專利名稱：：用于從酵母細胞培養(yǎng)物提取成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用磷脂酶從酵母細胞培養(yǎng)物提取成分的方法。
背景技術(shù)：
：使用酵母培養(yǎng)物作為來源用于提取多種成分。術(shù)語"酵母提取物"通常用于源自已進行細胞物質(zhì)水解的酵母細胞的可溶性物質(zhì)濃縮物，尤其是蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物和核酸。酵母細胞也可以用作特定單一成分的來源，這些單一成分是從酵母細胞提取和純化的。這些成分可以由所述酵母天然產(chǎn)生，或者可以在遺傳操作之后由酵母細胞產(chǎn)生。在產(chǎn)生酵母提取物和從酵母細胞培養(yǎng)物純化特定成分這兩種情況下，都期望增加感興趣的產(chǎn)物的產(chǎn)率(yield)以改進生產(chǎn)的經(jīng)濟性。酵母提取物的產(chǎn)生在Nagodawithana(1995)SavoryFlavours,EsteekayAssociates,Inc.,Wisconsin,USA的第240-251頁上描述。發(fā)明概述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用磷脂酶處理酵母細胞培養(yǎng)物促進從培養(yǎng)物提取成分。因此，本發(fā)明涉及用于從酵母提取一種或多種成分的方法，該方法包括i)用磷脂酶處理酵母細胞；和ii)從處理的酵母細胞分離期望的一種或多種成分。在其它方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生酵母提取物的方法和使用純化的磷脂酶從酵母細胞培養(yǎng)物提取一種或多種成分的方法。發(fā)明詳述酵母本發(fā)明的方法中使用的酵母細胞培養(yǎng)物可以是任何酵母的培養(yǎng)物，例如酵母屬(&cc/zaram^^)的菌抹，例如釀酒酵母(S.cewv^ae)、葡萄汁酵母(S.克魯維酵母屬(K/w"eramyce》的菌抹，例如，脆壁克魯維酵母(K./ra^7/力和馬克斯克魯維酵母(iCwa^aV2"w);或念珠菌屬(Ca"^^)的菌抹，例如產(chǎn)朊念珠菌(C.Wz7/力?？梢赃x擇產(chǎn)生一種或多種期望成分的酵母細胞培養(yǎng)物，和/或可以已將酵母細胞培養(yǎng)物進行遺傳修飾以產(chǎn)生一種或多種特定成分和/或增加一種或多種特定成分的產(chǎn)率。用于遺傳修飾酵母細胞的方法是本領(lǐng)域/>知的，例如通過插入編碼期望的蛋白質(zhì)成分的DNA來進4亍。在進行本發(fā)明的方法之前，可以使酵母細胞培養(yǎng)物在有利于該細胞培養(yǎng)物生長和/或有利于以高產(chǎn)率產(chǎn)生一種或多種期望的成分的條件下增殖。要提取的成分通過本發(fā)明的方法要從酵母提取的成分可以是由酵母天然產(chǎn)生的任何成分，或者是由經(jīng)過遺傳修飾以產(chǎn)生期望的成分的酵母所產(chǎn)生的任何成分。酵母中可以產(chǎn)生的成分包括例如酶；維生素，例如B1、B6和B12;抗生素；蝦青素；聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoate);番茄紅素；(3-胡蘿卜素；人血清白蛋白；y-S內(nèi)酷；和順式-3-己醇。在本發(fā)明的一個實施方式中，要從酵母提取的成分是蛋白質(zhì)，具體而言是酶，例如乳糖酶。在本發(fā)明的另一個實施方式中，要從酵母提取的成分是非蛋白質(zhì)成分，例如碳水化合物。在本發(fā)明的一個實施方式中，要提取的一種或多種成分是酵母提取物，如下所述。分離(separation)根據(jù)本發(fā)明，在用磷脂酶處理之后，從酵母細胞培養(yǎng)物分離期望的一種或多種成分。分離可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來完成，這取決于待分離的特定的一種或多種成分。分離可以通過例如以下方法來實現(xiàn)離心；過濾，例如微濾或超濾；層析技術(shù)，例如大小排阻層析、離子交換層析、親和層析、疏水相互作用層析；和/或沉淀，例如通過添加鹽，例如石充酸4妄?？梢酝ㄟ^幾種分離技術(shù)的組合來實現(xiàn)分離，例如可以使用離心來去除細胞壁碎片，隨后可以使用一種或多種層析技術(shù)來分離一種或多種特定成分。為了促進分離，在分離之前可以對酵母細胞施用用于破壞酵母細胞的方法，例如均質(zhì)化和/或添加促進細胞石皮碎的一種或多種成分，例如氯化鈉、乙酸乙酯或異丙醇。