專利名稱：一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)菌及其應(yīng)用，具體是指一種蛭弧菌在 消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，特別適用于畜禽養(yǎng)殖環(huán)境、禽蛋 肉的保藏及其加工過程中常見致病菌的消除。
背景技術(shù)：
食品安全已經(jīng)成為全世界共同關(guān)注的問題，世界衛(wèi)生組織(WHO)將食品 安全看作是一個(gè)世界性的挑戰(zhàn)。近年來，全球食品安全惡性事件頻發(fā)，食源 性疾病已成為影響公共健康的重要問題。據(jù)WH0統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家每年約有三分 之一的人感染食源性疾病，而一些發(fā)展中國(guó)家，食源性疾病往往是致人非正 常死亡的主要原因。多方面的研究和調(diào)査結(jié)果顯示，除意外事故和人為因素 以外，食源性疾病主要是由微生物和化學(xué)藥物所引起的。根據(jù)中美兩國(guó)CDC 近10年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在中美兩國(guó)由微生物引起的食源性疾病均占總數(shù)的50% 左右，而化學(xué)物質(zhì)引起的食源性疾病占總數(shù)的比率在美國(guó)是1%左右，在中國(guó) 是27%左右。國(guó)內(nèi)外的各種資料和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明微生物是引起食源性疾病的罪 魁禍?zhǔn)?。?0年來，我國(guó)的畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了迅猛的發(fā)展，其產(chǎn)品 占整個(gè)食品行業(yè)的比重越來越大，肉、乳、蛋和水產(chǎn)品是動(dòng)物性食品中的主 要種類。根據(jù)全國(guó)飼料工作辦公室的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)肉類產(chǎn)品2003年的產(chǎn)量 為6920萬噸、禽蛋量為2606.8萬噸，肉類和蛋類的年產(chǎn)量均為全世界第一。 但是，我國(guó)肉類的年出口量?jī)H為60多萬噸，不到總量的1%，禽蛋類的出口 量更是微乎其微，其原因之一是微生物污染等食品安全問題。引發(fā)食源性疾 病的微生物普遍存在，但并不是時(shí)時(shí)刻刻都會(huì)引起食源性疾病，這些致病微 生物與其周圍的非致病菌及環(huán)境存在著相互制約的關(guān)系，處于微生態(tài)的平衡 狀態(tài)，而當(dāng)這種平衡被打破以后，致病的微生物大肆生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致食源性 疾病暴發(fā)。我國(guó)環(huán)境的惡化和生態(tài)的破壞使這一問題日益突出。
對(duì)于禽蛋及肉類攜帶的致病菌的控制，目前還沒有任何資料報(bào)道，現(xiàn)有 的資料只是從畜禽養(yǎng)殖過程中采取一些措施，例如使用抗生素，以消除或
者減少其活體攜帶的致病菌，雖然這種源頭措施或有一定的預(yù)防效果，但是 對(duì)畜禽有副作用，直接影響了禽蛋及肉的質(zhì)量。例如抗生素的濫用，導(dǎo)致了
致病菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性；疫苗的使用雖然是個(gè)途徑，但免疫效果不明顯， 特別是目前人們?yōu)榱嗽鰪?qiáng)疫苗的免疫效果，選用的毒株越來越強(qiáng)，反而有潛 在的致病危險(xiǎn)。然而，蛭弧菌作為一類具有裂解致病菌的特殊細(xì)菌，不僅可 應(yīng)用到畜禽從養(yǎng)殖到食用前的全過程，而且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)抗性，也無噬 菌體療法中宿主過于專一的缺點(diǎn)，因此蛭弧菌作為一類致病菌的生物消除劑 具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。
如能在畜禽從養(yǎng)殖、畜禽產(chǎn)品運(yùn)輸、食用或加工前，先進(jìn)行致病菌的生 物消除工作，則可以減少或消除食物中毒的機(jī)率，特別是可為禽蛋及肉產(chǎn)品 的加工提供優(yōu)質(zhì)原材料和加工上的便利。因此，利用蛭弧菌消除禽蛋及肉類 攜帶的致病菌以提高和改善禽蛋及肉的安全性，對(duì)人類健康和我國(guó)禽蛋及肉 類加工業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端，通過研發(fā)找出適用于消除禽蛋 及肉類攜帶的常見致病菌的蛭弧菌，從而提供一種高效、無毒無副作用的蛭 弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下
