專利名稱：：選擇具有抗生物膜感染功效的試劑的板的制作方法選擇具有抗生物膜感染功效的試劑的板本申請要求于2005年7月22日提交的美國臨時申請?zhí)?0/701,858的優(yōu)先權(quán)。I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分析生物膜的方法和裝置，并且涉及確定抗微生物或抗生物膜試劑，優(yōu)選抗生物膜試劑的組合諸如抗生素或殺生物劑的微生物敏感性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，方法和裝置包括選擇適當(dāng)?shù)膯蝹€具有增強(qiáng)的治療生物膜疾病的功效的抗生物膜試劑及其組合，生物膜疾病包括但不限于銅綠假單胞菌(/^e^fowowwaen/g&asa)，特別是在囊性纖維化(CF)患者中的肺部感染。本發(fā)明提供選擇具有增強(qiáng)的治療生物膜疾病的功效的適當(dāng)?shù)目股锬ぴ噭┑姆椒ê脱b置。II.發(fā)明背景微生物的表征傳統(tǒng)上應(yīng)用分批培養(yǎng)研究的方法，其中微生物以分散或浮游狀態(tài)存在。在過去的25年里，已經(jīng)認(rèn)識到在許多環(huán)境中細(xì)菌生物量的主要成分是固著細(xì)菌。近來在微生物生態(tài)學(xué)中的技術(shù)進(jìn)步己經(jīng)允許如同它們在自然和疾病中存在那樣對微生物進(jìn)行仔細(xì)的研究。這些研究表明，大多微生物能夠在生物膜上生長，并且微生物在生物膜上的生長在物理和生理上不同于相同的微生物在分批培養(yǎng)中的生長。這些不同構(gòu)成這些微生物的發(fā)病機(jī)理和它們對抗微生物試劑的敏感性的觀察到的改變。抗生素抗性一般歸因于保護(hù)性外泌多糖基質(zhì)的產(chǎn)生和微生物生理的改變。革蘭氏-陰性桿菌銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是在廣泛種類的工業(yè)、商業(yè)和處理操作中發(fā)現(xiàn)的許多微生物中的一種，所述工業(yè)、商業(yè)和處理操作如污水排放、再循環(huán)水系統(tǒng)(冷卻塔、空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)等)、冷凝水收集、紙漿操作、以及，一般地，任何蓄水、處理、加工、收集等系統(tǒng)。正是由于生物膜在水處理系統(tǒng)中普遍存在，所以并不奇怪還發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌與這些生物膜締合。在許多情形中，銅綠假單胞菌是主要的微生物成分。除了它在工業(yè)處理中的重要性，銅綠假單胞菌和與其締合的生物膜結(jié)構(gòu)具有影響深遠(yuǎn)的醫(yī)學(xué)意義，并且是許多病理條件的基礎(chǔ)。銅綠假單胞菌是一種與廣泛種類的感染相關(guān)的機(jī)會致病菌，例如，緩慢定居在患有囊性纖維化患者的肺部。作為生物膜生長的銅綠假單胞菌高度抗抗生素并且抗吞噬細(xì)胞。本發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了具有鑒定有效消除并且控制生物膜的抗生物膜試劑和抗生物膜試劑組合的特殊目的的檢測。對于銅綠假單胞菌生物膜已經(jīng)研發(fā)了特殊的裝置和方法。這樣的產(chǎn)品應(yīng)該提高用于患有囊性纖維化肺部感染和其它假單胞菌感染的患者的抗微生物藥物治療的選擇。在這些表面上存在的生物包括許多致病的和不致病的細(xì)菌和真菌。葡萄球菌(Staphylococcusspp.)感染通常與由不銹鋼、硅氧烷、聚氨基甲酸酯組成的移植的醫(yī)學(xué)裝置相關(guān)。移植的醫(yī)學(xué)裝置首先用糖蛋白如纖連蛋白涂敷，所述糖蛋白允許葡萄球菌生物粘附到表面并且最終形成微生物生物膜。充分認(rèn)識到，當(dāng)與醫(yī)學(xué)裝置締合時，葡萄球菌(St叩h)對抗生素治療沒有反應(yīng)。對固著細(xì)菌的抗微生物活性的評估應(yīng)該更好地預(yù)測關(guān)于葡萄球菌感染的臨床功效?，F(xiàn)在，認(rèn)為致病真菌如念珠菌屬(C"m/Wa)和煙曲霉(Jwwg///Mls/M/m'gWM)是重要的感染，并且負(fù)責(zé)顯著的發(fā)病率和死亡率。通常它們與移植的裝置相關(guān)，或者在免疫損害的患者中。只是在最近才認(rèn)識到治療失敗與生物膜的形成相關(guān)。盡管已經(jīng)描述了針對抗真菌劑的抗性基因，但是基于生物膜形式的生長的生理抗性可能等價于治療失敗或者比治療失敗更重要?，F(xiàn)在廣為人知，以生物膜形式的細(xì)菌比浮游細(xì)菌更加抵抗抗細(xì)菌劑。然而，檢測細(xì)菌的存在和檢測抗生素抗細(xì)菌的功效通常包括檢測浮游細(xì)菌。當(dāng)與在浮游(自由浮動)狀態(tài)的相同細(xì)菌比較時，研究已經(jīng)表明生物膜大于幾百倍的抗生素抗性。由于作為生長的生物膜形式的一部分的許多表型適應(yīng)性，這種抗性是多因素的，包括但不限于發(fā)展的粘多糖包被，和在微生物中的生理改變。選擇用于治療生物膜感染的抗生素和抗生素組合繼續(xù)依賴于最小抑制濃度(MIC)測定，而不管這些檢測的公認(rèn)的缺乏功效性。一些人提議應(yīng)用生物膜抑制濃度(BIC)(Moskowitz，等；J.Clin.Microbiology(臨床微生物學(xué)雜志)，42:1915-1922(2004年5月))，但是證據(jù)表明BIC和MIC二者都針對浮游細(xì)菌，而不是固著細(xì)菌。例如，Moskowitz等在他們的方法中應(yīng)用離心，并沒有去除大部分來源于激活的生物膜的細(xì)胞，因此導(dǎo)致只針對浮游細(xì)菌的測定，或者只是部分生物膜的測定。因此這一測定可能忽略了遺留在栓(peg)上的存活細(xì)胞，因而導(dǎo)致潛在的錯誤推論。此外，現(xiàn)有技術(shù)典型地將生物膜生長在靜態(tài)(不流動)環(huán)境中，其有時影響結(jié)果。相反，本發(fā)明在其處理過程中在獨(dú)立的恢復(fù)板上應(yīng)用超聲或再生生物膜，以致可以獲得并檢測完整無缺的生物膜。此外，本發(fā)明的方法包括在動態(tài)或流動條件下生長生物膜，并且中和抗微生物劑，二者都單獨(dú)地和共同地加強(qiáng)任何測定結(jié)果。因此，存在對于改進(jìn)的處理和測定裝置和方法的需求，所述處理和測定裝置和方法用于選擇有效的抗生物膜組合物，包括有效抗人和動物生物膜介導(dǎo)的疾病的抗生物膜組合物，所述疾病包括但不限于CF肺部感染。III.發(fā)明概述本發(fā)明包括用于選擇單獨(dú)的或組合的，有效抗生物膜的一種或多種活性劑的改進(jìn)的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述裝置和方法可以用于生物膜感染的治療。所述生物膜可以是任何生物膜，例如，由細(xì)菌、真菌、或藻類、病毒、和寄生蟲形成的那些；或者結(jié)合在它所形成的生物膜內(nèi)的微生物；或者混合的生物膜，例如，含有多于一種細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或藻類生物膜。本發(fā)明的裝置和方法還包括研發(fā)治療方法。在優(yōu)選的實施方案中，所述治療方法可以適合具體的患者和/或可以形成研發(fā)個性化的醫(yī)學(xué)治療或方法的基礎(chǔ)。本發(fā)明的裝置和方法還有效地治療廣泛種類的微生物，包括但不限于銅綠假單胞菌，葡萄球菌，念珠菌屬物種(Candidassp.)，和煙曲霉。本發(fā)明的裝置和方法還有效地治療由一種或多種生物膜介導(dǎo)的廣泛種類的疾病和病況，所述疾病包括但不限于囊性纖維化(CF)，包括由一種或多種細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、藻類或它們的組合引起或介導(dǎo)的疾病和病況。本發(fā)明還提供適合生長特別的一種或多種生物膜、并且適合確定有效抗所述生物膜的適當(dāng)?shù)囊环N或多種活性劑的臨床上重要的測定。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，所述測定提供最小生物膜根除濃度(MBEC)，最小抑制濃度(MIC)，或最小殺生物濃度(MBC)，或它們的組合。本發(fā)明提供一組單個的和/或組合的活性劑，用于選擇包含一種或多種具有抗生物膜功效的活性劑的組合物。這些試劑或試劑的組合可以用于治療患者-特異性感染的生物體。本發(fā)明提供用于選擇生物膜相關(guān)的感染疾病的組合抗生素治療的方法和裝置。本發(fā)明的裝置和方法還可以用于確定并且開發(fā)對個體患者特異性的藥物組合物。本發(fā)明的裝置和方法還為有助于公知的抗生素抗性的現(xiàn)有治療方法提供備選方案。本發(fā)明的裝置和方法還可以用于鑒定在開發(fā)適合特別患者的適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǖ倪^程中的遺傳漂移、抗生素抗性、和遺傳變異。本發(fā)明還提供適合生物膜存在的體外測定，即，基于確定最小生物膜根除濃度(MBEC)的測定。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述裝置和方法提供MBEC、最小抑制濃度(MIC)、和最小殺生物濃度(MBC)值的任何組合。本發(fā)明的裝置和方法與現(xiàn)有技術(shù)裝置相比，在下述一項或多項改進(jìn)所述裝置和方法包括檢測完整的生物膜；應(yīng)用超聲去除完整的生物膜；所述裝置和方法適用于更寬范圍的生物膜，例如，真菌的等等；抗生物膜試劑涵蓋更寬范圍的試劑，包括殺生物劑等等；所述裝置和方法是高流通量的，并且因此更加有效和節(jié)約成本；并且生長生物膜得到改進(jìn)，包括增加的了解和應(yīng)用方法條件，以增強(qiáng)生物膜生長。微生物生物膜存在于許多醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)系統(tǒng)，方法，處理設(shè)備中，和表面上。在這些表面存在的生物體包括許多致病的和不致病的生物膜。本發(fā)明的方法和裝置可以用于降解生物膜，無論它們在哪里存在，例如，在淤積發(fā)生的工業(yè)過程中，例如，除垢漿(de-foulingpulp)和造紙廠設(shè)備，處理氣/油管線，和凈化食品加工設(shè)備，或者移植的醫(yī)學(xué)裝置，其包括導(dǎo)管、髖部移植物和套管。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本文列出的原理還適用于它們所發(fā)生的所有環(huán)境中的所有生物膜。本發(fā)明還包括完整裝置或組件、多樣的或多個組件、多樣的或多個亞組件、或它們的組合的應(yīng)用。