本發(fā)明的方法可以促進從酵母培養(yǎng)物分離一種或多種期望的成分，例如通過減少要去除的顆粒材料的量來進行。與不包括磷脂酶處理的相似提取方法相比，本發(fā)明的方法還可以增加一種或多種期望成分的產(chǎn)率。水解在本發(fā)明的一個實施方式中，在使用磷脂酶的處理之前、之后或過程中對酵母細胞培養(yǎng)物進行蛋白質(zhì)水解。蛋白質(zhì)的水解可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法實現(xiàn)，例如通過蛋白水解酶。蛋白水解酶可以是例如酵母細胞中存在的并且例如通過細胞的機械破裂、通過質(zhì)壁分離或自溶而釋放的蛋白水解酶。還可以向酵母細胞培養(yǎng)物添加一種或多種純化的蛋白水解酶。水解可以如下文"酵母提取物"中所述來實現(xiàn)。酵母提取物在本發(fā)明的一個實施方式中，要提取的一種或多種成分是酵母提取物。因此在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生酵母提取物的方法，該方法包括i)使用純化的磷脂酶處理酵母細胞；和ii)對處理的酵母細胞進行蛋白質(zhì)水解；和iii)去除酵母細胞成分；其中步驟ii)在步驟i)的之前、之后或過程中進行。酵母提取物是在細胞材料水解之后源自酵母細胞培養(yǎng)物的可溶性物質(zhì)的濃縮物，特別是蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物和核酸。酵母提取物可以用于食品應(yīng)用中作為調(diào)味劑/增味劑(flavouringagent/enhancer)，也可以用于促進工業(yè)發(fā)酵中的微生物生長。酵母提取物的價值很大程度上依賴于該提取物中蛋白質(zhì)的量，因此期望實現(xiàn)可能的最高蛋白產(chǎn)率。用于產(chǎn)生酵母提取物的原料可以是來自任何來源的任何酵母細胞培養(yǎng)物。通常，原料是為了產(chǎn)生酵母細胞提取物專門培養(yǎng)的酵母細胞培養(yǎng)物，或是在釀造中使用之后由釀酒廠丟棄的經(jīng)使用后的釀酒酵母(spentbrewersyeast)。酵母提取物的產(chǎn)生是本領(lǐng)域公知的。用于產(chǎn)生酵母提取物的酵母培養(yǎng)物包括例如酵母屬菌抹，例如釀酒酵母、葡萄汁酵母；克魯維酵母屬菌^^,例如脆壁克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母；和念珠菌屬菌抹，例如產(chǎn)朊念珠菌。如果使用的是經(jīng)使用后的釀酒酵母，在產(chǎn)生4是取物之前通常對其進行脫苦(debitter)以去除苦味，例如通過在pH8-9洗滌來進行。水解通常以自溶的方式進行，其中利用酵母細胞自身的水解酶來破壞細胞和水解細胞成分。對于自溶通常對pH和溫度進行控制以實現(xiàn)酵母細胞的死亡而不j吏內(nèi)部的酶失活。自i^可以例如在pH7在55-60。C進行20小時。技術(shù)人員可以選擇適合于特定的酵母培養(yǎng)物和期望的風味特性的pH和溫度條件。pH和溫度條件還可能影響獲得的提取物的產(chǎn)率?？梢岳缤ㄟ^自溶產(chǎn)物中氨基氮(AN)相對于總氮(TN)量的比率來測量自溶的程度。對于高度自溶的培養(yǎng)基，AN/TN比通常為0.4-0.5。可以添加一種或多種水解酶以促進水解。最常見的是添加蛋白酶來增加蛋白質(zhì)水解的速率。在特定條件下有活性的任何蛋白酶均可使用，這取決于期望的產(chǎn)物特性。使用的蛋白酶可以是例如動物、植物或微生物來源的蛋白酶，例如源自細菌或真菌的蛋白酶。可以添加的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin),例如卡爾斯伯枯草桿菌蛋白酶(SubtilisinCarlsberg),或真菌蛋白酶，例如源自曲霉屬(A^ergz7/^)菌林例如米曲霉04.0^zae)的蛋白酶?？捎糜诒景l(fā)明方法的商業(yè)蛋白酶的實例包括Alcalase②和Fkvourzyme⑧，均可從丹麥Bagsvaerd的NovozymesA/S獲得。在本發(fā)明的一個實施方式中，添加一種或多種純化的蛋白酶以促進蛋白質(zhì)的水解。水解還可以通過質(zhì)壁分離來實現(xiàn)，其中添加誘發(fā)細胞死亡和細胞破裂的化合物例如氯化鈉、乙酸乙酯或異丙醇，導致內(nèi)部水解酶的釋放?？梢詫⒆匀芎唾|(zhì)壁分離組合，例如通過在已經(jīng)使自溶過程進行了規(guī)定的一段時間之后向培養(yǎng)基添加氯化鈉。