一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，其特征在于 應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件 步驟一蛭弧菌的分離純化
對(duì)采集的水體或底泥進(jìn)行預(yù)處理，接種增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌，倒 雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，再 按微生物學(xué)方法液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑， 并重復(fù)若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑， 即為一株蛭弧菌純菌株，按同一時(shí)間內(nèi)單斑大小計(jì)，分離出2株蛭弧菌純菌株，
所述蛭弧菌于2008年1月13日在位于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心保藏，^/e77op^力rio5^ BDFOl，保藏編號(hào)為CCTCCNO: M 208008 和^/eWow77rio 5"p. BDF02，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 208009;
步驟二蛭弧菌液的制備
將2株蛭弧菌分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別制成濃度為102 1012pfWml的蛭 弧菌液，待用；
步驟三蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用 采用上述2株蛭弧菌按任意比例混合的蛭弧菌混合液或單株蛭弧菌液， 以噴灑或者擦涂或者浸漬的方法處理攜帶有致病菌的禽蛋及肉類產(chǎn)品，其中 采用浸漬的方法蛭弧菌濃度至少達(dá)到102pfo/ml，其優(yōu)選范圍為104 106pfu/ml;采用噴灑或者擦涂的方法使用濃度》l(^pfii/ml的蛭弧菌液時(shí)， 直接用于禽蛋及肉類產(chǎn)品，其使用量至少達(dá)到15ml/kg,優(yōu)選使用量范圍為 35-55ml/kg;應(yīng)用于環(huán)境，其使用量至少達(dá)到10ml/m2。
所述蛭弧菌混合液的最佳混合比例為BDF01:BDF02為1:1。 所述應(yīng)用環(huán)境包括畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境、保藏環(huán)境和禽蛋及肉類產(chǎn)品運(yùn) 輸工具、加工過程。
所述應(yīng)用方法用于畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境致病菌的消除時(shí)，采用噴灑的方 法當(dāng)使用濃度》l(^pfii/ml的蛭弧菌液時(shí)，優(yōu)選使用量范圍為35 55ml/m2。 所述應(yīng)用方法用于禽蛋及肉類保藏或運(yùn)輸環(huán)境中致病菌的消除時(shí)，采用 噴灑的方法當(dāng)使用濃度^l(^pfii/ml的蛭弧菌液時(shí)，優(yōu)選使用量范圍為30 50ml/m2。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下突出的優(yōu)點(diǎn)和顯著的效果 1、采用本法消除禽蛋及肉類攜帶的致病菌的效果顯著 本應(yīng)用克服了抗生素濫用帶來的副作用，也克服了疫苗免疫效果不明顯 而噬菌體療法中宿主過于專一的缺點(diǎn)，為消除禽蛋及肉類所攜帶的食源性致
病菌提供了一種新方法，該方法可適用于從"養(yǎng)殖到餐桌"包括禽蛋肉類加 工在內(nèi)的全過程。
(1) 用于畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境致病菌的消除時(shí)，可明顯的減少養(yǎng)殖環(huán)境 中的致病菌的數(shù)量，可以防止或減少畜禽動(dòng)物的患病率，從而提高畜禽養(yǎng)殖 環(huán)境的質(zhì)量以及改善畜禽動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)，同時(shí)也防止人患豬鏈球菌病的可 能。從根本上減少乃至杜絕致病菌所引發(fā)的食源性疾病，確保人的健康安全。