本發(fā)明的這些和其它方面將在下述附圖、描述和權(quán)利要求中更加清楚。III.附圖簡述圖1是在容器蓋子上的多個生物膜附著位點的底視圖。圖2是圖1接受多個生物膜附著位點的容器的頂面圖。圖3是圖l和2的蓋子和容器的側(cè)面圖，部分?jǐn)嗔选D4是本發(fā)明的一個代表性實施方案的方法步驟的流程圖。圖5顯示本發(fā)明的生物膜生長和形成過程的實例。圖6顯示本發(fā)明的生物膜敏感性測定的實例。圖7顯示按照本發(fā)明恢復(fù)完整的生物膜的方法實例。圖8顯示按照本發(fā)明確定MBEC和MIC測定的方法實例。圖9是在實施例6中描述的實驗結(jié)果的圖表。圖10顯示在實施例7中所用的攻擊板(challengeplate)的設(shè)置。圖11顯示在實施例10中所用的攻擊板的設(shè)置。圖12是確定生物膜的MIC、MFC和MBEC值的圖表。IV.發(fā)明詳述本發(fā)明包括用于選擇單獨(dú)的或組合的有效抗生物膜的一種或多種活性劑的改進(jìn)的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述裝置和方法可以用于治療生物膜感染。在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，所述裝置和方法可以用作診斷工具，以確定用于治療一種或多種生物膜和/或一種或多種由所述生物膜介導(dǎo)的疾病或病況的各種組合物，包括優(yōu)化組合物。本發(fā)明包括用于選擇治療生物膜的適當(dāng)?shù)目股锬ぴ噭┙M合的改進(jìn)的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法和裝置提供診斷敏感性測試，并且在最優(yōu)選的實施方案中，在單一實驗中提供MBEC、MBC、和MIC值。本發(fā)明一個實施方案可以包括用于選擇針對特異的生物膜或生物膜群體的活性劑組合的方法和裝置。本發(fā)明的方法和裝置可以用于降解生物膜，無論它們在哪里發(fā)生，例如，在淤積發(fā)生的工業(yè)過程中；移植的醫(yī)學(xué)裝置，其包括導(dǎo)管、髖部移植物和套管；或者用于廣泛種類的感染，如眼部應(yīng)用(感染、移植、隱形眼鏡、手術(shù)操作等等)，呼吸道感染，包括肺炎和囊性纖維化，耳部感染，復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)相關(guān)的感染，尿道感染，皮膚和軟組織感染，在燒傷受害者中發(fā)生的感染，心內(nèi)膜炎，陰道感染和胃腸道感染。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本文列出的原理還適用于它們所發(fā)生的所有環(huán)境中的所有生物膜。本發(fā)明還包括用于治療患有由生物膜介導(dǎo)或引起的疾病或病況的患者或受試者的方法和裝置。在本發(fā)明的這些實施方案中，將來自患者或受試者的生物樣品用生物膜形成裝置處理；然后將生物膜用生物膜敏感裝置處理，以提供一種或多種針對所述生物膜具有活性的試劑。本發(fā)明的一個實施方案包括一種組件，其包括一個或多個預(yù)先負(fù)載一種或多種預(yù)先選擇的針對特異的一種或多種生物膜的抗生物膜試劑的板，所述板可以用于鑒定治療生物膜-介導(dǎo)的疾病或病況的有效的單個或組合的活性劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還可以包括一個或多個下述各項在促進(jìn)基本上均一的生物膜生產(chǎn)的條件下生長多樣的或多種生物膜；針對一大組活性劑篩選生物樣品；選擇一小組活性劑；用多樣的或多種在小組中的活性劑上樣負(fù)載檢測裝置；生長來自具體的患者或受試者樣品的生物膜；針對活性劑小組，篩選來自具體的患者或受試者的生物膜；讀取結(jié)果；確定適于特別的生物膜的適當(dāng)?shù)幕钚詣┗蚧钚詣┑慕M合；如果當(dāng)生長時微生物產(chǎn)生明顯可見的混濁(如假單胞菌)，進(jìn)行濁度檢測；并且如果微生物不以明顯的濁度生長，進(jìn)行板接種檢測。本發(fā)明的一個實施方案包括用于選擇具有抗作為生物膜的具體的病原體的分離物的功效的抗生素的特別組合的方法，其通過針對單獨(dú)的或組合的廣泛范圍的抗生素而篩選某一物種的寬范圍的臨床分離物，以鑒定具有抗生物膜生長的生物的功效的組合。本發(fā)明的一個實施方案包括形成其中生長生物膜的患者分離物的生物膜，使用如美國專利號6051423,63261卯，6410256，6596505，6599696和6599714中的一個或多個中所述的生物膜檢測裝置，用于檢測生物膜抗生素敏感性。本發(fā)明的一個實施方案包括確定用于治療生物膜感染的抗生素選擇，其通過針對對形成生物膜的物種特異的診斷板攻擊患者的特異性分離物的生物膜而進(jìn)行。本發(fā)明的一個實施方案包括將預(yù)先負(fù)載抗生素的物種特異性板再水合作為攻擊板，以鑒定具有抗特異性病原體功效的抗生素。板可以是冷凍的(不需要再水合)，或者凍干的，冷凍干燥或真空干燥的。本發(fā)明的一個實施方案包括一種孔板(wdlplate)，其包含冷凍的或凍干的抗生素組合，其可以再水合用于抗生素敏感性檢測。本發(fā)明的一個實施方案包括生長從分離的患者病原體獲得的生物膜，并且將所述生物膜用于敏感性檢測。本發(fā)明的實施方案包括針對所選擇的抗微生物或抗生物膜試劑的組合而攻擊生物膜，由此選擇最適宜的組合。本發(fā)明的一個實施方案包括在能夠形成生物膜的任何微生物的診斷和治療中提供MBEC值，并且應(yīng)用這些值治療或者開發(fā)用于任何微生物-介導(dǎo)的疾病、感染、或病況的治療方法。本發(fā)明還可以包括提供MIC和/或MBC值。在本發(fā)明的另一個方面中，在將生物膜生長在蓋子或板上的粘附位點上后，將所述生物膜從生物膜粘附位點移下，并且迸一步培養(yǎng)所述生物膜。從生物膜粘附位點移下生物膜可以包括將來自每一個生物膜粘附位點的生物膜移動到微量滴定板或基底的獨(dú)立的孔中。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述生物膜使用導(dǎo)致完整的生物膜從粘附位點移出的任何方法進(jìn)行移動。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用離心只移除一部分微生物，因此任何檢測可能是不完全或不準(zhǔn)確的。優(yōu)選地，多個生物膜粘附位點以多排形成，在每一排有多個位點；并且容器包括多個通道，每一通道用于每一排多個生物膜粘附位點。這樣配置的裝置或組件允許高通量的生物膜分析。在整體上，本發(fā)明包括生物膜生長組件1，生物膜攻擊組件2，漂洗組件3，和生物膜移動和再生組件4。共同使用，所述組件在單一實驗中提供MIC、MBC禾BMBEC值。按照本發(fā)明，生物膜生長組件1可以包括配置成接受蓋子10的基底或板20。蓋子IO可以配置成包括一個或多個凸起12，所述凸起12延伸到由基底20限定的空間。在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，生物膜生長組件1是搖動的、移動的等等，以致在所述組件中的生長流體穿過凸起12流動或移動。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，基底20是培養(yǎng)基底，并且被設(shè)置成為每個凸起提供基本上相等的暴露于微生物源和其營養(yǎng)/生長肉湯。如在本說明書其它地方所述，典型的基底包括多個通道26中的一個。一種代表性的構(gòu)型在圖3中所示。按照本發(fā)明，生物膜攻擊組件2包括配置成接受蓋子60的第二基底或板21，所述蓋子60具有典型地被生物膜覆蓋的凸起61。凸起61延伸到在板21上設(shè)置的一個或多個孔中。一種典型的第二基底21是標(biāo)準(zhǔn)的96孔微量滴定板，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該易于認(rèn)識到可以使用其它構(gòu)型。第二基底21在孔中含有一種或多種抗生物膜試劑。按照本發(fā)明，第二板21可以移開，并且用于確定非生物膜(如浮游)微生物的MIC值(參見圖8)。按照本發(fā)明，生物膜漂洗組件3包括設(shè)置成接受蓋子60的第三基底或板40，所述蓋子60具有典型地被生物膜覆蓋的凸起61。凸起61延伸到在板40上設(shè)置的一個或多個孔中。一種典型的第三板40是標(biāo)準(zhǔn)的96孔微量滴定板，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該易于認(rèn)識到可以使用其它構(gòu)型。第三板40在孔中含有一種或多種漂洗和/或中和試劑。漂洗后，然后蓋子60可以與第四基底50結(jié)合，第四基底50還叫作恢復(fù)板。蓋子60和第四基底50形成生物膜中斷組件4。所述恢復(fù)板含有恢復(fù)培養(yǎng)基，并且按照本發(fā)明，組件4可以進(jìn)行超聲處理并且再生生物膜(證實生物膜沒有被去除)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，恢復(fù)培養(yǎng)基包括一種或多種中和試劑。如在實施例中所示，在已經(jīng)暴露于恢復(fù)培養(yǎng)基后檢測蓋子60上的凸起提供微生物的MBEC值，并且從恢復(fù)板鋪板接種提供MBC值。下面描述本發(fā)明的一個代表性實施方案。如最特別在圖1、2和3中所示，本發(fā)明的一種代表性生物膜生長組件包括具有凸起12的蓋子10，和基底20，所述基底20適于接受蓋子10和凸起12，并且包括至少一個通道24或孔。如在附圖中所示，所述裝置包括由組織級別的塑料或其它適宜的材料(例如，不銹鋼、鈦)組成的生物膜蓋子10，其具有從蓋子10向下延伸的凸起12。凸起12可以是生物膜可以與之粘附的生物膜粘附位點，并且可以設(shè)置成適合與含有通道或含有孔的底部如基底20結(jié)合使用的任何模式或形狀。凸起12的模式優(yōu)選地反映常規(guī)板如通常用于檢測步驟的96微量滴定或孔板中的通道和/或孔的模式。在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，凸起12優(yōu)選地在每排至少12個凸起的至少8個排14中形成?？梢允褂闷渌呐艛?shù)或者每排的凸起數(shù)，但是由于它符合通常在生物醫(yī)學(xué)裝置中所用的96孔板，所以這是方便的數(shù)目。所示的其它的或一些凸起可以用來在培養(yǎng)后確定初始生物膜濃度。所示的代表性凸起12約1.5cm長和2mm寬，但是可以是任何大小和/或形狀。生物膜生長組件1還包括設(shè)置成并且適于接受具有凸起12的蓋子10的培養(yǎng)基底20。蓋子10形成凸起12的支持物，用于支持在通道24內(nèi)的生物膜粘附位點。蓋子10具有周圍的蓋子16，其緊密蓋在容器20的周圍壁28上，以避免在溫育過程中污染容器內(nèi)部?；?0為生物膜形成提供兩種重要的作用。