還可以使用酸水解來獲得酵母細胞成分的水解。可以例如通過向酵母培養(yǎng)物添加鹽酸來進行酸水解，通常該酵母培養(yǎng)物將是固體濃度為65-80%的漿料形式。水解通常在高溫進行，例如高達大約100。C，并且可以例如在降膜蒸發(fā)器中進行。在達到氨基氮的要求水平之后，可以將水解產(chǎn)物調(diào)節(jié)至期望的pH，例如pH5-7，通常使用氫氧化鈉來進行。水解之后通過分離來去除不需要的成分，通常是未水解的細胞碎片，從而產(chǎn)生酵母提取物。分離可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法(通常通過離心和/或過濾)來實現(xiàn)。可以對提取物進行巴氏消毒以殺死任何營養(yǎng)細胞、滅活酶和防止微生物污染物的生長。通常將對提取物進行濃縮，例如通過在降膜蒸發(fā)器中蒸發(fā)來進行。還可以干燥濃縮物，例如通過噴霧干燥或轉(zhuǎn)鼓式干燥，以生成酵母提取物粉末。終產(chǎn)物將通常作為液體、糊劑(paste)或粉末出售。磷脂酶本發(fā)明的方法中使用的磷脂酶包括磷脂酶A"磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D,以及它們的任意組合。在本發(fā)明的方法中，用磷脂酶處理酵母細胞培養(yǎng)物，例如用單一磷脂酶處理；用兩種或更多種磷脂酶處理酵母細胞培養(yǎng)物，例如用兩種磷脂酶，包括但不限于，用A型和B型兩種處理；用A,型和A2型兩種處理；用A,型和B型兩種處理；用A2型和B型兩種處理；用A,型和C型兩種處理；用A2型和C型兩種處理；或者用相同類型的兩種或更多種不同磷脂酶處理酵母細胞培養(yǎng)物。還包括用一種類型的磷脂酶例如Ai、A2、B、C或D的處理。磷脂酶活性也可以由具有其它活性的醇提供，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可以例如來自具有磷脂酶副活性的脂肪酶。在本發(fā)明的其它實施方式中，磷脂酶酶活性由基本上僅具有磷脂酶活性的酶提供，并且其中磷脂酶酶活性不是副活性。根據(jù)標準酶EC分類將磷脂酶A定義為EC3.1丄32。官方名稱磷脂酶A,。催化的反應(yīng)磷脂酰膽堿+水<=>2-酰基甘油磷酸膽堿+脂肪酸陰離子注釋具有比EC3丄1.4廣泛得多的特異性。根據(jù)標準酶EC分類將磷脂酶A2定義為EC3丄1.4官方名稱磷脂酶八2。別名磷脂酰膽堿2-?；饷?。卵磷脂酶a;磷脂酶(phosphatidase);或磷脂酶(phosphatidolipase)。催化的反應(yīng)磷脂酰膽堿+水<=>1-酰基甘油磷酸膽堿+脂肪酸陰離子注釋還作用于磷脂酰乙醇胺、膽堿縮醛磷脂和磷脂，將附接于2-位的脂肪酸去除。根據(jù)標準酶EC分類將磷脂酶B定義為EC3丄1.5。官方名稱溶血磷脂酶。別名卵磷脂酶b;溶血卵磷脂酶；磷脂酶B;或PLB。卵磷脂酶a;磷脂酶(phosphatidase);或磷脂酶(phosphatidolipase)。催化的反應(yīng)2-溶血磷脂酰膽石咸+水<>甘油磷酸膽石咸+脂肪酸陰離子根據(jù)標準酶EC分類將磷脂酶C定義為EC3丄4.3。磷脂酶C水解磷脂酰膽堿和其它甘油磷脂例如磷脂酰乙醇胺的磷酸鍵，生成二酰基甘油；這種酶還將水解鞘磷脂、心磷脂、膽堿縮醛磷脂和神經(jīng)酰胺磷脂的磷酸鍵。與磷脂酰膽堿的反應(yīng)磷脂酰膽堿+水<=>1，2-二?；视?磷酸膽堿根據(jù)標準酶EC分類將磷脂酶D定義為EC3丄4.4。磷脂酶D水解磷脂和鞘磷脂的磷酸^;,生成相應(yīng)的磷脂酸。與磷脂酰膽;威的反應(yīng)磷脂酰膽石威+水<=>膽;威+磷脂酸(phosphatidate)磷脂酶A磷脂酶A活性，包括磷脂酶A!、磷脂酶A2和它們的組合，可以由也具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶A活性的脂肪酶。磷脂酶A活性可以來自例如具有磷脂酶副活性的脂肪酶。在本發(fā)明的其它實施方式中，磷脂酶A酶活性由基本上僅具有磷脂酶A活性的酶提供，并且其中所述磷脂酶A酶活性不是副活性。磷脂酶A可以是任何來源的，例如動物來源(例如，哺乳動物)，例如來自胰(例如牛胰或豬胰)，或蛇毒或蜂毒。