專利名稱：一種發(fā)酵法利用帶魚脊骨制備降血壓肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域，尤其涉及一種以發(fā)酵法利用帶魚脊骨制備 降血壓肽的方法。
背景技術：
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)在血壓調(diào)節(jié)過程中扮演重要的角色。其可 使無活性的血管緊張素十肽前體轉(zhuǎn)化為血管緊張素，從而使血壓升高。血 管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性肽是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI) 中的一種，通過抑制ACE的活性而達到降低血壓的作用。目前已經(jīng)有多種 化學合成肽類藥物作為ACE的抑制劑。這類合成降血壓藥物的缺點是作用 時間不長，血壓容易反彈，并且藥物經(jīng)腎臟排出容易造成腎功能的損傷。
從天然蛋白質(zhì)中提取具有營養(yǎng)性和生理活性的功能肽，并將這些功能 肽應用到保健食品和強化營養(yǎng)食品當中不但能夠全面利用食品及食品加 工中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，而且能夠有效的提高來源廣泛的蛋白質(zhì)原料的附加值， 同時大大提升傳統(tǒng)食品的科技含量。
食品蛋白質(zhì)經(jīng)酶解產(chǎn)生的降血壓肽具有食用安全性高、無副作用，特 別是其對高血壓患者具有降壓作用，但對血壓正常人無降壓作用的優(yōu)點， 近年來受到廣泛關注。目前人們已經(jīng)成功地從磷蝦、金槍魚、沙丁魚、鰹 魚、玉米、大豆、酒糟、蠶蛹、酪蛋白中獲得了 ACE抑制肽。但上述研究 分離方法成本高，規(guī)?；a(chǎn)的成本也較高，并且原料多為人們的生活食 物。九十年代后期，國內(nèi)外關于蛋白酶解肽的研究主要圍繞在蛋白質(zhì)的水 解度、分子量大小、游離氨基酸含量、生物酶重復利用以及對苦味的控制 和去除等。
發(fā)酵法與酶法相比，不需要外加酶制劑，因此更為經(jīng)濟，適于工業(yè)化 生產(chǎn)。其直接利用微生物發(fā)酵，分解底物蛋白產(chǎn)生活性肽類物質(zhì)。目前國 內(nèi)關于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)降血壓肽的研究涉及乳蛋白、大豆、玉米、蛋類、 家蠶等，尚屬起步階段。
帶魚(7^'c力ii/r^j:3/ o/^'c^)屬鱸形目、帶魚科、帶魚屬，俗名刀魚、 裙帶魚、牙帶、白帶魚等，帶魚脊骨是帶魚加工后的主要下腳料，俗稱帶 魚魚排。目前其主要用于詞料工業(yè)，對于利用帶魚脊骨的利用及深度加工 尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種以帶魚脊骨為原料制備對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) 具有抑制作用的降血壓肽的方法。
一種發(fā)酵法利用帶魚脊骨制備降血壓肽的方法，包括如下步驟
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
按如下配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其中每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含-
蔗糖 30-50g;
粉碎后的帶魚脊骨 120-180g;
蛋白胨 4-6g;
K2HP04 0. 9-1. lg;
MgS04 7H20 0.09—0. llg; 余量為水；
發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接種地衣芽孢桿菌，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)得 到發(fā)酵液；接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為置于旋轉(zhuǎn)搖床上37°C， 200rpm，培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7. 0-7. 5， 一般用稀鹽酸或稀氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)；滅菌條件為12rC滅菌30min;
作為優(yōu)選，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含 蔗糖 40g;
粉碎后的帶魚脊骨 150g; 蛋白胨 5g; K2HP04 lg;
MgS04 7H20 0. lg;
余量為水。
(2) 降血壓肽的制備