第一種是含有細(xì)菌群體的液體生長培養(yǎng)基的儲蓄池，所述細(xì)菌群體將在凸起12上形成生物膜。第二種作用是具有適于產(chǎn)生穿過凸起的剪切力的構(gòu)型。盡管不意欲受限于任何具體的操作理論，本發(fā)明人相信由穿過凸起的流體形成的剪切力在所述凸起上促迸最理想的生物膜生產(chǎn)和形成。在凸起12上的剪切力可以通過在傾斜工作臺30上搖動具有蓋子10的容器20而產(chǎn)生。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用在約7°-約11。之間斜度的搖動工作臺適于大部分應(yīng)用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，搖動工作臺應(yīng)該設(shè)定在約9°。應(yīng)該理解，本發(fā)明不應(yīng)該限制在使用目前的傾斜角度，但是用于任何具體的機(jī)器的任何斜度應(yīng)該適于生長按照本發(fā)明所述的生物膜。凸起12可以懸浮在通道24中，以致凸起12的頂端可以浸沒在通道24中流動的液體生長培養(yǎng)基中。隆起26沿著通道24引導(dǎo)液體生長培養(yǎng)基經(jīng)過并且穿過凸起12，并且因此產(chǎn)生穿過凸起的剪切力。搖動容器IO引起流動方向的重復(fù)改變，在這種情形中，液體生長培養(yǎng)基穿過凸起10流動的重復(fù)逆轉(zhuǎn)，其幫助保證生物膜等比例分布在蓋子10的每一個凸起12上。搖動容器以致液體沿著通道前后流動不但提供極好的生物膜生長環(huán)境，而且模擬天然存在的條件。每個凸起12和每個通道24優(yōu)選地具有基本上相同的形狀(在制造公差(manufacturingtolerance)內(nèi))，以保證在生物膜形成過程中穿過凸起的剪切流的均一性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通道24應(yīng)該都被設(shè)置或者連接，以致它們共有充滿皿22的相同的液體營養(yǎng)物和細(xì)菌混合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基本上均一的通道構(gòu)型和通向相同微生物來源的途徑促進(jìn)在每個凸起上產(chǎn)生相等的生物膜，至少等于檢測抗生物膜試劑所需要的程度。認(rèn)為這樣產(chǎn)生的生物膜是均一的。對于板上的隨機(jī)凸起，已經(jīng)獲得PO.05內(nèi)的結(jié)果。生物膜的敏感性可以通過用一種或多種抗生物膜試劑處理生物膜粘附位點，即，攻擊生物膜，然后檢測生物膜而進(jìn)行檢測。這可以通過將蓋子60(具有在凸起上形成的生物膜)安放在適合接受蓋子10和凸起12的第二基底21上而完成。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，蓋子60以充分防止組件污染的方式與第二基底21嚙合。當(dāng)用于此處時，充分防止污染的方式是指配合結(jié)構(gòu)的構(gòu)型和組件，以致閉合的組件的內(nèi)容物免受外部污染。按照本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用任何安排或方案攻擊一組生物膜。例如，攻擊板的所有孔可以包含相同的抗生物膜試劑；多個或多樣的孔可以包括不同劑量的相同的抗生物膜試劑；在單排上的多個或多樣的孔可以包含相同劑量或不同劑量的抗生物膜試劑；多個或多樣的排可以包含相同劑量或不同劑量的抗生物膜試劑；多個或多樣的孔或者多個或多樣的排可以包含多于一種抗生物膜試劑；或者多個或多樣的孔或者多個或多樣的排可以包含多于一種抗生物膜試劑，每個孔、每一排和/或每種抗生物膜試劑劑量不同。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，孔的構(gòu)型和排列，抗生物膜試劑的類型和數(shù)目，和每個孔的劑量應(yīng)該隨需要而變化，以實現(xiàn)特別的目的，例如，使用如對目的目標(biāo)合理的一樣多的變量，用一種或多種抗生物膜試劑檢測一種或多種生物膜。例如，在容器20的相同通道24中溫育的凸起12可以用不同的抗細(xì)菌試劑處理。以這種方式，由于在任何一個通道里的生長條件沿著整個通道非常相似，并且對于懸浮在所述通道中的每個凸起12也是非常相似的，所以可以獲得一致的結(jié)果。這幫助提高用不同抗細(xì)菌試劑處理不同凸起12的可靠性。這一實例表明不同的排列適合與本發(fā)明的組件一起使用。一些不同的常規(guī)方法可以用于計數(shù)細(xì)菌。它可以通過培養(yǎng)超聲處理的細(xì)菌，采用連續(xù)稀釋并且視覺計數(shù)菌落形成單位而進(jìn)行，或者可以使用自動方法，例如使用光學(xué)讀數(shù)儀確定光密度。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，濁度的光學(xué)讀數(shù)對于實際應(yīng)用過于不準(zhǔn)確，并且優(yōu)選地應(yīng)該應(yīng)用活體染料技術(shù)以將存活能力檢測自動化，其通過用活體染料處理生物膜，并且檢測由染色的生物膜發(fā)出的光的強(qiáng)度而進(jìn)行。在使用活體染料技術(shù)的情形中，生物膜不需要進(jìn)一步培養(yǎng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到，可以使用用于細(xì)胞群體的其它染料；稍后這些染料可以提取出來并且讀數(shù)OD(剩余細(xì)胞生物量的檢測)。在另一個實施方案中，檢測可以這樣進(jìn)行，即，通過超聲處理細(xì)胞直到它們裂解并且釋放ATP，然后加入螢光素酶，以產(chǎn)生機(jī)械可讀的光學(xué)輸出量。在另一個實施方案中，檢測可以使用共焦顯微鏡在凸起上的生物膜上直接進(jìn)行，盡管應(yīng)該考慮到這很難自動化。在下述實例中，結(jié)果在連續(xù)稀釋后從人工計數(shù)獲得。細(xì)菌存活下降到零的抗細(xì)菌試劑的濃度(MBEC)可以從所述檢測容易地估計。同樣地，還可以從所述檢測確定MIC。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在一些情形中，在生物膜中不包含宿主成分的情況下，不形成生物膜。因此，宿主成分可以在細(xì)菌培養(yǎng)過程中加入到容器中的生長培養(yǎng)基中，以形成生物膜。可以加入的宿主成分包括血清蛋白和來自宿主生物體的細(xì)胞。對于檢測不同宿主細(xì)胞和成分的作用，通道24的末端25可以通過壁密封，以防止在一個通道中的生長培養(yǎng)基流到另一個通道中，因此將在每個通道生長的細(xì)菌與其它通道分開。這樣描述的裝置還可以用來檢測用于抑制生物膜生長的涂層，和檢測可以增強(qiáng)生物膜形成的涂層。在初始步驟中，凸起12可以用待檢測的涂層包被，然后將生物膜在所述凸起上生長。然后，可以對生物膜進(jìn)行檢測，或者用抗細(xì)菌試劑處理然后進(jìn)行檢測。所述檢測可以在原位的或者在移開生物膜之后進(jìn)行。不同的涂層可以在不同排的栓上進(jìn)行檢測。增強(qiáng)的生物膜形成可以用來產(chǎn)生用于生物發(fā)酵的大的有活力的生物膜。當(dāng)用于本文時，組件是指設(shè)計或者配置成協(xié)同工作的元件或成分的綜合集合。本發(fā)明的典型的組件包括蓋子及其相對應(yīng)的基底。在本發(fā)明的一些實施方案中，一個組件的元件可以與獨(dú)立的組件一起作用或工作。例如，組件l的蓋子可以用作組件2的蓋子，即，具有不同的基底。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，蓋子可以以可移動的、密封的方式與基底嚙合。在本發(fā)明的其它實施方案中，蓋子可以以閉合的，密封的方式與基底嚙合；在這些實施方案中，可需要適合組件的其它元件，以致它們可以移動，例如，一個或多個可以移動的凸起。當(dāng)用于本文時，攻擊板是指具有一個、多樣的或多個孔構(gòu)型等的任何基底，所述板用于將一種或多種生物膜暴露于一種或多種抗生物膜試劑。典型的攻擊可以用來確定包含一種或多種抗生物膜試劑的環(huán)境中的生物膜生長。在本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中，所述攻擊板可以用來確定任何浮游微生物的MIC值。一種代表性的攻擊板在圖6和8中顯示。當(dāng)用于本文時，恢復(fù)板是指具有一個、多樣的或多個孔構(gòu)型等的任何基底，所述板用來在已經(jīng)暴露于抗生物膜試劑后漂洗生物膜，中和任何抗生物膜試劑，以在所述組件超聲處理后收集任何分解的生物膜，或者它們的組合。在本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中，所述恢復(fù)板可以用來確定在本方法中形成的任何生物膜的MBEC值。一種代表性的恢復(fù)板在圖7和8中顯示。當(dāng)用于本文時，中和試劑是指適于減小或者抵消由抗生物膜試劑引起的任何毒性的任何組合物。如果它對于所用的抗生物膜試劑和對于具體的生物膜是有效的，那么中和試劑是適宜的。中和試劑的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。一些中和試劑和組合物在實施例中顯示。如在圖7中所示和在實施例中所述，恢復(fù)培養(yǎng)基是包含一種或多種中和試劑的組合物。當(dāng)用于本文時，活性劑或抗生物膜試劑是指有效減少、降解或者消除生物膜或生物膜樣結(jié)構(gòu)的一種或多種試劑。本發(fā)明包括但不限于，已經(jīng)公知的活性劑，例如，抗生素，抗微生物劑，和殺生物劑。一種或多種活性劑可以獨(dú)立作用；一種或多種活性劑可以組合或協(xié)同作用；一種或多種活性劑可以順序或連續(xù)地應(yīng)用。當(dāng)用于本文時，活性劑組或文庫是指按照預(yù)先確定的方法分組的多樣的或多種活性劑的集合。例如，第一文庫可以包含一種或多種活性劑，所述活性劑在有效抗具體的生物膜中表現(xiàn)出某種程度的潛力。第二文庫可以以第一文庫的子集起始，并且設(shè)計成縮小有效活性劑的選擇，或者提供關(guān)于活性劑的具體子集的更多的信息。一組或文庫還可以包含按照預(yù)先確定的方法，例如，可變的劑量，而分組的專有(proprietary)或非專有活性劑組。當(dāng)用于本文時，含有活性劑的組合物包含一種或多種活性劑，并且還可以包含一種或多種其它試劑，包括但不限于細(xì)菌素或其它抗細(xì)菌肽或多肽，一種或多種消毒劑等，一種或多種表面活性劑等，一種或多種載體、生理鹽水等，一種或多種稀釋劑等，以及一種或多種防腐劑等。當(dāng)用于本文時，樣品是指從患者、動物或環(huán)境采集的生物或流體樣品；樣品確切地包含任何來源或潛在來源的微生物?；颊叩姆蛛x物來源于標(biāo)準(zhǔn)的實驗室方法，并且還通過標(biāo)準(zhǔn)實驗室操作(CLSI)制備用于檢測。