或者，磷脂酶A可以是微生物來源，例如來自絲狀真菌、酵母或細菌，例如以下菌屬或菌種曲霉屬(Aspergillus)，例如黑曲霉(A.niger);網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)，例如盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum);毛霉屬(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、細孑包毛霉(M.subtilissimus);脈孢菌屬(Neurospora)，例如粗并造月永孢菌(N.crassa);根毛菌屬(Rhizomucor),例如微小根毛霉(R.pusillus);根霉屬(Rhizopus)，例如少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer);核盤菌屬(Sclerotinia),例如大豆核盤菌(S.libertiana);毛蘚菌屬(Trichophyton),例如紅色毛蘚菌(T.rubrum);Whetzelinia菌屬，例如W.sclerotiorum;芽孢桿菌屬(Bacillus),例如巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis);檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，例如弗式檸檬酸桿菌(C.freundii);腸桿菌屬(Enterobacter)，例如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、陰溝腸桿菌(E.cloacae);愛德華氏菌屬(Edwardsiella),遲鈍愛德華氏菌(E.tarda);歐文氏菌屬(Erwinia),例如草生歐文氏(E.herbicola);埃希氏菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌(E.coli);克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae);變形菌屬(Proteus),例如普通變形菌(P.vulgaris);普羅威登斯菌屬(Providencia),例如斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii);沙門氏菌(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium);沙雷氏菌屬(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens);志賀氏菌屬(Shigella)，例如弗氏志賀氏菌(S.flexneri);鏈霉菌屬(Streptomyces)，例如S.violeceoruber,耶爾森氏菌屬(Yersinia),例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)。由此，磷脂酶A可以是真菌的，例如源自核菌(Pyrenomycetes)類，例如鐮孢屬(genusFusarium)，例如大刀鐮孢(F.culmorum)、異孢鐮孢(F.heterosporum)、腐皮鐮孢(Rsolani)的菌抹，或尖鐮孢(F.oxysporum)的菌抹。磷脂酶A還可以來自曲霉屬內(nèi)的絲狀真菌菌才朱，例如泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、黑曲霉或米曲霉(Aspergilluoryzae)的菌抹。優(yōu)選的磷脂酶A源自鐮孢屬的菌抹，尤其是鑲片鐮孢(F.venenatum)或尖鐮孢，例如來自WO98/26057中所述的菌抹DSM2672，特別是在WO98/26057的權(quán)利要求36和SEQIDNO.2中所述。另一個優(yōu)選的磷脂酶A是來自鏈霉菌屬的PLA2，例如來自S.violaceomber的PLA2。在另外的實施方式中，磷脂酶是如WO00/32758(NovozymesA/S,Denmark)中公開的磷脂酶。可以將A型磷脂酶的活性例如以Lecitase單位(LEU)表示。使用卵磷脂作為底物相對于磷脂酶標準物來測量以Lecitase單位表示的磷脂酶活性。磷脂酶A催化卵磷脂水解為溶血卵磷脂和游離脂肪酸。將釋放的脂肪酸用0.1N氬氧化鈉在標準條件(pH8.00;40.00。C土0.5)下滴定。測定在脂肪酸的中和過程中氫氧化鈉的消耗的速率作為磷脂酶A的活性，并且相對于Lecitase(磷脂酶)標準物(可從NovozymesA/S，Bagsvsrd，Denmark獲得)以Lecitase單位(LEU)表示。將1LEU定義為標準條件(pH8.00;40.00。C士0.5)下與稀釋至1LEU/g標稱活性的Lecitase標準物產(chǎn)生相同的氫氧化鈉消耗速率()imol/min)的酶量。