。對加入 方法沒有限定，可以采用例如使用注射器等的方法。這樣，向各孔Al 中滴加含不同引物的溶液，并使其干燥。接著，將從分析物提取得到的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄法轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA,再 加到各孔A1中。同時(shí)加入擴(kuò)增所需的作為各種堿基的原材料的脫氧核 苷三磷酸(dNTP)、插入劑(SYBR(注冊商標(biāo))Green I)和DNA延伸擴(kuò)增反 應(yīng)所需的DNA聚合酶等。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置1可以用作進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈反應(yīng))的實(shí)時(shí)PCR裝置。在一般的PCR方法中使用的是DNA聚合酶， 所以當(dāng)分析對象為RNA時(shí)則不能進(jìn)行擴(kuò)增。與此相對，RT-PCR方法是 先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行PCR的方法，而采用 本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置1同樣可以進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。此外，在PCR方法中，可以使用嵌套引物(nested primer)以防止非 目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增(嵌套式PCR方法)。而且，當(dāng)在本發(fā)明的核酸擴(kuò) 增裝置1中進(jìn)行PCR方法時(shí)，當(dāng)然可以將RT-PCR方法和嵌套式PCR 方法并用。在熱變性步驟中，通過對加熱部件12等進(jìn)行設(shè)定使得孔A1內(nèi)為95°C， 從而使雙鏈DNA變性成為單鏈DNA。在接下來的退火步驟中，進(jìn)行設(shè)定 使得孔A1內(nèi)為55。C，從而使引物與所述單鏈DNA中的互補(bǔ)堿基序列結(jié)合。 在接下來的DNA延伸步驟中，進(jìn)行設(shè)定使得孔Al內(nèi)為72。C ，從而以引物 為DNA合成的起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)來延伸cDNA。每進(jìn)行一個(gè)這樣的"95。C(熱變性)—55。C(引物雜交)—72。C(DNA延 伸)"的溫度循環(huán)，就將各孔Al內(nèi)的cDNA擴(kuò)增為2倍量。而且，通過對 應(yīng)于各孔Al分別設(shè)置的加熱部件12,可以將各孔Al內(nèi)的溫度控制在所設(shè) 計(jì)的引物反應(yīng)的最適值。此外，引物雜交時(shí)間和聚合酶反應(yīng)時(shí)間均是可以 控制的，因此可以控制不必要的反應(yīng)副產(chǎn)物的生成。其結(jié)果，可以統(tǒng)一各 孔A1內(nèi)的基因(cDNA)的擴(kuò)增率，因此可以進(jìn)行高精度PCR反應(yīng)。SYBR Green I嵌入DNA復(fù)制反應(yīng)所生成的ds-DNA中。該SYBR GreenI嵌入ds-DNA,其后被激發(fā)光L2的照射所激發(fā)，發(fā)出熒光(激發(fā) 波長497nm;發(fā)射波長520nm)。由此，在用DNA聚合酶進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，光源14發(fā)出的光LI 經(jīng)過導(dǎo)光板15而成為激發(fā)光L2，該激發(fā)光L2對嵌入的SYBR Green I 進(jìn)行激發(fā)，導(dǎo)致發(fā)出熒光L3。對于每輪溫度循環(huán)，用焚光檢測部件11 測量該熒光L3的發(fā)光量，并確定其量。然后，可根據(jù)溫度循環(huán)數(shù)與對 應(yīng)的熒光發(fā)光量的相互關(guān)系，求出最初的cDNA量作為基因表達(dá)量。圖2為本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的第二實(shí)施方式的側(cè)視圖。以下主要 說明與第一實(shí)施方式的不同之處，而省略對兩者共同之處的說明。圖2中的符號2表示的核酸擴(kuò)增裝置具備反應(yīng)基片21、加熱部件 22、佩爾捷元件23、光源24、導(dǎo)光板25、焚光^f全測部件26、測量基片27， 其中，加熱部件22對所述反應(yīng)基片21進(jìn)行加熱，導(dǎo)光板25向所述反應(yīng) 基片21導(dǎo)入激發(fā)光，焚光檢測部件16檢測熒光。該核酸擴(kuò)增裝置2與第一實(shí)施方式的相同之處在于每個(gè)孔A2獨(dú) 立地具備加熱部件22和熒光4企測部件26;不同之處在于激發(fā)光L2 從反應(yīng)基片21的下方入射，其在孔A2內(nèi)被反射以檢測熒光L3。為此， 孔A2在形狀上具有曲面部分，以反射所述熒光L3。在核酸擴(kuò)增裝置2中，光源24發(fā)出的激發(fā)光Ll通過導(dǎo)光板25照 射孔A2。在導(dǎo)光板25中，激發(fā)光Ll經(jīng)過間隔區(qū)251,由反射膜252 和濾膜253將激發(fā)光L2導(dǎo)向反應(yīng)基片21。而且，該激發(fā)光L2被照射 到孔A2的反應(yīng)液中作為探針的熒光物質(zhì)上，由此激發(fā)出熒光L3。該熒 光L3在孔A2內(nèi)壁被反射，由設(shè)置于該孔A2下方的熒光檢測部件26 檢測并測定。此外，溫度控制通過設(shè)置于孔A2下方的加熱部件22進(jìn)行，并可以 通過佩爾捷元件23等進(jìn)行控制。