用于攻擊板的接種物包括應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)，美國專利號6051423,6326190,6410256,6596505,6599696和6599714，而以標(biāo)準(zhǔn)密度形成的生物膜。當(dāng)用于本文時，生物膜攻擊包括將在栓MBEC裝置上生長的生物膜培養(yǎng)物置于預(yù)先包裝的攻擊盤的孔中，以致患者的分離物暴露于某種濃度范圍的針對它們抗目標(biāo)生物體的協(xié)同作用進(jìn)行選擇的抗生素譜。所用的培養(yǎng)時間和條件以及培養(yǎng)基隨分離物而不同。當(dāng)用于本文時，功效是基于組合的抗生素具有生物膜活性的能力，并且基于MIC(最小抑制濃度)、MBC(最小殺生物濃度)禾nMBEC(最小生物膜根除濃度)而定義。檢測細(xì)菌抗生素敏感性的標(biāo)準(zhǔn)檢測是最小抑制濃度(MIC)，其檢測細(xì)菌在它們的浮游階段的敏感性。MIC是確定細(xì)菌在其生物膜階段的真正抗生素敏感性的有限的值。另一方面，MBEC檢測允許在生物膜階段的細(xì)菌的直接測定，并且包括在生物膜生長裝置或板上形成生物膜，將生物膜暴露于一種或多種測試抗生素或活性劑確定的時間周期，將生物膜轉(zhuǎn)移到具有新鮮細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基的第二個板上，并且將生物膜培養(yǎng)過夜。MBEC值是防止細(xì)菌從處理過的生物膜再生的最低活性劑稀釋度。當(dāng)用于本文時，處理方案是指活性劑的劑量，活性劑的組成，和它應(yīng)該施用的頻率。使用本發(fā)明的裝置和方法，所述處理方案可以適合具體的人或動物，具體的一種生物膜或多種生物膜，和/或具體的疾病或病況。對于一些疾病和病況，例如，CF，可以理想地在不同的時間進(jìn)行獨(dú)立的檢測，以優(yōu)化治療療程。例如，據(jù)信，當(dāng)患者和感染改變時，CF患者的病況隨著時間改變；監(jiān)測這些變化并且在需要時改變?nèi)魏翁幚韺⑹怯欣慕Y(jié)果。當(dāng)用于本文時，有利的結(jié)果是指任何程度抗微生物或生物膜的功效。益處的實例包括但不限于在生物膜或形成生物膜的微生物中的減低，消除，根除，或減少；并且處理微生物的能力被生物膜掩蓋或防止。在治療患者的方式中的改進(jìn)的代表性實例包括但不限于治療具體的患者的能力或潛能，使治療方案在具體的時間適合具體的患者的能力；和能夠選擇一種或多種特別的活性劑的提高的能力。當(dāng)用于本文時，敏感性檢測或相似的短語是指確定活性劑是否并且以多少量影響在生物膜中的微生物的生長或狀態(tài)。在本發(fā)明的裝置和方法中，敏感性檢測與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，在于其使用高通量的裝置，在非靜止環(huán)境中形成生物膜，通過流動系統(tǒng)產(chǎn)生生物膜。當(dāng)用于本文時，高通量是指同時或者在同一步驟中生長和/或檢測大量生物膜和/或大量抗生物膜試劑的能力。典型地，高通量體現(xiàn)為以一種或多種組件存在的結(jié)構(gòu)元件，以提高生長或被檢測的物質(zhì)的速度或數(shù)量，例如，96孔檢測板，適合并且設(shè)置成與96孔板嚙合的頂蓋，具有與所述孔相對應(yīng)的栓的頂蓋，和具有通道的生物膜生長板，以致你可以同時處理大量的單個生物膜。實施例下述用于實施例1-4:抗生素和其它抗微生物劑儲液應(yīng)該以在攻擊板中所用的最高濃度的5X預(yù)先制備。例如，去離子水或適當(dāng)?shù)娜軇┯脕碇苽?120pgml"活性劑的抗生素儲液。參考臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所(ClinicalLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)文獻(xiàn)M100-S8關(guān)于應(yīng)該使用哪種溶劑和稀釋劑的詳情。大部分抗生素儲液在-7(TC穩(wěn)定最少6個月。對于科研應(yīng)用，適當(dāng)?shù)貞?yīng)用中和劑來確定最小殺細(xì)菌和殺真菌濃度。這些試劑減少生物活性化合物從攻擊到恢復(fù)培養(yǎng)基的殘余物的毒性。例如，可以使用|3-內(nèi)酰胺酶中和青霉素，或L-半胱氨酸中和Hg^和一些其它的重金屬陽離子。下述實驗在殺生物劑敏感性檢測中使用通用的中和劑，所述中和劑是調(diào)節(jié)產(chǎn)品開發(fā)方面必需的。這一實施例描述如下1.OgL-組氨酸l.OgL-半胱氨酸2.0g還原谷胱甘肽用雙蒸水補(bǔ)足到20ml。通過具有0.20pm濾器的注射器以除菌。這一溶液可以保存在-2(TC。補(bǔ)足1升適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基(陽離子調(diào)節(jié)的MHB)。將這種培養(yǎng)基每升補(bǔ)充20.0g皂苷和每升補(bǔ)充10.0g吐溫-80。用稀釋的NaOH調(diào)節(jié)到正確的pH(在20。C7.0±0.2)。向用于恢復(fù)板的每20ml補(bǔ)充表面活性劑的生長培養(yǎng)基中加入500通用中和劑。在圖4中提供這一實驗方案的綜述。完成這一方案需要的天數(shù)取決于要檢驗的微生物的生長速率。所述方案被分成6個相續(xù)的步驟，每一步驟在下文部分中詳細(xì)敘述。這種方案研發(fā)用于Nimc牌，平底，96孔微量滴定板。這些微量板具有每孔300^的最大體積。對于不同牌子的微量滴定板，這里列出的培養(yǎng)基和緩沖液的體積可能需要調(diào)整。實施例1.步驟1-生長需要的微生物的傳代培養(yǎng)物1如果使用低溫儲液(在一7(TC)，將需要的細(xì)菌或真菌菌株的第一傳代培養(yǎng)物劃線到適當(dāng)?shù)沫傊桨迳?。在所述微生物的最佳生長溫度培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間階段。對于大部分細(xì)菌菌株，所述第一傳代培養(yǎng)物可以用石蠟?zāi)?Parafilm)包裹，并且在4。C保存多達(dá)14天。2檢驗所述第一傳代培養(yǎng)物的純度(即，在平板上只應(yīng)該存在單菌落形態(tài))。3從所述第一傳代培養(yǎng)物或從臨床分離物，將第二傳代培養(yǎng)物劃線到適當(dāng)?shù)沫傊桨迳?。在所述微生物的最佳生長溫度培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間階段。第二傳代培養(yǎng)物應(yīng)該在它第一次從溫育移開的時刻開始的24小時之內(nèi)使用。4檢驗第二傳代培養(yǎng)物的純度。不推薦在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上生長傳代培養(yǎng)物。抗生素和其它抗微生物劑可能在細(xì)菌中引發(fā)適應(yīng)性脅迫反應(yīng)和/或可能在群體中增加突變體的積聚。這可能導(dǎo)致異常的敏感性確定。步驟2-接種組件這一步驟，接種組件，在圖5中圖示。概括地，新鮮的第二傳代培養(yǎng)物用來產(chǎn)生匹配l.OMcFarland標(biāo)準(zhǔn)的接種物。這種溶液用生長培養(yǎng)基1比30稀釋。將22ml的1比30的稀釋液加入到本發(fā)明組件的基底的槽中。將所述裝置置于搖動臺上以輔助在聚苯乙烯栓上形成生物膜。推薦下述步驟應(yīng)該在生物安全柜中(如果可用的話)進(jìn)行。然而，在工作臺上應(yīng)用無菌技術(shù)是可能的1.打開無菌96孔微量滴定板。對于每次高通量檢測，將微量滴定板從A到F'排'的4(列，用180lal生理鹽水溶液填充。2.將1.5ml(對于同時接種的每個另外的裝置加1.0ml)需要的肉湯生長培養(yǎng)基加入到無菌玻璃檢測管中。3.使用無菌棉簽，收集在第二瓊脂傳代培養(yǎng)物表面上的細(xì)菌菌落。棉簽頂端覆蓋一薄層細(xì)菌。4.將所述棉簽浸沒在肉湯中懸浮細(xì)菌。目的是產(chǎn)生匹配1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)(即3.0X108cfoml")的混懸液。小心不要在溶液中形成細(xì)菌團(tuán)。5.重復(fù)步驟2，部分3和4根據(jù)需要進(jìn)行多次，以匹配光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。6.將29ml適當(dāng)?shù)娜鉁L培養(yǎng)基(例如，TSB)加入到無菌的50ml聚丙烯或玻璃管中。向所述聚丙烯或玻璃管中加入l.Oml1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌混懸液。這種1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)(即I,OXIO7cfiiml")的30倍稀釋物作為所述裝置的接種物。7.打開所述裝置的無菌包裝。將所述接種物倒入試劑儲存器中。使用無菌移液器，將22ml接種物加入到用所述裝置包裝的槽中。將栓蓋放置到槽上。校準(zhǔn)在這一步驟中所用的接種物的體積，以致生物膜覆蓋被步驟3(下文)設(shè)置的攻擊板中所用的抗微生物劑體積完全浸沒的表面積。使用更大體積的接種物可能導(dǎo)致在栓的高處形成生物膜，其物理地避免暴露在該攻擊步驟中。8.將所述裝置放置在適當(dāng)溫度的濕潤的培養(yǎng)箱中的搖動臺上。所述臺應(yīng)該設(shè)置在每分鐘3-5次搖動。關(guān)鍵是搖動臺的角度設(shè)置在9°-16°的傾斜。這種運(yùn)動必須是對稱的。9.將接種物樣品連續(xù)稀釋(10倍)(重復(fù)3或4次)。這些是用來檢驗接種物中的起始細(xì)胞數(shù)的對照。10.在適當(dāng)標(biāo)記的系列瓊脂平板上從10—6到10"點滴接種接種物的連續(xù)10倍稀釋物。將點滴板溫育適當(dāng)?shù)臅r間階段，并且為生長打分。實施例2.步驟3-設(shè)置抗微生物攻擊板下述部分描述怎樣在攻擊板上設(shè)置單一抗微生物劑的連續(xù)兩倍稀釋梯度。這只是一個實例。抗微生物劑攻擊板可以以抗微生物劑的任何組合所需要的任何方式設(shè)置。重要地是攻擊板的每個孔的終體積是200^1。這是確保將生物膜完全浸沒在抗微生物劑中。1.取一個全新的無菌96孔微量滴定板，并且在層流罩超靜臺中將其打開。2.在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中設(shè)定需要的抗微生物劑的工作溶液。不要將所述抗微生物劑稀釋超過20%(g卩，每4份生長培養(yǎng)基不超過1份儲備的抗微生物劑溶液)?？刮⑸飫┑墓ぷ魅芤簯?yīng)該以與在攻擊板中檢測的最高濃度相等的濃度制備。3.將200pl生長培養(yǎng)基加入到攻擊板的第1'列，和第12'列'。