磷脂酶B術(shù)語"磷脂酶B"用于本文中與本發(fā)明的酶相關(guān)時意欲包括具有磷脂酶B活性的酶。磷脂酶B活性可以由也具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶B活性的脂肪酶。磷脂酶B活性可以例如來自具有磷脂酶B副活性的脂肪酶。在本發(fā)明的另一個實施方式中，磷脂酶B酶活性由基本上僅具有磷脂酶B活性的酶提供，并且其中所述磷脂酶B酶活性不是副活性。在本發(fā)明的一個實施方式中，磷脂酶B不是如WO98/26057中限定的具有磷脂酶B副活性的脂肪酶。磷脂酶B可以是任何來源，例如動物(例如哺乳動物)來源，例如來自肝(例如大鼠肝臟)。或者，磷脂酶B可以是微生物來源，例如來自絲狀真菌、酵母或細菌，例如以下菌屬或菌種曲霉屬，例如臭曲霉、煙曲霉(A.flimigatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉、米曲霉；葡萄孢屬(Botrytis),例如灰葡萄孢(B.cinerea);念i朱菌屬(Candida)，例如白念珠菌(C.albicans);隱J求菌屬(Cryptococcus)，例如新生隱球菌(C.neoformans)，埃希氏菌屬，例如大腸桿菌，鐮孢屬，例如擬分枝孢鐮孢(F.sporotrichioides)、鑲片鐮孢、輪狀鐮孢(F.verticillioides);Hyphozyma;克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis);Magnaporte,例i口M.grisea;纟錄"f畺菌屬(Metarhizium),例3口綠僵菌(M.anisopliae);J求腔菌屬(Mycosphaerella)，例如禾生J求腔菌(M.graminicola);脈孢菌屬，例如粗糙脈孢菌；青霉屬(Penicillium)，例如特異青霉(Rnotatum);酵母屬(Saccharomyces),例i口西良酒酵母(S.cerevisiae);裂歹直酵母屬(Schizosaccharomyces),例如粟酒裂殖酵母(S.pombe);有孢圓酵母屬(Tomlaspora),例如戴爾有孢圓酵母(T.delbrueckii);弧菌屬(Vibrio);例如霍亂弧菌(V.cholerae)。優(yōu)選的磷脂酶B源自曲霉屬的菌抹，尤其是源自黑曲霉的磷月旨酶LLPL-1或LLPL-2，例如大腸桿菌克隆DSM13003或DSM13004中所含的，或源自米曲霉的磷脂酶LLPL-1或LLPL-2,如WO01/27251中描述的大腸桿菌克隆DSM13082或DSM13083中所含的，特別是WO01/27251的權(quán)利要求1和SEQIDNOs.2、4、6或8中所描述的。磷脂酶C磷脂酶c活性可以由也具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶c活性的脂肪酶或具有磷脂酶c活性的磷酸酶。磷脂酶c活性可以例如來自具有磷脂酶c副活性的脂肪酶。在本發(fā)明的其它實施方式中，磷脂酶c酶活性由基本上僅具有磷脂酶c活性的酶提供，并且其中所述磷脂酶c活性不是副活性。磷脂酶c可以是任何來源的，例如動物來源，例如哺乳動物來源的，植物來源的或微生物來源，例如真菌來源或細菌來源的，例如來自分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌抹，例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)或牛分枝桿菌(M.bovis);芽孢桿菌屬菌抹，例如蠟樣芽孢桿菌(B.cereus);梭菌屬(Clostridium)菌枒、，例如雙酶4炎菌(C.bifermentans)、溶血4炎菌(C.haemolyticum)、諾氏斗菱菌(C.novyi)、索氏梭菌(C.sordeim)或產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens);利斯特氏菌屬(Listeria)菌抹，例如單核細胞增生利斯特菌(L.monocytogenes);假單胞菌屬(Pseudomonas)菌抹，例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa);或葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌抹，例如金黃色葡萄球菌(S.aureus);或伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)菌才朱，例如類鼻疽伯克霍爾德氏菌(B.pseudomallei)。