(2) 用于禽蛋及肉類保藏、運(yùn)輸環(huán)境中致病菌的消除時(shí)，以新鮮的雞蛋、 鴨蛋、豬肉、豬肉為例，檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示，對(duì)沙門氏菌(5Wmo^/^
Sp)，豬鏈球菌(S&印toCOCCWS SM&)，梭狀芽胞桿菌(C70S^TiVj'i/i77Sp)及大腸
桿菌(五^/^r/c/z^ co/z')的清除率均可達(dá)99%以上。可有效地延長(zhǎng)在常溫或者低 溫下的保藏時(shí)間，防止或延緩禽蛋及肉腐敗變質(zhì)，同時(shí)避免使用化學(xué)防腐劑， 方便、安全且效果好，直接提高了產(chǎn)品品質(zhì)。
(3)本應(yīng)用方法特別適用于禽蛋及肉類加工過程中，為加工提供優(yōu)質(zhì)原 材料和加工上的便利，確保禽蛋類加工產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，有效地解決了食品安全 問題。
2、 采用本發(fā)明消除禽蛋及肉類攜帶致病菌安全性好 蛭弧菌消除禽蛋肉類攜帶的沙門氏菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞桿菌及大腸
桿菌的方法是生物的方法，蛭弧菌具有可侵染、裂解宿主細(xì)菌的特性，使之 適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的生物凈化因子，且其在裂解 完宿主細(xì)菌后，會(huì)因饑餓而自動(dòng)消亡，因此對(duì)人和動(dòng)物無毒副作用。有效地 減少或消除化學(xué)藥物如抗生素的殘留，確保禽畜產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，從根本上避免 禽類產(chǎn)品食物中毒事件的發(fā)生。提高了消費(fèi)者食用禽蛋及肉的安全系數(shù)，保 護(hù)了消費(fèi)者的健康。
3、 本發(fā)明還可延伸推廣應(yīng)用于其它動(dòng)物性產(chǎn)品和水產(chǎn)品，特別有利于減 少或消除化學(xué)藥物如抗生素的使用和殘留，確保水產(chǎn)品和其它動(dòng)物性產(chǎn)品的 優(yōu)質(zhì)，對(duì)提高食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義；同時(shí)為出口 貿(mào)易保駕護(hù)航。


圖1為蛭弧菌及其混合液在消除雞蛋表面攜帶四種致病菌的試驗(yàn)效果比 較圖。
圖2為蛭弧菌及其混合液在消除豬肉加工過程中表面攜帶的四種致病菌 的試驗(yàn)效果比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
蛭弧菌在消除禽蛋場(chǎng)新鮮雞蛋攜帶的常見致病菌的應(yīng)用試驗(yàn)
試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件 步驟一蛭弧菌的分離純化
對(duì)采集的水體或底泥進(jìn)行預(yù)處理，接種增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌，倒 雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，再 按微生物學(xué)方法液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑， 并重復(fù)若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑，
即為一株蛭弧菌純菌株，按同一時(shí)間內(nèi)單斑大小計(jì)，分離出2株蛭弧菌純菌 株，所述蛭弧菌于2008年1月13日在位于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏，5fife〃ov/Z^0平BDF01,保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 208008和5&〃ow'6Wo平BDF02,保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 208009。 步驟二蛭弧菌液的制備