這些將分別作為無菌狀態(tài)和生長對照。4.將100生長培養(yǎng)基加入到微量滴定板的第3-11'列'。5.將200nl工作溶液加入到微量滴定板的第2'列'。6.將100^工作溶液加入到微量滴定板的第3《列'和第4(列'。7.使用多通道微量移液器，通過上下吹吸將第4'列'的內(nèi)容物混合?；旌虾?，從第4'列，中的孔轉(zhuǎn)移100pl到第5<列，中相對應(yīng)的孔中。8.混合，從第5'列，轉(zhuǎn)移IOOjal到第6'列'。沿著微量滴定板的長連續(xù)重復(fù)這一混合和轉(zhuǎn)移步驟，直到達(dá)到第ll^列'。9.將第11列的內(nèi)容物上下混合。從第11'列'中的每個孔中吸取100并且棄之。10.向第4-11'列，的孔中加入100pl生長培養(yǎng)基。11.將蓋子重新放置在攻擊板上。輕輕敲打板，以促進(jìn)殺生物劑/抗生素和培養(yǎng)基的混合。步驟4-暴露生物膜本步驟，將生物膜暴露于一種或多種抗微生物劑，圖示在圖6中。簡言之，將上文準(zhǔn)備的組件從旋轉(zhuǎn)搖動器上移下，并且將生物膜在生理鹽水溶液中漂洗。然后將漂洗的生物膜浸沒在攻擊板的抗微生物劑中，并且溫育需要的暴露時間。1.在每個孔中用200fil生理鹽水溶液設(shè)置無菌微量滴定板。這一板將用來漂洗栓，以從生物膜上去除松散附著的浮游細(xì)胞(這叫作'漂洗板，)。2.本步驟將用來確定在4個樣品栓上和來自4個孔的浮游培養(yǎng)物的生物膜生長。對于每個接種的裝置，在A排4'列'中用200pl生理鹽水溶液設(shè)置無菌微量滴定板(即，每3個裝置需要1個微量滴定板)。用180^生理鹽水溶液填充B-F排。在第二個微量滴定板中，對于每個接種的裝置，用lS0(il生理鹽水溶液填充從A到H排的4'列'。第一個微量滴定板將用來進(jìn)行生物膜培養(yǎng)物的連續(xù)稀釋，第二個將用來檢驗在含有接種物的微量滴定板的孔中浮游細(xì)胞的生長。3.在需要的溫育時間之后，將高通量的組件從搖動臺上移下，并且移入層流罩超靜臺。將栓蓋從槽上移下，并且將栓浸沒在漂洗板的孔中。在進(jìn)行下述步驟4時讓所述漂洗板靜置1-2分鐘。4.使用微量移液器將20)^1浮游培養(yǎng)物(在裝置的波狀槽中)轉(zhuǎn)移到在步驟2(直接見上文)設(shè)置的后一板'A，排的180pl鹽水中。重復(fù)這一操作3次，總共4X20pl整分試樣。5.將浮游培養(yǎng)物棄入適當(dāng)?shù)纳镂：π詮U品中。6.在層流罩超靜臺中，將一對鑷子浸沒在95%的乙醇中。在通風(fēng)櫥(flowhood)中用酒精燈灼燒鑷子。當(dāng)使用酒精燈時要小心。在使用70%乙醇消毒后手晾干之前不要點燃酒精燈，并且不要灼燒鑷子。7.使用灼燒的鑷子，將栓A1、Cl、E1和G1從組件的蓋子折斷，并且將它們浸沒在步驟2設(shè)置的第一個板的A排中(并且分別在不同'列')的200W的鹽水中。8.使用灼燒的鑷子，將栓B1、Dl、F1和H1折斷并且丟棄。9.將組件的栓蓋插入到攻擊板中。將所述攻擊板置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)箱持續(xù)需要的暴露時間。考慮到MIC確定的擴(kuò)大的次數(shù)，溫育可以在備選溫度進(jìn)行。10.將含有樣品栓的微量滴定板置于超聲清潔器(超聲發(fā)生器)的托盤中。在設(shè)定的'高'處超聲5-30分鐘(需要的時間取決于被檢測的微生物)。由超聲發(fā)生器在水中產(chǎn)生的振動首先從水中傳播，然后通過鋼制的插入盤傳播，并且最后傳播到所述裝置，以應(yīng)用振動將生物膜從96栓的表面分解到鹽水中。11.在相對應(yīng)的微量滴定板的孔中連續(xù)稀釋20(il浮游培養(yǎng)物的整分試樣(來自步驟4)。一旦超聲處理完成，用生物膜培養(yǎng)物重復(fù)這一連續(xù)稀釋步驟。12.在適當(dāng)標(biāo)記的系列瓊脂平板上用浮游的和生物膜培養(yǎng)物的連續(xù)10倍稀釋物點滴接種，從10—s到l(^和從10's到l(A將點滴板溫育適當(dāng)?shù)臅r間階段，并且為生長打分。步驟5-中和與恢復(fù)本步驟，中和抗微生物劑并且恢復(fù)存活的生物膜細(xì)菌，圖示在圖7中。簡言之，在暴露后，將生物膜在生理鹽水中漂洗兩次。然后，將生物膜轉(zhuǎn)移到含有中和劑和恢復(fù)培養(yǎng)基的微量滴定板中。在水層超聲發(fā)生器(watertablesonicator)中通過超聲處理將生物膜分解到其中。1.向全新的96孔微量滴定板的每個孔中加入200pl適當(dāng)?shù)幕謴?fù)培養(yǎng)基(含有中和劑，參見部分3.2的實施例)。這一板叫作"咴復(fù)板'。2.為所用的每個組件準(zhǔn)備2個漂洗板。3.將攻擊板從培養(yǎng)箱移出，并且置于層流罩超靜臺中(或者使用小心的無菌技術(shù))。將栓蓋移開并且將栓浸沒在漂洗板的生理鹽水中。將攻擊板用漂洗板的無菌蓋子蓋上。大約1分鐘后，將所述栓蓋從第一個漂洗板轉(zhuǎn)移到第二個漂洗板中。將攻擊板蓋上，并且如果適當(dāng)保留用于MIC確定。4.將所述栓蓋從第二個漂洗板轉(zhuǎn)移到上文設(shè)置的恢復(fù)板。將恢復(fù)板(包含裝置的栓)轉(zhuǎn)移到超聲發(fā)生器的托盤中。高度超聲5-30分鐘(這取決于生物膜的厚度)。振動將把生物膜從96栓表面分解到恢復(fù)板中。5.超聲處理后，將栓蓋從恢復(fù)板移開并且代替所述微量滴定板的原始蓋子?，F(xiàn)在所述裝置的蓋子可以丟棄到高壓滅菌廢物中。6.將所述恢復(fù)板置于培養(yǎng)箱中，并且溫育最少24-72小時，這取決于被檢驗的生物體。存活細(xì)胞計數(shù)為了在用抗微生物劑處理后生物膜的存活細(xì)胞計數(shù)，從恢復(fù)板轉(zhuǎn)移100pl恢復(fù)培養(yǎng)基(含有超聲的生物膜)到連續(xù)稀釋板的A排。另外設(shè)置這一板以在B-F排的每個孔中含有180^生理鹽水溶液。使用多通道移液器從A排連續(xù)稀釋20pl。在向微量滴定板的每排轉(zhuǎn)移之間確保更換多通道移液器上的管尖(tip)。在適當(dāng)標(biāo)記的瓊脂平板上點滴接種生物膜培養(yǎng)物(其已被連續(xù)稀釋IO倍)。溫育最少48小時，以保證存活微生物的最大程度的恢復(fù)。在溫育后，計數(shù)在板上恢復(fù)的細(xì)菌。應(yīng)用下部分的公式確定生物膜群體的殺死。為了計算死亡和存活(log-kill)，應(yīng)用下述公式log-kill=log10(初始cfWml)_log10(暴露后剩余的cfWml)備選地，log-kill=log1()[l/(1—％殺死(以小數(shù)))]為了計算殺死百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用下述公式%殺死=[1一(剩余cfU/ml)/(初始cfWml)]X100為了計算存活百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用下述公式-%存活=[(暴露后剩余cfU/ml)/(初始cfii/ml)]X100為了計算存活百分?jǐn)?shù)的對數(shù)，應(yīng)用下述公式1og。/。存活=10§1()(%存活)顯微鏡檢對于許多顯微鏡技術(shù)，可以理想地將生物膜固定在所述組件的栓表面上?？梢詰?yīng)用下述方案來制備用于掃描電鏡(SEM)和共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)的生物膜。在上述標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟中，每個攻擊板具有8個生長對照(在暴露之前)。這些當(dāng)中的4個用作生長對照。其余4個可以用于顯微鏡檢，而不是丟棄。固定生物膜用于掃描電鏡(SEM)準(zhǔn)備工作溶液在下述步驟中戴上保護(hù)性手套，并且在通風(fēng)櫥中處理這些高毒性化學(xué)二甲胂酸緩沖液0.1M:將16g二甲胂酸溶解在l升雙蒸H20中；調(diào)整到pH7.2。二甲胂酸緩沖液中2.5%的戊二醛將2ml70%戊二醛溶解在52ml二甲胂酸緩沖液中(產(chǎn)生2.5%的溶液)。還可以使用5%的溶液(2ml戊二醛在26ml二甲胂酸緩沖液中)。標(biāo)準(zhǔn)方案這種固定技術(shù)對于生物膜是破壞性的。然而，這允許對潛在的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的檢查。1.使用一對灼燒的鑷子，將栓從MBECTM-HTP裝置上折斷。2.將栓在0.9%鹽水中漂洗1分鐘。這破壞松散附著的浮游細(xì)菌。3.將栓在0.1M二甲胂酸(pH7.2)的2.5c/。戊二醛中固定。在4"C栓在這種溶液中放置16小時。4.在這一固定步驟之后，將栓在0.1M二甲胂酸中洗滌一次大約10分鐘。5.將栓在雙蒸水中洗滌一次大約10分鐘。6.將栓在70%乙醇中脫水15-20分鐘。7.空氣干燥最少24小時。8.封固標(biāo)本，并且通過SEM檢查。備選方案這種固定技術(shù)較少破壞性?？赡苡^察到細(xì)胞外聚合基質(zhì)和一些(雖然脫水的)生物膜結(jié)構(gòu)。1.使用一對灼燒的鑷子，將栓從MBECTM-HTP裝置上折斷。2.將栓在0.9%鹽水中漂洗2分鐘。這破壞松散附著的浮游細(xì)菌。3.將栓在0.1M二甲胂酸(pH7.2)的2.5。/。戊二醛中固定。在2(TC栓在這種溶液中放置2-3小時。4.空氣干燥最少120小時。5.封固標(biāo)本，并且通過SEM檢査。固定生物膜用于共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)在磷酸緩沖鹽水中的5%戊二醛將2ml70%的戊二醛溶解在26ml磷酸緩沖鹽水中(產(chǎn)生5%的溶液)。標(biāo)準(zhǔn)方案1.使用一對灼燒的鑷子，將栓從蓋子上折斷。2.將栓在0.9%鹽水中漂洗1分鐘。這破壞松散附著的浮游細(xì)菌。3.將栓在磷酸緩沖鹽水(pH7.2)中的5Q/。戊二醛中固定。在3(TC栓在這種溶液中放置0.5-l小時。4.將栓在0.9%鹽水中漂洗1分鐘。5.將栓用適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)染色，并且使用共焦激光掃描顯微鏡檢查。表面包被組件的凸起栓或凸起的表面可以用許多物質(zhì)包被，以促進(jìn)苛求微生物的生長。例如，由特定的念珠菌屬物種(Cam/Waspp.)形成的生物膜通過用1.0。/。L-賴氨酸溶液包被栓而增強(qiáng)。栓蓋還可以用羥基磷灰石(hydroxyapetite)、膠原或鉑包被。實施例3確定MBEC值為了確定最小生物膜根除濃度(MBEC)值，在恢復(fù)板的孔中檢查濁度(視覺上的)。備選地，使用微量滴定板讀數(shù)儀，獲得在650nm的光密度檢測(OD650)。清澈的孔(OD650<O.l)表明生物膜根除。