磷脂酶D磷脂酶D活性可以由也具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶D活性的脂肪酶、具有磷脂酶D活性的磷酸酶或具有磷脂酶D活性的膽堿酯酶。磷脂酶D活性可以例如來自具有磷脂酶D副活性的脂肪酶。在本發(fā)明的其它實施方式中，磷脂酶D酶活性由基本上僅具有磷脂酶D活性的酶提供，并且其中所述磷脂酶D酶活性不是副活性。磷脂酶D可以是任何來源的，例如動物來源，例如哺乳動物來源的，例如來自小鼠、大鼠或中國倉鼠；植物來源的，例如來自甘藍、玉米、稻、蓖麻(castorbean)、步因草、5工豆(cowpea)或4以南芥(Arabidopsisthaliana);或《效生物來源的，例如細菌來源的，例如來自才奉桿菌屬(Corynebacterium)菌4朱，例如假結(jié)核棒桿菌(C.pseudotuberculosis),潰瘍棒桿菌(C.ulcerans)或溶血棒桿菌(Chaemolyticum);或真菌來源的，例如來自鏈霉菌屬的菌抹，例如抗生鏈霉菌(S.antibioticus)或色褐4連霉菌(S.chromofuscus);木霉屬(Trichoderma)的菌才朱，例如里氏木霉(T.reesei);酵母屬的菌抹，例如釀酒酵母；或曲霉屬的菌抹，例如米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉或煙曲霉。酶來源和配制物(formulation)本發(fā)明的方法中使用的磷脂酶可以源自或可獲得自本文提到的任何來源。術(shù)語"源自"在本上下文中的意思是酶可分離自天然存在該酶的生物，即所述酶的氨基酸序列的特征(identity)與天然酶一樣。術(shù)語"源自"還指酶可在宿主生物中重組產(chǎn)生，所述重組產(chǎn)生的酶具有與天然酶一樣的特征或具有修飾的氨基酸序列，例如缺失、插入和/或取代一個或多個氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段。天然酶的意思包括天然變體。此外，術(shù)語"源自，，包括通過例如肽合成等合成產(chǎn)生的酶。術(shù)語"源自"還包括經(jīng)〗務(wù)飾的酶，例如通過糖基化、磷酸化等，無論體內(nèi)或體外修飾的酶。術(shù)語"可獲得"在本上下文中的意思是酶具有與天然酶一致的氨基S吏序列。所述術(shù)語包括已經(jīng)從天然存在該酶的生物分離的酶，或在相同類型的生物或其它生物中重組表達的酶，或通過例如肽合成等合成產(chǎn)生的酶。關(guān)于重組產(chǎn)生的酶，術(shù)語"可獲得，，和"源自，，指酶的特征，而非重組產(chǎn)生該酶的宿主生物的特征。因此，可以通過使用任何合適的技術(shù)從微生物獲得磷脂酶。例如，可以用本領(lǐng)域已知的方法通過將合適的微生物發(fā)酵和隨后從所得發(fā)酵液或微生物分離磷脂酶制備物來獲得磷脂酶酶制備物。還可以通過使用重組DNA技術(shù)來獲得磷脂酶。這種方法通常包括培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述重組DNA載體包含編碼所述磷脂酶的DNA序列，并且所述DNA序列與適當?shù)谋磉_信號可操作地連接，由此能夠在允許表達所述酶的條件下在培養(yǎng)基中表達磷脂酶；和從培養(yǎng)物回收酶。還可以將DNA序列并入宿主細胞的基因組。DNA序列可以是基因組、cDNA或合成來源的或這些來源任何組合，并且可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法分離或合成。合適的磷脂酶是商業(yè)上可獲得的。商品化的酶的實例是例如Lecitase(NovozymesA/S,Bagsvasrd，Denmark)、YieldMAX(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark和Chr.HansenA/S,H0rsholm,Denmark)、Lysomax(GenencorInternational,Inc.,PaloAlto,California)或PurifineTM(DiversaCorp.,SanDiego,California)。合適的磷脂酶B是例如黑曲霉磷脂酶LLPL-2,其能夠在黑曲霉中重組產(chǎn)生，如WO01/27251中所述。在本發(fā)明的方法中磷脂酶是純化的磷脂酶。術(shù)語"純化的"用于本文包括去除了來自生物的成分的磷脂酶酶制備物，所述磷脂酶酶制備物源自所述生物。