步驟一得到的菌株號(hào)分別為BDF01、 BDF02的蛭弧菌，與嗜水氣單胞 菌液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角錐瓶中，恒溫?fù)u床250 rpm、28 。C 培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)物經(jīng)過6000 rpm、4 。C離心20 min，取上清液，再16000 rpm、 4 'C條件下離心20 min，棄上清液，加入適量DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭 弧菌沉淀物，制成濃度為102 1012pfu/ml的蛭弧菌液，將上述2株菌以任 意比例混合均稱為蛭弧菌混合液。
步驟三消除沙門氏菌、豬鏈球菌、梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌的應(yīng)用實(shí)
驗(yàn)
(1) 沙門氏菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌的制備 用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，160 rpm 28 。C培養(yǎng)12-16 h
分別增殖沙門氏菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌，培養(yǎng)液經(jīng)5000rpm、 4X:離心20min，棄上清液，沉淀菌體用無菌水重新懸浮，使其濃度為 109cfii/ml，最后制備上述四種菌的混合液，每種菌的終濃度為105cfu/ml。
(2) 分別施用BDF01或BDF02蛭弧菌液和分別按BDF01:BDF02為 1:1、 1:2、 2:1的比例混合的蛭弧菌混合液對(duì)沙門氏菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞 桿菌及大腸桿菌的消除試驗(yàn)
試驗(yàn)所用材料為雞蛋，試驗(yàn)均設(shè)對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照設(shè)三個(gè)平行樣，每 個(gè)平行樣有雞蛋10個(gè)；實(shí)驗(yàn)組中，把雞蛋浸漬于步驟三(1)的4種致病菌 混合液中，30秒后取出瀝干。然后將每10個(gè)雞蛋分成一個(gè)小組，浸漬于濃 度為102pfu/ml、 104pfu/ml、 106pfu/ml、 108pfu/ml、 1010pfu/ml或1012pfu ml 的蛭弧菌液中。不同濃度的蛭弧菌液均設(shè)單株即BDF01或BDF02和蛭弧菌 混合液。雞蛋在不同蛭弧菌液浸漬后，30秒后取出瀝干，在室溫下放置4小 時(shí)，之后分別檢測(cè)上述四種致病菌的含量。沙門氏菌、豬鏈球菌、梭狀芽胞 桿菌及大腸桿菌的具體檢測(cè)方法是取經(jīng)無菌生理鹽水濕潤(rùn)的滅菌拭子(棉花
簽)在蛋表面上均勻的涂抹4次后，置含無菌生理鹽水的無菌離心管中振蕩、 混勻，然后采用MPN (most probable number)方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)(單位為 cfii/ml/雞蛋)。其中豬鏈球菌的檢測(cè)采用透明指示選擇性培養(yǎng)基，沙門氏菌 的檢測(cè)采用XLD(xylose-lysine-deoxycholate)選擇性培養(yǎng)基，梭狀芽胞桿菌檢 測(cè)采用卵黃瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌的檢測(cè)采用TBX (Tryptone Bile X-glucuronide)選擇性瓊脂培養(yǎng)基。
以BDF01或BDF02最低濃度(102pfu/ ml)的蛭弧菌液和混合比1:1的 蛭弧菌混合液的試驗(yàn)組的結(jié)果為例，對(duì)消除效果進(jìn)行說明。檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示。圖1表明，在使用蛭弧菌混合液的實(shí)驗(yàn)組，在4小時(shí)的試驗(yàn)結(jié)束時(shí)， 致病菌幾乎檢測(cè)不到，即完全消除；而施用同樣濃度的單株蛭弧菌(BDF01 或BDF02)的實(shí)驗(yàn)組對(duì)四種致病菌的消除稍慢，此時(shí)仍可檢測(cè)到致病菌的數(shù) 量為2-3 cfii/ml雞蛋，消除效果比2株蛭弧菌混合液的效果略差。
比較四種致病菌的初始濃度與終濃度，可知單株或2株蛭弧菌混合液對(duì) 沙門氏菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌消除率均可達(dá)到99%以上。 由于其它試驗(yàn)小組的效果相同或更好，故在此不再贅述。
實(shí)施例2
蛭弧菌在消除畜肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用試驗(yàn) 試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件 步驟一、二及步驟三(1)均同實(shí)施例1