使用一般的實(shí)時(shí)PCR裝置完成約30輪的由"熱變性—退火—延伸 反應(yīng)"構(gòu)成的循環(huán)，需要25~30分鐘的反應(yīng)時(shí)間。期間，進(jìn)行約2。C/秒 的溫度控制。與此相對，使用本發(fā)明的裝置可以進(jìn)行2(TC/秒以上的溫度控 制，因而平均可以將每循環(huán)的時(shí)間縮短約40秒，完成全部30輪循環(huán)的時(shí) 間可以在25分鐘以下。在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置中，當(dāng)每個(gè)孔分別設(shè)置加熱部件和熒光檢 測部件時(shí)，可以各孔獨(dú)立地進(jìn)行加熱溫度和加熱時(shí)間的控制，從而可以 獨(dú)立地進(jìn)行檢測。因此，可以在短時(shí)間內(nèi)高精度地分析基因表達(dá)量等。而且，將熒光檢測部件與激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)一體化成為一個(gè)裝置，可以 實(shí)現(xiàn)檢測系統(tǒng)的小型化。此外，當(dāng)所述孔為微空間、使反應(yīng)區(qū)域較小時(shí)， 即使在小型設(shè)備上也可以有效地進(jìn)行綜合分析。因此，本發(fā)明的核酸擴(kuò) 增裝置可以用于進(jìn)行綜合分析。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置可以用作在等溫條件下實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng) 的等溫核酸擴(kuò)增裝置。所述"等溫，，是指采用基本恒定的溫度條件，該 條件下所用的酶或引物等基本上發(fā)揮功能。而且，"基本恒定的溫度條 件，，不僅指嚴(yán)格地保持設(shè)定的溫度，還包括允許溫度在一定范圍內(nèi)變化， 只要所述變化不妨礙所使用的酶和引物的基本功能。在本發(fā)明中，除上文所述PCR方法外，還可采用以下等溫?cái)U(kuò)增方法 IVT (體外轉(zhuǎn)錄(In Vitro transcription))方法，其由dsDNA獲得RNA 作為擴(kuò)增產(chǎn)物；TRC (專爭錄逆4爭錄十辦同才廣^曾(Transcription Reverse transcription Concerted amplification))方法，其用逆轉(zhuǎn)錄酶等的RNaseH活性來修剪 (trimmed) RNA,以獲得RNA作為擴(kuò)增產(chǎn)物；NASBA (基于核酸序歹'J的擴(kuò)增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification))方法，其用逆轉(zhuǎn)錄酶等形成含有RNA啟動子的dsDNA, 用RNA聚合酶從dsDNA獲得RNA作為擴(kuò)增產(chǎn)物；SPIA方法，其由DNA和RNA嵌合構(gòu)成引物，用該引物從RNA獲 得ssDNA作為擴(kuò)增產(chǎn)物；LAMP (環(huán)導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification))方 法，其利用DNA形成環(huán)，在恒定溫度從DNA和RNA獲得dsDNA作為 擴(kuò)增產(chǎn)物；SMAP (SMart Amplification Process)方法，其組合使用多種酶，在精 確識別單個(gè)堿基差異(SNP)的情況下，從dsDNA獲得dsDNA作為擴(kuò)增 產(chǎn)物；ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)方法，其將DNA與RNA相結(jié)合構(gòu)成合成性嵌合引物，用該引物從dsDNA獲得dsDNA作為擴(kuò)增產(chǎn)物，等。而且，可以在本發(fā)明中實(shí)施的等溫?cái)U(kuò)增方法不只限于上述的等溫?cái)U(kuò)以在本發(fā)明中實(shí)施的等溫?cái)U(kuò)增方法包括所有不進(jìn)行溫度循環(huán)而對核酸 進(jìn)行擴(kuò)增的方法。等溫?cái)U(kuò)增方法由于不需要上述PCR方法那樣的溫度循環(huán)(例如，95 °C —55°C —72°C),因而具有不需要熱循環(huán)儀等裝置的優(yōu)點(diǎn)。然而，由于 需要擴(kuò)增的核酸的結(jié)構(gòu)和鏈長等的原因?qū)е聰U(kuò)增率有差異，所以難以進(jìn) 行定量分析。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置，可以獨(dú)立地控制各孔的反 應(yīng)溫度，從而修正各孔中核酸擴(kuò)增率的差異。由此，可以使各孔中核酸 擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)效率保持恒定。其結(jié)果，即使在多個(gè)孔中進(jìn)行多個(gè)核酸 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，也可以通過同 一標(biāo)準(zhǔn)曲線定量地獲知各孔中核酸的擴(kuò)增 量。因此，使用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置可以進(jìn)行表達(dá)量的定量分析。并且，在進(jìn)行指定核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，即使未知其確切的反應(yīng)溫度條 件，通過由擴(kuò)增反應(yīng)初期的結(jié)果反饋合適的反應(yīng)溫度，也可以將核酸擴(kuò) 增反應(yīng)的反應(yīng)效率保持恒定。