術(shù)語"純化的，，還包括不含(freefrom)來自天然生物的成分的磷脂酶酶蛋白，所述磷脂酶酶蛋白從該天然生物獲得，這也被稱為"基本上純的(essentiallypure)"磷脂酶，并且可與天然存在且未經(jīng)遺傳修飾的磷脂酶特別相關(guān)，所述遺傳修飾如通過缺失、取代或插入一個或多個氨基酸殘基來進行。因此，可將磷脂酶純化，即只存在較少量其它蛋白質(zhì)。表述"其它蛋白質(zhì)"具體涉及其它酶。本文所用術(shù)語"純化的"還指去除其它成分，特別是其它蛋白質(zhì)，并且最特別是存在于磷脂酶來源的細胞中的其它酶。磷脂酶可以是"基本上純的(substantiallypure)",即不含來自產(chǎn)生該磷脂酶的生物的其它成分，所述產(chǎn)生該磷脂酶的生物即，例如，用于重組產(chǎn)生磷脂酶的宿主生物。優(yōu)選地，所述酶是至少75%(重量/重量)純的，更優(yōu)選至少80%、85%、90%或甚至至少95%純的。在還更優(yōu)選的實施方式中，所述磷脂酶是至少98%純的酶蛋白制備物。術(shù)語"磷脂酶，，包含對于所述酶的催化活性可為必需的任何輔助化合物(auxiliarycompound),例3口，合適的受體(acceptor)或壽甫因子(cofactor)，其可以是或可以不是天然存在于反應(yīng)體系中的。磷脂酶可為適于所述用途的任何形式，例如以下形式干粉末或顆粒(granulate)、無粉塵的顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體(stabilizedliquid)或保護的酶。可以例如US4,106,991和US4,661,452所公開的來產(chǎn)生顆粒，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法來涂覆它們。例如，可以才艮據(jù)已確定的方法通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其它多元醇(polyol)、乳酸或其它有機酸來使液體酶制備物穩(wěn)定化。保護的酶可以根據(jù)EP238216中公開的方法制備。使用磷脂酶的處理根據(jù)本發(fā)明使用純化的磷脂酶處理酵母細胞。處理可以通過任何適當?shù)姆椒ㄟM行，例如通過向酵母細胞培養(yǎng)物添加磷脂酶。當使用磷脂酶處理時，可以將酵母細胞培養(yǎng)物例如懸浮于水中。使用磷脂酶的處理可在對酵母細胞培養(yǎng)物進行蛋白質(zhì)水解的之前、之后或同時進行。技術(shù)人員能夠通過本領(lǐng)域已知用于優(yōu)化酶反應(yīng)的常規(guī)方法獲得進行磷脂酶處理的合適條件。技術(shù)人員將知曉如何調(diào)整參數(shù)以獲得理想的結(jié)果，這些參數(shù)例如pH、溫度和磷脂酶的量。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用磷脂酶的處理在pH2-pH10，例如pH3-pH9，pH2-pH6，或pH4-pH6進行。本發(fā)明的方法中使用的磷脂酶量可依賴于特定磷脂酶的活性。當使用磷脂酶A時，磷脂酶的量可以是例如每克干物質(zhì)0.001-1mg酶蛋白，例如每克干物質(zhì)0.005-0.1mg酶蛋白。在本發(fā)明的一個實施方式中，以這樣的量添加磷脂酶，這種添加量足以使要提取的一種或多種成分的產(chǎn)率與未進行磷脂酶處理的相似提取方法相比得到增加。產(chǎn)率可以例如增加至少1%,例如至少2%,至少5%,至少10%,或至少20%。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及純化的磷脂酶例如磷脂酶A！用于從酵母細胞培養(yǎng)物提取一種或多種成分的用途。實施例實施例1將釀酒酵母的成塊酵母細胞培養(yǎng)物(blockyeastcellculture)與去離子水混合以達到14%的干物質(zhì)含量，并且通過^i力攪拌器在室溫攪拌60分鐘。通過燃燒法在LecoFP-528上測定這種酵母混合物中的氮量。通過稱重(在105°C干燥之后)測量酵母混合物中的干固體。將酵母混合物加熱至55。C并且用4NNaOH將pH調(diào)節(jié)至6.5。使用0.25%(重量/酵母干物質(zhì)的重量)的磷脂酶(LecitaseUltra,10kLU/gNovozymesA/S,Denmark)和/或0.5%(重量/酵母干物質(zhì)的重量)的蛋白水解酶(Alcalase⑧2.4L,NovozymesA/S,Denmark)來處理樣品。在55。C預熱10分鐘后向酵母混合物添加酶。