實施例4確定MIC值為了確定最小抑制濃度(MIC)值，在攻擊板的孔中檢查濁度(視覺上的)。備選地，使用微量滴定板讀數(shù)儀，獲得在650nm的光密度檢測(OD650)。MIC定義為抑制生物體生長的最小抗生素濃度。清澈的孔(OD650<O.l)表明在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時間后的抑制。實施例5背景銅綠假單胞菌(尸"wc/omo"asaerag/"ora(Ps))和金黃色葡萄球菌(5Vap/7y/ococcmaMm^(Staph))在組織和移植的表面上形成生物膜，這導(dǎo)致頑固的感染，由于生物膜-特異的抗性機(jī)制，所述頑固感染通常對抗微生物劑治療沒有反應(yīng)。應(yīng)用MIC選擇用于生物膜感染的抗微生物劑治療通常不適用。1^/^￡0@檢測用于評估生物膜和浮游細(xì)菌對單一的和組合的試劑的抗微生物劑敏感性。方法Ps(來自囊性纖維化患者的12份分離物)和葡萄球菌(Staph)(來自與裝置相關(guān)的感染的12份分離物)的生物膜在MBEC檢測蓋子的栓(pins)上形成。然后將生物膜和浮游細(xì)菌暴露于不同的抗生素和抗生素組合24小時(表1和2)。所述檢測提供作為生物膜和浮游生物體的每種分離物對單獨(dú)的或組合的抗微生物劑的定性敏感性。結(jié)果表i.對單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的i3萄球菌抗性抗生素浮游的生物膜抗生素浮游的生物膜GM/CLOX112VAN/GM112GM細(xì)P312CLIN/AMP612GM/CFZ312VA畫F了11GM/CL1N1012CIPRO/RIF1210GM/RIF1212CIPRO/CFZ412GM/C1PRO912CLOX/RIF812C畫R1F1212GM610CLIN/CLOX412AMP1212CLIN/VAN412CFZ212CLIN/CFZ412CIPRO1012C匿CIPRO1012VAN612VAN/CFZ112CUN912VAN/CLOX312CLOX312VAN/CIPRO112表2.對單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的Ps抗性抗生素浮游的生物虔GM/AZTRGM/CFTZTB/AZTRTB/CFTZP+T/TBP+T/GMAK/AZTRAK/P+TTB/CIPRO■MPGM/IMPCLO/RIFAK/CFTZAK細(xì)P13311223188241212121212121212121212121211抗生素浮游的生物膜CLO汀MS03CFTZ/AZTR1112CIPRO/AK512CIPRO/AZTR03P+T412CLO212AZTR09IMP1212結(jié)論對于每種菌株抗性模式是獨(dú)特的。作為浮游形式，PS和葡萄球菌菌株對多種抗生素敏感，但是作為生物膜顯著更有抗性。某些抗生素當(dāng)組合時比單一試劑更加有效。^48￡0@檢測可以用于選擇治療生物膜相關(guān)的感染的抗生素。實施例6生物膜(bioFILM)PA抗微生物劑敏感性系統(tǒng)生物膜PA面板設(shè)計用來確定浮游的和生物膜銅綠假單胞菌二者的抗2212248833ocG微生物劑敏感性。概述和原理這種肉湯稀釋物抗微生物劑敏感性檢測具有各種單獨(dú)的和組合的抗微生物劑，其稀釋在由臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所TM(CLSI)定義的絕對斷點濃度(categoricalbreakpointconcentration)的陽離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯(CAMHB)中。使用95個栓的接種蓋子，將面板孔接種浮游的和生物膜銅綠假單胞菌。然后將面板和具有栓的蓋在35'C溫育最少16小時。浮游生物的敏感性和抗性通過在35'C溫育16-24小時后檢測在抗微生物劑存在下的抑制和生長而確定。將含有已經(jīng)暴露于抗微生物劑的生物膜細(xì)菌的具有栓的蓋置于在96孔板中只含有CAMHB的恢復(fù)培養(yǎng)基中。生物膜敏感性和抗性通過檢測繼續(xù)在35X:溫育16-24小時后的抑制和生長而確定。方法材料生物膜(bioFILM)PA斷點面板有蓋無菌恢復(fù)面板無菌MBECTM具有95個栓的接種蓋無菌MBECTM托盤(用于生長接種物)無菌漂洗面板0.5McFarland硫酸鋇濁度標(biāo)準(zhǔn)接種物水接種物肉湯(胰胨肉胨培養(yǎng)液)檢測和恢復(fù)肉湯，陽離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)具有一次性管尖的100pl移液器多通道微量移液器(推薦具有12通道的50-300pl)搖動平臺(9。傾斜角)25ml移液器具有螺旋蓋的無菌50ml管定性對照生物體(銅綠假單胞菌，ATCC27853)定性對照報告形式96孔微量滴定板(l個用于栓洗滌，和l個用于恢復(fù)板)振蕩器步驟概述A.接種物準(zhǔn)備CLSI推薦通過菌落計數(shù)而定時檢查接種物密度。對于銅綠假單胞菌ATCC27853的期望結(jié)果應(yīng)該接近大約5Xl()SCFU/m^3。1.主要接種方法推薦用濁度標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)直接接種銅綠假單胞菌。a.使用無菌木制涂布棒或細(xì)菌環(huán)，觸及來自18-24小時非抑制性瓊脂平板的4-5個大的或5-10個小的形態(tài)相似的、充分分離的菌落的表面。b.在3ml接種物水(高壓滅菌的蒸餾水)中乳化，并且與0.5McFarland標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。c.振蕩混懸液2-3秒。d.將88gl標(biāo)準(zhǔn)化的混懸液移液到無菌的22ml胰胨肉胨培養(yǎng)液(TSB)中。緊密蓋上。顛倒8-10次或者將樣品振蕩幾秒鐘以混合。2.準(zhǔn)備生物膜(bioFILM)PA接種栓蓋a.從包裝移出MBECTM托盤和95個栓的蓋(如果包裝的完整性被破壞不要使用)。b.從托盤移出栓蓋。c.吸取在TSB中的22ml銅綠假單胞菌混懸液(參見Id)到槽型托盤中。d.將95個栓的接種蓋放置在托盤上(檢査栓蓋正確排列以牢固地配合托盤)。e，將組裝的栓蓋和托盤放置在具有大約9。傾斜的搖動平臺上。排列槽，使之與搖動方向平行。在35t:溫育，每分鐘3-4次搖動。由于傾斜角太大或者平臺搖動不對稱，所以一些搖動器不適合生物膜(bioFILM)PA檢測。操作者應(yīng)該檢查以確定搖動器滿足這一檢測必要的要求。f.溫育4-6小時。這足以產(chǎn)生約l()Scfli/栓的生物膜。B.面板準(zhǔn)備l.從冷凍保藏中移出待用的面板。打開封袋，移出面板，并且允許平衡到室溫30-60分鐘。C.浮游生物抗微生物劑敏感性檢測1.將準(zhǔn)備好的MBECTM95個栓的蓋放置在解凍的bioFILMPA面板上。2.應(yīng)該獲得3-7X105CFU/ml的最終浮游銅綠假單胞菌的孔濃度2。3.應(yīng)該通過將接種物劃線到血瓊脂平板上并且溫育16-20小時而準(zhǔn)備純度板。如果在純度板上存在不止一種菌落形態(tài)，那么保證重新分離檢測菌落和重新檢測所述面板。D.抗微生物劑面板培養(yǎng)1.將所述面板以3-5個為組疊放，以保證在培養(yǎng)過程中均勻的熱量分布。2.將所述面板在無C02培養(yǎng)箱中在35"C培養(yǎng)16-24小時。3.在16-24小時培養(yǎng)之后，浮游生物面板準(zhǔn)備好進(jìn)行讀數(shù)。4.移開帶栓的蓋(參見/下述部分El.)。5.讀取浮游生物抗微生物劑敏感性結(jié)果(參見下述F)。E.生物膜抗微生物劑敏感性檢測1.將帶栓的蓋置于每孔含有200gl±10gl接種物水的96孔板中大約30秒。進(jìn)行這以便從栓上去除任何殘余的抗生素。2.將帶栓的蓋置于每孔含有200glCAMHB的96孔恢復(fù)板中。3.為了確保在培養(yǎng)過程中均勻的熱量分布，將所述面板以每組不多于5個疊放。4.將所述面板在無C02培養(yǎng)箱中在35'C培養(yǎng)16-24小時。5.培養(yǎng)16-24小時后，生物膜恢復(fù)面板準(zhǔn)備好進(jìn)行讀數(shù)。6.移開帶栓的蓋并且丟棄。7.讀取生物膜抗微生物劑敏感性結(jié)果(參見下述F)。F.對關(guān)于浮游生物的和生物膜敏感性的面板進(jìn)行讀數(shù)1.在16-20小時培養(yǎng)之后，移出面板。2.用沒有棉絨的棉紙擦拭面板底部，以去除可能存在的任何凝聚物或殘渣。3.在抗微生物劑孔中的生長出現(xiàn)混濁，其可能采取下述形式在整個孔中的白色霧狀，在孔中央的白色塊狀(whitebutton)，或者在整個孔中的細(xì)小顆粒生長。不充分的或沒有生長定義為在孔中或肉湯中的微白色。4.對面板進(jìn)行讀數(shù)的預(yù)防措施a.如果生長孔混濁，那么只對所述面板進(jìn)行讀數(shù)。b.如果無菌對照孔(SC)混濁，或者如果在生長孔或生長對照(GC)中沒有生長，那么不要對抗微生物劑敏感性孔進(jìn)行讀數(shù)。G.讀取浮游生物抗微生物劑敏感性:描述結(jié)論編碼在16-20小時培養(yǎng)后，在更高和更低的抗微生物劑濃度的抗微生物劑中沒有生長敏感型S在更低濃度的抗微生物劑中生長，但是在更高濃度的抗微生物劑中不生長中間型I在兩種濃度的抗微生物劑中都生長抗性型R結(jié)果解釋通過比較生物體的斷點敏感性與可獲得的抗微生物劑的血液或尿液水平，而確定敏感性。下表列出在CLSI文獻(xiàn)M100-S9中顯示的解釋標(biāo)準(zhǔn)。J.