取步驟(1)得到的發(fā)酵液3000rpm離心30min后取上清液，將上清 液過濾，濾液置于10(TC水浴快速升溫至9(TC左右，保持IO-15min滅酶；
(3) 滅酶后濾液迅速冷卻至室溫，3000rpm離心15min，取離心上清 液加入25% (重量比)的活性碳，過濾得到脫色除味后的濾液；
(4) 取步驟(3)得到的脫色除味厚的濾液進行超濾，得到透過液， 透過液真空濃縮后冷凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉。
超濾的條件為膜截留分子量為30kDa，工作壓力0. 1-0. 2MPa，工作 溫度20-45 。C。
本發(fā)明方法的優(yōu)點是
1. 本發(fā)明所制備的降血壓肽是帶魚脊骨經(jīng)微生物發(fā)酵而得，具有抑制
ACE活性的作用，對高血壓患者具有降壓作用，安全、無毒副作用，對血壓 正常者可起到保健作用，對正常血壓無影響。
2. 本發(fā)明所采用的原料來源豐富，價格低廉，經(jīng)過本發(fā)明的技術轉(zhuǎn)化 可以有效的提高帶魚脊骨這種水產(chǎn)加工下腳料的經(jīng)濟附加值，對繼續(xù)促進 水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展有重要的意義。
3. 本發(fā)明的產(chǎn)品可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑、藥物 增效劑等，工藝科學合理，操作簡單，具有較強的工業(yè)化實施性。
具體實施方式
實施例l
地衣芽孢桿菌在接種前的培養(yǎng)條件為
培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏，4.0;蛋白胨，6.0;酵母膏，2.0; NaCl， 5.0; pH， 7.5。 121。C滅菌30min。
培養(yǎng)條件250mL三角瓶裝25mL種子培養(yǎng)基，接地衣芽孢桿菌(預先 在斜面上培養(yǎng)基保存的菌絲體)，置于旋轉(zhuǎn)搖床上37°C， 200rpm，培養(yǎng) 16-18h,得到接種液，此時接種液中菌體生物量(干重)為0.4-0.5g/L。
降血壓肽的制備
于250mL三角瓶中稱取勻漿后的帶魚脊骨(水分76. 22%,蛋白質(zhì)含量 12. 17%，浙江省寧波超星海洋生物制品有限公司提供)4. 5g，蔗糖1. 2g， 蛋白胨O. 15g， K2HP04， 0.03g， MgS04*7H20， 0. (X)3g，加水25mL，調(diào)節(jié)pH 為7. 5。 121。C滅菌30min。
按體積比加入3%的接種液(接種量一般在3-5%，過高過低均會影響 轉(zhuǎn)化效果)，于搖床上37。C， 200rpm，培養(yǎng)24h后，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵 液在J-6M型大容量冷凍離心機(BECKMAN公司)3000r/min的4""C條件下離 心30分鐘,上清液過濾，得濾液4kg。濾液置于IO(TC水浴快速升溫至90 'C左右，保持10-15min,滅酶。然后迅速冷卻至室溫，3000rpm離心15min， 上清液按25%加入活性碳脫色除味，過濾。濾液利用中空纖維聚砜超濾膜 (截留分子量10KDa)進行超濾，工作壓力0.2MPa,工作溫度25。C,得到 透過液3.37kg。利用真空濃縮機將透過液濃縮至0.5kg，進行冷凍千燥， 得到具有降血壓功能的肽粉0. 045kg，肽含量為92. 43%,產(chǎn)品得率為6%(初 始帶魚骨為750g)，色澤乳白色細膩，利用體外檢測ACE抑制活性的 CUSHMAN法，測得其ICs。為0. 516mg/ml。
實施例2降血壓肽的制備
于5L發(fā)酵罐中稱取勻漿后的帶魚脊骨(水分76.22%,蛋白質(zhì)含量 12. 17%，浙江省寧波超星海洋生物制品有限公司提供)600g，蔗糖160g， 蛋白胨20g， K2HP04， 4g， MgS04 *7H20， 0. 4g，加水3400mL，調(diào)節(jié)pH為7. 5。 121"C滅菌30min。 按體積比加入3%的接種液，37°C，攪拌培養(yǎng)24h后，得到發(fā)酵液，發(fā) 酵液在J-6M型大容量冷凍離心機(BECKMAN公司)3000r/min的4"C條件下 離心30分鐘，上清液過濾，得濾液3. 6kg。濾液置于IOO'C水浴快速升溫 至90。C左右，保持IO-15min，滅酶。然后迅速冷卻至室溫，3000卬m離心 15min，上清液按25%加入活性碳脫色除味，過濾。濾液利用中空纖維聚砜 超濾膜(截留分子量lOKDa)進行超濾，工作壓力0. 2MPa，工作溫度30°C， 得到透過液3. 02kg。利用真空濃縮機將透過液濃縮至0. 4kg，進行冷凍干 燥，得到具有降血壓功能的肽粉0.029kg，肽含量為90.88%，產(chǎn)品得率為 4. 83%，色澤乳白色細膩，利用體外檢測ACE抑制活性的CUSHMAN法，測得其 IC5。為0. 639mg/ml。