步驟三(2) 2株蛭弧菌蛭弧菌對(duì)消除豬肉加工過程中表面攜帶的沙門氏 菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌試驗(yàn)
分割出每塊重量相近的實(shí)驗(yàn)樣品豬塊，每塊重約0.25kg，試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組 和實(shí)驗(yàn)組，其中對(duì)照組三塊，為三個(gè)平行樣，剩下豬肉塊為實(shí)驗(yàn)組，每小組 三塊，為三個(gè)平行樣。將它們浸漬于步驟三(1)的致病菌混合液中，致病菌 混合液是指沙門氏菌、豬鏈球菌、梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌的終濃度分別達(dá) 到1x105cfu/ml， 30秒后取出瀝干。然后對(duì)實(shí)驗(yàn)組每個(gè)小組的豬肉再直接均 勻噴灑不同量的不同濃度的蛭弧菌液。每小組的蛭弧菌液的噴灑量為 15ml/kg、 35ml/kg、 55ml/kg、 75ml/kg或100ml/kg;蛭弧菌液的濃度為 102pfu/ml、 104pfu/ml、 106pfu/ml、 108pfu/ml、 1010pfu/ml或1012pfu ml。不同濃度的蛭弧菌液均按1:1、 3:2、 2:3進(jìn)行混合，制備蛭弧菌混合液。
經(jīng)上述蛭弧菌液噴灑后的豬肉塊置于室溫下，試驗(yàn)時(shí)間為4小時(shí)，之后 分別檢測(cè)致病菌的含量，四種致病菌的濃度檢測(cè)方法采用MPN檢測(cè)法(單 位為cfU/kg)。檢測(cè)所用特異性培養(yǎng)基同實(shí)施例l。
以BDF01、 BDF02最低濃度(102pfu/ ml)的蛭弧菌液和混合比1:1、 噴灑量最小(15ml/kg)的蛭弧菌混合液的試驗(yàn)組為例，對(duì)消除效果進(jìn)行說明。 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在使用蛭弧菌混合液的實(shí)驗(yàn)組，在 4小時(shí)的試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，致病菌檢測(cè)不到，即完全消除；而施用同樣濃度的單 株蛭弧菌(BDF01或BDF02)的實(shí)驗(yàn)組對(duì)四種致病菌的消除略慢，此時(shí)仍 可檢測(cè)到致病菌的數(shù)量為10cfu/kg，消除效果比2株蛭弧菌混合液的效果稍 差。
比較四種致病菌的初始濃度與終濃度，可知2株蛭弧菌混合液對(duì)沙門氏 菌，豬鏈球菌，梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌消除率可達(dá)到99%以上。由于其它 試驗(yàn)小組的清除效果相同或更好，故在此不再贅述。
關(guān)于對(duì)肉品質(zhì)的評(píng)價(jià)，除了上述從肉的衛(wèi)生安全方面做出檢測(cè)外，還包 括從持水力、pH、嫩度、肉色以及硬度及濕度幾個(gè)方面來考査。
持水力按照目前通用的48小時(shí)滴水法，將肉制品懸掛在(TC-4'C懸掛貯 存48小時(shí)后計(jì)算失重率，使用蛭弧菌的實(shí)驗(yàn)組的豬肉在懸掛48h持水率均 較高，失重率平均為2.2%,而對(duì)照組的失重率則為11%。由此明顯看出對(duì) 照組豬肉品質(zhì)的下降。
從肉色來評(píng)價(jià)，使用蛭弧菌的豬肉呈現(xiàn)鮮紅色，稍有光澤，而未使用蛭 弧菌的豬肉肉色灰白，光澤暗淡，且不斷有水外滲。主觀評(píng)價(jià)可以看出感染 致病菌的豬肉(對(duì)照組)肉色明顯的劣于實(shí)驗(yàn)組。
從pH值測(cè)定來看，感染致病菌的豬肉(對(duì)照組)的pH都接近5，這是 肌肉的持水力下降的標(biāo)志，此時(shí)的pH值對(duì)豬肉的風(fēng)味產(chǎn)生較大影響，而使 用蛭弧菌的實(shí)驗(yàn)組pH值維持在6.5左右，這說明肉的品質(zhì)保持的比對(duì)照組 的要好。
嫩度主要是通過嫩度儀來評(píng)估的，評(píng)估的結(jié)果兩者之間沒有很明顯的區(qū) 別，實(shí)驗(yàn)組嫩度略微的優(yōu)于對(duì)照組。
主觀評(píng)價(jià)硬度主要是通過切面是否容易變形來確定的，而評(píng)價(jià)濕度主要
是通過切面液體滲出的多少來確定的，4h時(shí)對(duì)照組的豬肉切面很容易變形， 而且還有水滲出，可以鑒定等級(jí)為滲出。實(shí)驗(yàn)組的豬肉切面不容易變形，也 沒有水滲出，可以鑒定等級(jí)為潮濕。