解釋斷點*抗微生物劑敏感性中間型抗性阿米卡星<1632>64氨曲南<816>32頭孢吡肟<816>—32頭孢他啶<816>32氯霉素<816>32環(huán)丙沙星<12>4多粘菌素E<2->4慶大霉素<48>16美羅培南<48>_16哌拉西林/三唑巴坦<16/432/4>64/4>28/4甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<2/38->4〃6妥布霉素<48>16阿米卡星/氨曲南<16/832/16>64/32阿米卡星/頭孢吡后<湖32/16>64/32阿米卡星/頭孢他啶<扁32716>64/32阿米卡星/環(huán)丙莎星<16/132/2>64/4阿米卡星/多粘菌素E<搬->64/4阿米卡星/美羅培南<湖32/8>64/15阿米卡星/哌拉西林/三唑巴坦<湖6/432/32/4-3潔/4>64/128/4阿米卡星/甲氧芐啶/磺胺甲噁唑—<16/測->64/4/76氯霉素/頭孢他啶<8/816/16>32/32氯霉素/美羅培南<8/416/8>32/16環(huán)丙沙星/氨曲南<1/82/16>4/32環(huán)丙沙星/多粘菌素E<1/2->4/4環(huán)丙沙星/美羅培南<1/42/8>4/16環(huán)丙沙星/哌拉西林/三唑巴坦<1/湖2/32/4-2/64/4>4/128/4環(huán)芮沙星A甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<1/2/38->W76慶大霉素/氨曲南<4/88/16>16/32慶大霉素/頭孢吡肟<4/88/16>16/32慶大霉素/頭孢他啶<4/88/16>16/32慶大霉素/環(huán)丙沙星<4/18/2>湖慶大霉素/多粘菌素E<4/2->16/4慶大霉素/美羅培南<4/48/8>16/16慶大霉素/哌拉西林/三唑巴坦<4/湖8/32/4-8/64/4>16/128/4慶大霉素/甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<4/2/38->16/4/76妥布霉素/氨曲南<4/168/32>16/64妥布霉素/頭孢吡后<4/88/16>16/32妥布霉素/頭孢他啶-<4/88/16>16/32妥布霉素/環(huán)丙沙星<4"8/2>15/4妥布霉素/多粘菌素E<4/2->16/4妥布霉素/美羅培南<4/48/8>湖6妥布霉素/哌拉西林/三唑E坦<4/湖8/32/4-8/64/4>16/128/4妥布霉素/甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<4/2/38->16/4/76甲氧芐啶'/磺胺甲噁唑/氨曲南<2/38/16->4/76/64甲氧芐啶/磺胺甲噁唑/頭孢他啶<2/38/8->4/76/32甲氧芐啶/磺胺甲噁唑/美羅培南一<2/38/4->一4/76/16甲氧芐啶/磺胺甲噁唑/哌拉西林/<一2/38/15/4-;>4/76/128/'基于在CLSI文獻(xiàn)M100-S16中顯示的解釋斷點1.Murray,PR.,E丄Baron，M,A.Pfaller，F(xiàn).C.Tenover和R.H.Yolken(eds)2003.ManualofClinicalMicrobiology(臨床微生物學(xué)手冊)，第8版.AmericanSocietyofMicrobiologyWashington,D.C.(華盛頓美國微生物學(xué)會)2.ClinicalStandardLaboratoryInstituteTM(2006)(臨床標(biāo)準(zhǔn)實驗室研究所TM(2006)).Methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically(用于關(guān)于需氧生長細(xì)菌的稀釋抗微生物劑敏感性檢測的方法)滯6版.批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)M7-A7.3.ClinicalStandardLaboratoryInstituteTM(2006)(臨床標(biāo)準(zhǔn)實驗室研究所(關(guān)于抗微生物劑敏感性檢測的性能標(biāo)準(zhǔn))；第16次信息增刊，Wayne,賓夕法尼亞CLSI文獻(xiàn)M100-S16，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所)，940WestRoadSuite1400,Wayne,賓夕法尼亞.實施例7使用在圖10中所示的攻擊板設(shè)置和斷點，重復(fù)在實施例6中描述的實驗。實施例8在本研究中，使用銅綠假單胞菌生物膜檢測試劑盒檢測在不同濃度的10種抗生素以及這些抗生素的組合的作用，并且比較抗生素對兩種銅綠假單胞菌菌株CF6649和CF6106的作用?；陲@示抗生素組合和微生物生物膜之間的效力的初步研究結(jié)果，而選擇抗生素和抗生素組合。形成生物膜:準(zhǔn)備生物體的混懸液，以致在TSB中的混濁度匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(大約3.0X108cfU/mL)。通過1/30稀釋所述混懸液而準(zhǔn)備30mL接種物，其為107cfo/mL的初始接種物。將22mL接種物放置到本發(fā)明組件的槽中，并且更換栓蓋。將所述裝置放置在35'C大約9°傾斜并且每分鐘3-4次搖動的搖動平臺上，槽與搖動方向平行。目的是產(chǎn)生>105cfb/栓的生物膜；這在不到24小時的培養(yǎng)中獲得。96孔組織培養(yǎng)板用來準(zhǔn)備攻擊板。將20每種檢測抗生素置于所述96孔組織培養(yǎng)板中，并且將180iaL陽離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)加入到所述微量滴定板的每個孔中，以獲得檢測藥物的1:10稀釋物。兩個孔(G12和H12)空著或者包含200pL無菌正常鹽水。G12和H12作為無菌對照。類似地，A12和B12作為生長對照。將具有栓的蓋子安放在攻擊板上，并且在35'C培養(yǎng)24小時。準(zhǔn)備漂洗板，其在無菌的96孔微量滴定板中含有鹽水(每孔200|iL)。還準(zhǔn)備恢復(fù)板，其在另一個96孔微量滴定板中含有CAMHB(每孔200HL)。將栓置于鹽水中。將栓轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，然后高度超聲處理5分鐘，以去除存活的生物膜。然后將栓在35X:培養(yǎng)20-24小時，以允許存活的細(xì)菌生長至混濁。通過視覺檢查攻擊板的孔的混濁度，并且在650nm的板讀數(shù)儀上而確定浮游生物的MIC。確定在攻擊培養(yǎng)過程中每種抗生素對從生物膜上脫落的浮游細(xì)菌的MIC(最小抑制濃度)。MIC定義為抑制生物體生長的抗生素的最小濃度。清澈的孔(A,O.l)表示抑制。通過讀取恢復(fù)板的混濁度而確定每種抗生素的生物膜MBEC(最小生物膜根除濃度)。MBEC定義為抑制生物膜細(xì)菌在恢復(fù)培養(yǎng)基中再生的最小抗生素濃度。清澈的孔(A65。0.1)表示抑制。銅綠假單胞菌MBEC檢測板:GM=慶大霉素，AK=阿米卡星，CFTZ=頭孢他啶，TMS-甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，P+T^哌拉西林/三唑巴坦(濃度以哌拉西林給出)，AZTR-氨曲南，IMP-亞胺培南，TB-妥布霉素，CIPRO二環(huán)丙沙星,GC-生長對照，SC-無菌對照。浮游和生物膜形式的銅綠假單胞菌對單獨(dú)的和組合抗微生物劑的敏感性可以快速(48小時)并且可重現(xiàn)性地確定(表l)。對于每種分離物，抗性模式是獨(dú)特的。以浮游形式時銅綠假單胞菌對多種抗生素敏感，但是作為生物膜時顯著更有抗性。表h抗單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的銅綠假單胞菌分離物的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>特定的抗生素當(dāng)組合時比單一試劑更加有效。本檢測為臨床醫(yī)生提供10種單獨(dú)的和82種在斷點濃度的抗生素組合。對于臨床醫(yī)生，這一檢測可以用于選擇治療在囊性纖維化患者中普遍的生物膜相關(guān)的感染的抗生素。本實驗表明，每種菌株具有獨(dú)特的生物膜敏感性。由于浮游形式的數(shù)據(jù)在分離物之間非常相似，所以這是令人驚訝的。這些結(jié)果清楚地表明，生物體對單獨(dú)的抗生素或抗生素組合具有不同的敏感性，這取決于它們的生長條件(浮游的或生物膜)。實施例9葡萄球菌檢測板組件開發(fā)一種原型葡萄球菌檢測板，以評估可以用于治療葡萄球菌感染的抗生素和抗生素組合。所選擇的抗生素和抗生素組合是基于證明抗生素組合和微生物生物膜之間的效力的初步研究的結(jié)果。所述原型96孔板描述如下葡萄球菌檢測板GM=慶大霉素；CLIN=克林霉素；CFZ=頭孢唑啉;CLOX=氯唑西林；RIF=利福平；VAN=萬古霉素；LIZD=利奈唑胺;AMP=氨芐青霉素舒巴坦合劑(ampicillinsublactamj);Cipro=環(huán)丙沙星;GC=生長對照；SC=無菌對照浮游和生物膜形式的金黃色葡萄球菌對單獨(dú)的和組合抗微生物劑的某些抗生素當(dāng)組合時比作為單獨(dú)的試劑更加有效。本檢測為臨床醫(yī)生提供10種單一的和82種在斷點濃度的抗生素組合。這一實驗表明，每種菌株具有獨(dú)特的生物膜敏感性。由于浮游形式的數(shù)據(jù)在分離物之間非常相似，所以這是令人驚訝的。這些結(jié)果清楚地表明，生物體對單獨(dú)的抗生素或抗生素組合具有不同的敏感性，這取決于它們的生長條件(浮游的或生物膜形式)。實施例1C):比較浮游和生物膜形式的念珠菌屬物種和煙曲霉對抗真菌劑的敏感性可以快速(約48小時之內(nèi))并且可重現(xiàn)性地確定(表2)。對于每種分離物，抗性模式是獨(dú)特的。以浮游形式時金黃色葡萄球菌對多種抗生素和抗生素組合敏感，但是作為生物膜時顯著更有抗性。表2:抗單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的金黃色葡萄球菌分離物的數(shù)目抗生素浮游的生物膜抗生素浮游的生物膜GEN2/CL02GEN4/CLO0GEN2細(xì)P0GEN4扁P1GEN2/CFZ3GEN4/CFZ1GEN2/CLN5GEN4/CLN7GEN2/RIF11GEN4/RIF11G4GEN4/CIP2CUN1/RIF10CLIN2/RIF10CLIN1/CLO2CLIN2/CLO2CUN1/VAN1CUN2A/AN0CUN1/CFZ4CUN2/CFZ2GM24GM43AMP4/210AMP8/410CFZ44CFZ86CIP17CUN1/CIP9CLIN2/CIP10VAN2/CFZ0VAN4/CFZ1VAN2/CLO0VAN4/CLO0VAN2/CIP1VAN4/CIP0VAN2/GM0VAN4/GM0CL11細(xì)4CLI2扁2VAN4/RIF7VAN8/RIF7ClP2/CFZ3CIP4/CFZ7ClP2/RIF4ClP4/RlF3CL02/RIF5CL04/RlF4CIP27VAN25VAN41CLI18CL145CL022CL0420092902290112222222210222110101110111111111111111122222222229822011111111001119o2o11222222222敏感性三種念珠菌的臨床分離物用于本研究，包括一種白念珠菌(a/^oms)和兩種非白念珠菌物種。白念珠菌(C.a/6/Cara)ATCC14053從卡爾加里大學(xué)(UniversityOfCalgaiy)生物科學(xué)系獲得。熱帶念珠菌(C./ro;/cafe)99916和光滑念珠菌(C.g/Wmto)14326從進(jìn)行連續(xù)流動腹膜透析(continuedambulatoryperitonealdialysis,CAPD)的患者的滲析液中獲得。還檢測煙曲霉。使用本發(fā)明的組件，進(jìn)行念珠菌屬和曲霉屬生物膜的生物膜形成和抗微生物劑敏感性的檢測。所述裝置特征在于具有分布在蓋子上的96個栓或凸起的微量滴定板蓋。每個栓為微生物提供附著、定居和形成均一的生物膜的表面。所述栓正好嚙合標(biāo)準(zhǔn)96孔微量滴定板的孔。