對照樣品(空白)不用酶處理。自溶在磁力攪拌下在55°C進行22小時。取出20ml樣品并且稱重精確量。將樣品在85。C失活10分鐘。在失活之后，使用來自Heraeus的Multifoge3S-R將樣品在3500rpm離心10分鐘。傾析之后稱重提取物的量。通過稱重(在105。C干燥之后)測量提取物中的干固體。提取物中氮的量通過燃燒法在LecoFP-528上測定。蛋白質(zhì)的量計算為氮量乘以6.25。游離氨基氮使用OPA(鄰苯二醛)方法測定?；谝陨蠝y量進行以下計算%提取物產(chǎn)率=(g離心后提取物)/(g離心前酵母混合物)*100%蛋白質(zhì)產(chǎn)率=(g離心后提取物"是取物中蛋白質(zhì)含量)/(g離心前酵母混合物*酵母混合物的蛋白質(zhì)含量)*100水解度=(斷開的肽鍵數(shù)/肽鍵總數(shù))*100=(h/htot)*100其中將h表示為meqv絲氨酸NH2的函數(shù)h=(絲氨酸NH2-0.4)/1;而且htot=7.8。通過測量在340nm的吸光度相對于含有100mg/L的絲氨酸標準物來測量絲氨酸NH2?；趦纱螠y定的結(jié)果示于表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例3將釀酒酵母的成塊酵母細胞培養(yǎng)物與去離子水混合以達到14%的干物質(zhì)含量，并且通過磁力攪拌器在室溫攪拌60分鐘。通過燃燒法在LecoFP-528上測定這種酵母混合物中氮的量。通過稱重(在105°C干燥之后)測量酵母混合物中的干固體。將酵母混合物加熱至55。C,在天然pH(約5-5.3)施用或用4NNaOH調(diào)節(jié)至pH5.8。使用0.25%(重量/酵母干物質(zhì)的重量)的磷脂酶(LecitaseUltra,10kLU/gNovozymesA/S,Denmark)和/或0.3%(重量/酵母干物質(zhì)的重量)的蛋白水解酶(Papain(木瓜蛋白酶)，PangBoBiologicalCo.Ltd)來處理樣品。在55。C預熱10分鐘后向酵母混合物添加酶。對照樣品(空白)不用酶處理。自溶在磁力攪拌下在55。C進行22小時。取出30ml樣品并且稱重精確的量。將樣品在85°C失活10分鐘。在失活之后，使用來自Heraeus的Multifoge3S-R將樣品在3500rpm離心10分鐘。如實施例1所述分析4是取物。使用來自HACH的Turbidimeter2100AN(濁度計2100AN)測定濁度?；趦纱螠y定的結(jié)果示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于從酵母提取一種或多種成分的方法，該方法包括i)用磷脂酶處理酵母細胞；和ii)從處理的酵母細胞分離期望的一種或多種成分。2.權(quán)利要求l的方法，其中在步驟i)的之前、之后或過程中將酵母細胞進行蛋白質(zhì)水解。3.權(quán)利要求2的方法，其中通過蛋白水解酶來水解蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求3的方法，其中通過自溶來水解蛋白質(zhì)。5.權(quán)利要求3的方法，其中使用一種或多種純化的蛋白水解酶。6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟i)中使用磷脂酶Aj。7.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟i)中使用磷脂酶A2。8.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中要提取的一種或多種成分包含蛋白質(zhì)。9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中要提取的一種或多種成分包含酶。10.—種用于產(chǎn)生酵母提取物的方法，該方法包括i)用純化的磷脂酶處理酵母細胞；和ii)對處理的酵母細胞進行蛋白質(zhì)水解；和iii)去除酵母細胞成分；其中步驟ii)在步驟i)的之前、之后或過程中進行。11.純化的磷脂酶用于從酵母細胞培養(yǎng)物中提取一種或多種成分的用途。全文摘要本發(fā)明涉及使用純化的磷脂酶從酵母細胞提取成分的方法。文檔編號C12N1/06GK101432423SQ200780015556公開日2009年5月13日申請日期2007年5月3日優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日發(fā)明者利斯貝思·卡勒姆,斯蒂芬·厄恩斯特,珀·M·尼爾森申請人:諾維信公司