從以上肉品質(zhì)的綜合鑒定來看，實(shí)驗(yàn)組的豬肉品質(zhì)明顯的優(yōu)于對(duì)照組。 這說明蛭弧菌在消除禽蛋肉類攜帶的常見致病菌方面效果顯著，可以推廣應(yīng) 用于禽蛋肉類的保藏和加工工業(yè)。
實(shí)施例3
蛭弧菌在消除養(yǎng)豬場(chǎng)環(huán)境中的常見致病菌的應(yīng)用試驗(yàn)
試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件 步驟一及二均同實(shí)施例1 步驟三(1)致病菌的消除試驗(yàn)
以某一養(yǎng)豬場(chǎng)為例，在未施用蛭弧菌前之一年，由于豬養(yǎng)殖衛(wèi)生條件不
好，養(yǎng)殖環(huán)境中的豬鏈球菌、大腸桿菌等較多，經(jīng)常達(dá)1(^cfu/cr^以上。因
此為控制它們的病害，養(yǎng)殖場(chǎng)常在飼料中添加抗生素，如此導(dǎo)致豬肉的品質(zhì) 下降，出口貿(mào)易受到限制。同時(shí)，養(yǎng)殖衛(wèi)生條件不好，肉豬易出現(xiàn)腸炎、豬 肺疫等病害。
為了探索健康、綠色的養(yǎng)豬方法，該養(yǎng)豬場(chǎng)試用本發(fā)明的應(yīng)用方法，分 成多個(gè)不同試驗(yàn)組，對(duì)豬的欄圈、用具、詞料、豬身上均勻噴灑濃度為l(^pfU/ml 的2株蛭弧菌任意混合液(本實(shí)施例采用1:1)，噴灑使用量則按試驗(yàn)組的 不同分別為15ml/m2、 35ml/m2、 55 ml/m2、 75 ml/m2、或100ml/m2，每隔2 天噴灑一次。在隨后的環(huán)境病菌檢測(cè)中，僅在噴灑量為15ml/r^試驗(yàn)組中檢 測(cè)到少量的大腸桿菌，其他噴灑量的試驗(yàn)組致病菌幾乎檢測(cè)不到。如此使用， 一年下來，雖然抗生素停止了使用，但豬的病害基本沒有發(fā)生。作為肉豬售 出時(shí)的各項(xiàng)檢測(cè)均合格，達(dá)到了出口標(biāo)準(zhǔn)，其肉質(zhì)比在飼料中加了抗生素的 要好。
本試用研究的結(jié)果表明蛭弧菌在消除畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌、甚至防治 其病害方面的效果顯著，可改善豬的體質(zhì)，防治豬的病害的發(fā)生，消除藥物 或者抗生素的使用，提升豬肉品質(zhì)。由此可見，蛭弧菌菌劑可以廣泛地推廣 應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖基地。
實(shí)施例4
蛭弧菌在消除禽蛋及肉類的保藏環(huán)境、運(yùn)輸工具攜帶的常見致病菌的應(yīng) 用試驗(yàn)
試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件 步驟一及二均同實(shí)施例1 步驟三(1)致病菌的消除試驗(yàn)
采用本發(fā)明的應(yīng)用方法，分成多個(gè)不同試驗(yàn)組，對(duì)保藏禽蛋及肉類的冷
庫地面和墻體、運(yùn)輸禽蛋及肉類集裝箱內(nèi)表面，均勻噴灑濃度為102pfii/ml 的2株蛭弧菌按1:1混合的混合液，噴灑使用量則按試驗(yàn)組的不同分別為 10ml/m2、 30ml/m2、 50 ml/m2、 70 ml/m2、或100 ml/m2，每天噴灑一次，連 續(xù)噴灑兩天，在隨后的環(huán)境病菌檢測(cè)中，僅在噴灑量為10ml/m2試驗(yàn)組中檢 測(cè)到少量的豬鏈球菌，其他噴灑量的試驗(yàn)組沒有檢測(cè)到沙門氏菌，豬鏈球菌， 梭狀芽胞桿菌及大腸桿菌等常見致病菌。本試用研究的結(jié)果表明蛭弧菌在消 除保藏、運(yùn)輸過程中致病菌方面的效果顯著，可確保禽蛋及肉類產(chǎn)品品質(zhì)。 由此可見，蛭弧菌可以廣泛地推廣應(yīng)用于禽蛋及肉類產(chǎn)品的保藏與運(yùn)輸。
權(quán)利要求