具體地，首先，檢測擴(kuò)增反應(yīng)開始的一段 時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增量與此時(shí)的溫度的相關(guān)關(guān)系。然后，將該結(jié)果反饋給加熱部 件的溫度控制機(jī)制，從而確定進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的合適的反應(yīng)溫度條件。當(dāng)進(jìn)行定量反應(yīng)時(shí)，與PCR方法相比，等溫?cái)U(kuò)增方法的應(yīng)用較為困 難。其中的主要原因是擴(kuò)增率有較大差異，而這種差異取決于需要擴(kuò)增 的核酸的結(jié)構(gòu)和鏈長等。在利用核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的定量分析中，必須 與具有相同擴(kuò)增率的對照進(jìn)行比較，因此這種擴(kuò)增率的差異使定量分析 變得困難。特別是同時(shí)對多種基因進(jìn)行定量時(shí)，對于每個(gè)目標(biāo)基因均制 作標(biāo)準(zhǔn)曲線是困難的，而且必需比較具有相同擴(kuò)增率的核酸。與此相對，使用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置，即使在采用等溫?cái)U(kuò)增方法 進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，也可以在與需要擴(kuò)增的各個(gè)基因或引物相應(yīng)的最適溫 度進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。因此，可以將各孔中核酸的擴(kuò)增率控制在恒定水平。 其結(jié)果，即使是等溫?cái)U(kuò)增方法也可以進(jìn)行高精度的定量分析。而且，因?yàn)槭窃诘葴剡M(jìn)行反應(yīng)，所以無需配置用于控制溫度循環(huán)的 熱循環(huán)儀等。因此，更有利于設(shè)備的小型化。而且，還可以在同一設(shè)備上綜合分析多種基因的量。因此，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置可以設(shè)置成具 備微流路的芯片或基板等形式，也可以設(shè)置成可進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增的高通量 型基因分析裝置。
權(quán)利要求
1.進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增裝置，其至少具備多個(gè)進(jìn)行所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的孔，設(shè)置于每個(gè)所述孔的加熱部件，以指定波長的激發(fā)光照射全部所述多個(gè)孔的光學(xué)裝置，和設(shè)置于每個(gè)所述孔的熒光檢測部件。
2. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中 PCR方法進(jìn)行。
3. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中應(yīng)。
4. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中 獨(dú)立地控制該孔的加熱溫度和加熱時(shí)間。
5. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中 構(gòu)成，并且其通斷是受控制的。
6. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中 成，并受薄膜晶體管的通斷控制。
7. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，還具備用于恒溫控制的佩爾捷元件。
8. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中，所述光學(xué)裝置至少具備發(fā)出 指定波長的激發(fā)光的光源和將所述激發(fā)光導(dǎo)入各孔的導(dǎo)光板。
9. 權(quán)利要求1的核酸擴(kuò)增裝置，其中，在所述孔與所述熒光檢測部 件之間具備透過指定波長的光的濾膜。
10. 權(quán)利要求8的核酸擴(kuò)增裝置，其中，在所述孔與所述導(dǎo)光板之間 具備透過指定波長的光的濾膜。
11. 權(quán)利要求8的核酸擴(kuò)增裝置，其中，所述光源為發(fā)光二極管。,所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)至少通過 ，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)是等溫反 ，通過每一孔各自的加熱部件 ，所述加熱部件由薄膜晶體管 ,所述加熱部件由發(fā)熱電阻構(gòu)
全文摘要
本發(fā)明提供進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增裝置，其至少具備多個(gè)進(jìn)行所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的孔、設(shè)置于每個(gè)所述孔的加熱部件、可以以指定波長的激發(fā)光照射全部所述多個(gè)孔的光學(xué)裝置、和設(shè)置于每個(gè)所述孔的熒光檢測部件。
文檔編號C12M1/00GK101255396SQ200810074178
公開日2008年9月3日 申請日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日
發(fā)明者世取山翼, 安田章夫, 山本拓郎, 岸井典之, 瀬川雄司, 鹽野真由美, 阿部友照 申請人:索尼株式會社