實施例3降血壓肽的制備
于5L發(fā)酵罐中稱取勻漿后的帶魚脊骨(水分76.22%,蛋白質(zhì)含量 12. 17%,浙江省寧波超星海洋生物制品有限公司提供)300g，葡萄糖160g， K2HP04， 4g， MgS04'7H20， 0. 4g，加水3600mL，調(diào)節(jié)pH為7. 5。 121。C滅 菌30minQ
按體積比加入3%的接種液，37°C，攪拌培養(yǎng)24h后，得到發(fā)酵液，發(fā) 酵液在J-6M型大容量冷凍離心機(BECKMAN公司)3000r/min的4r條件下 離心30分鐘，上清液過濾，得濾液3.35kg。濾液置于100。C水浴快速升溫 至90。C左右，保持IO-15min，滅酶。然后迅速冷卻至室溫，3000rpm離心 15min，上清液按25%加入活性碳脫色除味，過濾。濾液利用中空纖維聚砜 超濾膜(截留分子量lOKDa)進行超濾，工作壓力0. 2MPa，工作溫度40°C， 得到透過液3.07kg。利用真空濃縮機將透過液濃縮至0.4kg，進行冷凍干 燥，得到具有降血壓功能的肽粉0.013kg，肽含量為88.45%，產(chǎn)品得率為 4. 33%,色澤乳白色細膩，利用體外檢測ACE抑制活性的CUSHMAN法,測得其 ICs。為0. 834mg/ml。
權(quán)利要求
1、一種發(fā)酵法利用帶魚脊骨制備降血壓肽的方法，包括如下步驟(1)按如下配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其中每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含蔗糖 30-50g；粉碎后的帶魚脊骨 120-180g；蛋白胨 4-6g；K2HPO4 0.9-1.1g；MgSO4·7H2O0.09-0.11g；余量為水；發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接種地衣芽孢桿菌，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)得到發(fā)酵液；(2)將步驟(1)得到的發(fā)酵液離心后取上清液，將上清液過濾，濾液滅酶；(3)滅酶后的濾液離心，離心上清液用活性碳脫色除味，得到脫色除味后的濾液；(4)將脫色除味后的濾液進行超濾，得到透過液，透過液真空濃縮后冷凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基 的PH值為7.0-7.5。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含蔗糖 40g;粉碎后的帶魚脊骨 150g;蛋白胨 5g;K風 lg;MgS04 7H20 0. lg; 余量為水。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中接種后的發(fā) 酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為37°C,培養(yǎng)24h。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中濾液滅酶的 條件為將濾液升溫至9(TC，保持10-15min。
6、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中超濾的條件 為膜截留分子量為30kDa，工作壓力0.1-0. 2MPa。
全文摘要
本發(fā)明提供一種發(fā)酵法利用帶魚脊骨制備降血壓肽的方法，包括如下步驟(1)將蔗糖、粉碎后的帶魚脊骨、蛋白胨、K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O及水配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種地衣芽孢桿菌，經(jīng)培養(yǎng)得到發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液離心后取上清液，將上清液過濾，濾液滅酶；(3)滅酶后的濾液離心，離心上清液用活性碳脫色除味，得到脫色除味后的濾液；(4)將脫色除味后的濾液進行超濾，得到透過液，透過液真空濃縮后冷凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉。本發(fā)明方法采用的原料來源豐富，價格低廉，操作簡單，具有較強的工業(yè)化實施性。
文檔編號C12P21/00GK101168762SQ20071015636
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日
發(fā)明者何國慶, 王金玲, 章海峰, 董曉美, 暉 阮, 陳啟和 申請人:浙江大學