1、一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一蛭弧菌的分離純化對(duì)采集的水體或底泥進(jìn)行預(yù)處理，接種增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌，倒雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，再按微生物學(xué)方法液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑，并重復(fù)若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑，即為一株蛭弧菌純菌株，按同一時(shí)間內(nèi)單斑大小計(jì)，分離出2株蛭弧菌純菌株，所述蛭弧菌是指在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，Bdellovibrio sp.BDF01，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 208008和Bdellovibrio sp.BDF02，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 208009；步驟二蛭弧菌液的制備將2株蛭弧菌分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別制成濃度為102～1012pfu/ml的蛭弧菌液，待用；步驟三蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用采用上述2株蛭弧菌按任意比例混合的蛭弧菌混合液或單株蛭弧菌液，以噴灑或者擦涂或者浸漬的方法處理攜帶有致病菌的禽蛋及肉類產(chǎn)品，其中采用浸漬的方法蛭弧菌濃度至少達(dá)到102pfu/ml；采用噴灑或者擦涂的方法使用濃度≥102pfu/ml的蛭弧菌液時(shí)，直接應(yīng)用于禽蛋及肉類產(chǎn)品，其使用量至少達(dá)到15ml/kg；應(yīng)用于環(huán)境，其使用量至少達(dá)到10ml/m2。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病 菌的應(yīng)用，其特征在于所述蛭弧菌混合液的混合比例為BDF01:BDF02 為1:1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用環(huán)境包括畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境、保藏環(huán)境 和禽蛋及肉類產(chǎn)品運(yùn)輸工具、加工過程。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法用于畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境致病菌的消除時(shí)，采用噴灑的方法當(dāng)使用濃度≥10 2 pfu/ml的蛭弧菌液時(shí)，使用量范圍為35 55ml/m2。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見 致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法用于禽蛋及肉類保藏或運(yùn)輸環(huán)境 中致病菌的消除時(shí)，采用噴灑的方法當(dāng)使用濃度≥102 pfu/ml的蛭弧菌液時(shí)，使用量范圍為30 50ml/m2。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法用于消除禽蛋及肉類加工過程中所攜帶的致病菌時(shí)，采用浸漬的方法蛭弧菌濃度范圍為10 4 10 6pfu/ml，采用噴灑或者擦涂的方法使用濃度≥10 2pfu/ml的蛭弧菌液時(shí)，使用量范圍為 35—55ml/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛭弧菌在消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌的應(yīng)用，用蛭弧菌液以噴灑或者擦涂或者浸漬的方法處理攜帶有致病菌的禽蛋及肉類，采用浸漬的方法時(shí)蛭弧菌濃度至少達(dá)到10²puf/ml，采用噴灑或者擦涂的方法使用濃度≥10²pfu/ml的蛭弧菌液時(shí)，使用量至少達(dá)到15ml/kg。公開的2株蛭弧菌可分別獨(dú)立使用，但混合使用效果更佳。采用本應(yīng)用方便、安全且無副作用，消除禽蛋及肉類攜帶的常見致病菌效果顯著，致病菌清除率均在99％以上?？蛇m用于從“養(yǎng)殖到餐桌”包括禽蛋肉類加工在內(nèi)的全過程，直接提高了產(chǎn)品品質(zhì)。對(duì)提高食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)A23B5/00GK101341901SQ200810030158
公開日2009年1月14日 申請(qǐng)日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日
發(fā)明者蔡俊鵬, 馬小花 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)