蓋子與具有用于生長、洗滌和培養(yǎng)真菌的專用槽的基底聯(lián)合使用。從Sabouraud葡聚糖瓊脂(SDA)(BBL微生物系統(tǒng)，科克艾斯維爾，Md)上的24小時培養(yǎng)物挑取念珠菌物種的菌落，并且置于Mueller-Hinton肉湯(MHB)(Difco實驗室，底特律，密歇根州.)，以致混懸液匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)。然后將這一混懸液在MHB中1:30稀釋，并且移取25ml到基底的槽室中。將閉合的組件(具有栓的蓋子放置在基底上)放置在37'C培養(yǎng)箱中設(shè)置成每分鐘搖動板3.5轉(zhuǎn)的HoefferRed搖動器(VWR,科學(xué)(Scientific))上。白念珠菌和熱帶念珠菌進(jìn)行有氧培養(yǎng)，而光滑念珠菌在10%C02中培養(yǎng)。在初步實驗中確定，光滑念珠菌需要10。/。C02氛圍用于形成生物膜。在接種后l，2，3,4,5,6,7,22,23,24和26小時，通過隨機(jī)從所述裝置的蓋子上移下3個栓，而獲得關(guān)于每種分離物的生長曲線。將移下的栓放置在含有200pl鹽水的微量離心管中，并且超聲處理(Aquasonic超聲發(fā)生器,VWR科學(xué)(Scientific)，)5分鐘。進(jìn)行連續(xù)稀釋，并且在SDA上迸行存活的念珠菌物種細(xì)胞的平板計數(shù)。將含有22小時念珠菌物種生物膜的其它栓用在磷酸緩沖的鹽水溶液(PBSS)中的2.5。/。戊二醛進(jìn)行固定，風(fēng)干過夜，并且準(zhǔn)備用于掃描電鏡。在初步研究中確定形成煙曲霉生物膜的最佳條件。首先將栓在1%L-賴氨酸(希格瑪化學(xué)公司,圣路易斯,Mo)中浸泡過夜，然后在層流罩超靜臺內(nèi)風(fēng)干。將50^體積的煙曲霉孢子混懸液添加到在500ml錐形瓶(Erlynmeyerflask)中的250ml胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)(Difco,底特律，密歇根州)中。將所述燒瓶在37t:以150rpm搖動20小時。將在液體肉湯頂部的玻璃上生長的附著菌絲體細(xì)胞用無菌棉簽移下。將這轉(zhuǎn)移到具有平衡到4匸的250ml新鮮TSB的混合器(韋林氏(Waring))中。菌絲體以中等速度在冰上攪拌2分鐘。這重復(fù)3次。然后將煙曲霉混懸液(25ml)轉(zhuǎn)移到生物膜生長裝置的槽中。將包含賴氨酸-處理的栓的蓋子放置在混懸液中，并且將所述裝置轉(zhuǎn)移到上文所述的Red搖動器上。將板在37'C培養(yǎng)25小時，在每個栓上形成明顯的生物膜。對包含24小時曲霉屬生物膜的栓進(jìn)行掃描電鏡檢査。最小生物膜根除濃度檢測生物膜敏感性檢測使用所述組件的具有栓的蓋子，現(xiàn)在其含有在托盤中搖動24小時后形成的生物膜。將蓋子上的每個栓在96孔微量滴定板(Falcon)中的200)il磷酸緩沖的鹽水溶液(PBSS)中輕輕洗滌一次。然后將具有栓的蓋子轉(zhuǎn)移到另一個96孔微量滴定板中，所述板含有在200nlRPMI1640(希格瑪，圣路易斯，Mo)或含有1%DMSO的RPMI1640(參見測試藥物部分)中的2倍稀釋的抗真菌劑。在栓暴露于藥物24小時后，移下具有栓的蓋子，并且在鹽水中輕輕漂洗兩次。然后將具有栓的蓋子放置在含有RPMI1640恢復(fù)培養(yǎng)基的96孔板中。將所述栓在超聲發(fā)生器中超聲處理5分鐘(念珠菌屬物種)或7分鐘(曲霉屬)，以將附著的細(xì)胞去除到恢復(fù)培養(yǎng)基中。將20pl恢復(fù)培養(yǎng)基的整分試樣點滴接種在SDA(念珠菌屬物種)或四碘四氯熒光素瓊脂(煙曲霉)上，以獲得MBEC。所述組件還用來確定最小抑制濃度(MIC)和最小殺真菌濃度(MFC)。在650nm檢測含有抗生素和從生物膜上脫落的浮游細(xì)胞的孔的混濁度，以獲得MIC。將來自每個孔的20ial樣品也點滴接種在Sabouraud葡聚糖瓊脂(念珠菌屬物種)或四碘四氯熒光素瓊脂(煙曲霉)上，以獲得MFC。念珠菌屬物種和煙曲霉的浮游形式敏感性-按照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)國家委員會(NationalCommitteeforClinicallaboratoryStandards,NCCLS)的指導(dǎo)，確定最小抑制濃度(MIC)和最小殺真菌濃度(MFC)。簡言之，在鋪板之前將念珠菌屬物種在-7(TC保存在聚苯乙烯球體上。在開始檢測之前24小時將這些生物體劃線到Sabouraud葡聚糖瓊脂(Microbk)logie)板上。從所述瓊脂板上挑取24小時菌落，并且放置于Muellar-Hinton肉湯(MHB,Microbiologie)中，以致濁度匹配0.5的McFarland標(biāo)準(zhǔn)。然后，將這1:10稀釋在MHB中，以獲得大約1X105-5X10sCFU/ml的混懸液。將5體積的這一混懸液添加到在96孔微量滴定板(Nunclon)的孔中，所述孔中含有連續(xù)稀釋在RPMI1640培養(yǎng)基(希格瑪)中的200nl抗真菌劑。在檢測前煙曲霉以孢子混懸液保存在4t:。將所述孢子混懸液(50稀釋到250mlTSB中，并且將5pl這一混懸液添加到含有上述抗真菌劑稀釋液的每個檢測孔中。然后，將檢測孔與所述抗真菌劑一起在37t:溫育24小時。在溫育后通過在微量滴定板讀數(shù)儀(Softmax，VWR)上在650nm讀取濁度，而獲得念珠菌的MICs。還將20^每個孔的整分試樣鋪板(SDA)，并且在37"C培養(yǎng)24小時后從它們獲得MFCs。關(guān)于曲霉屬M(fèi)FCs這樣確定通過將來自每個孔的100^鋪板到四碘四氯熒光素瓊脂上，然后用無菌玻璃涂布器涂布。在菌落計數(shù)前將接種的生物在25。C保存3天。檢測的藥物。伊曲康唑，氟康唑，和酮康唑從在比利時布魯塞爾的楊森制藥(JanssenPharmaceuticals)獲得。制霉菌素5-氟胞嘧啶，灰黃霉素，兩性霉素B和多粘菌素B從希格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，Mo獲得。5-氟胞嘧啶，多粘菌素B硫酸鹽和制霉菌素溶解在雙蒸水中到濃度10.24mg/ml，并且在檢測孔在1024昭/ml-0.125嗎/ml范圍內(nèi)稀釋在RPMI中。兩性霉素B溶解在純二甲亞砜(dimethylsulfoxone)(DMSO)中至51.2mg/ml的濃度最大值。將這連續(xù)稀釋，以獲得在檢測孔中在RPMI1640(希格瑪，圣路易斯，Mo)和l。/。DMSO中的512/ig/ml到0.016嗎/ml的兩性霉素B。氟康唑，伊曲康唑，酮康唑和灰黃霉素溶解在純DMSO中到濃度102.4mg/ml，并且進(jìn)一步稀釋，以獲得在檢測孔在RPMI1640和1。/。DMSO中的1024嗎/ml到0.032昭/ml藥物的范圍。為了確定1%DMSO對真菌細(xì)胞的作用，含有在RPMI1640中1%DMSO而沒有藥物的對照孔與所有含有DMSO的檢測孔平行進(jìn)行。另外，所有的檢測都包括不進(jìn)行接種的無菌對照孔，以及不含抗真菌劑的生長對照孔。生物膜在裝置表面上的生長每個念珠菌物種在所述裝置的每個柃上形成生物膜，以在接種后22小時之后達(dá)到105-106CFU/栓。光滑念珠菌是最苛求菌，需要10。/。CO2來形成生物膜。當(dāng)有氧培養(yǎng)時，20小時之后，光滑念珠菌只生長大約5X103CFU/栓，而在10%C02中它生長到平均4.1X104CFU/栓。曲霉屬生物膜似乎更緊密地附著到栓上。在24小時培養(yǎng)之后，曲霉屬生長至l()SCFU/栓(數(shù)據(jù)未顯示)。對于念珠菌的所有物種，在MBEC裝置的栓上形成的生物膜都是相似的。念珠菌細(xì)胞均一地包被整個栓，并且包入大量外泌多糖基質(zhì)。念珠菌細(xì)胞在某些區(qū)域生長為伸長細(xì)胞的凸起的簇。曲霉屬生物膜由在24小時后云集在整個栓上的規(guī)律的分生孢子梗組成。外泌多糖附著到栓表面，并且包圍每個曲霉屬分生孢子梗。抗真菌敏感性抑制浮游的細(xì)胞(MIC)、殺死浮游的細(xì)胞(MFC)和殺死生物膜真菌(MBEC)所需要的抗生素濃度總結(jié)在表3中。從NCCLS方法和從在所述裝置栓上形成的生物膜釋放的浮游細(xì)胞而獲得的MIC和MFC值類似或者相同。從所述裝置獲得的MIC和MFC是高度可重現(xiàn)性的。真菌生物膜普遍比浮游細(xì)胞更難消除(表3)。對于所有檢測的念珠菌物種，獲得相似的結(jié)果。一般地，MBEC超過MIC或MFC幾個數(shù)量級。盡管兩性霉素B(AmphoteracinB)、制霉菌素、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑都有效殺死浮游的念珠菌細(xì)胞，但是只有制霉菌素有效抗生長為生物膜的相同念珠菌。例如，兩性霉素B，一種多烯抗真菌藥，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用于抗白念珠菌的浮游培養(yǎng)物時，其具有0.09嗎/ml的平均MIC和0.02嗎/ml的平均MFC。相反，殺死白念珠菌的生物膜細(xì)胞需要平均12pg/ml的同一種藥物?；尹S霉素和多粘菌素B對浮游的和固著的念珠菌無效。由于曲霉屬細(xì)胞在96孔微量滴定板中成團(tuán)，這使得通過板讀數(shù)儀進(jìn)行分析變得不準(zhǔn)確，所以不能獲得煙曲霉的MIC。MFC值(通過將100pl的孔內(nèi)容物點滴接種到四碘四氯熒光素瓊脂上而獲得)表明浮游曲霉屬對兩性霉素B、伊曲康唑、酮康唑和制霉菌素的敏感性(表1)。相反，即使在最高的檢測濃度，也沒有一種抗真菌劑有效抗煙曲霉生物膜。即使在極高的濃度，唑類藥物抑制，但不殺死生物膜細(xì)胞。在藥物治療之后，能生存的細(xì)胞的存活不是有利結(jié)果，并且可能助于產(chǎn)生念珠菌的唑類-抗性菌株(8)?？梢酝茰y，這些藥物對消除生物膜細(xì)胞的失敗在于它們必須被細(xì)胞主動吸收。減小的藥物攝取率或這些生物膜生物體對外泌多糖的抑制可能防止藥物到達(dá)它的靶點酶。小于或等于8^g/ml的抗念珠菌物種的氟康唑MIC表明所述物種對所述藥物敏感(16)。按照這些標(biāo)準(zhǔn)，檢測的白念珠菌和熱帶念珠菌菌株將歸類為對氟康唑敏感。然而，對于氟康唑和伊曲康唑的MBEC值(>1024嗎/ml)大大超過這兩種分離物的64pg/ml的斷點，這表明所述生物膜細(xì)胞是抗性的。盡管氟康唑和伊曲康唑只是已經(jīng)確定這些試驗性斷點的藥物，但是對于酮康唑和5-氟胞嘧啶觀察到相同的趨勢。這可以解釋為什么唑類通常對治療某些慢性念珠菌病和念珠菌相關(guān)的移植裝置的病例無效(4,5,12)。多烯，制霉菌素和兩性霉素B，是消除念珠菌生物膜的最有效的試劑。然而，在臨床情形中兩性霉素B16pg/ml的MBEC可能達(dá)不到——允許的人血清峰值濃度為2嗎/ml。所述多烯在真菌的血漿膜上作用而不需要吸收到細(xì)胞中的能力可以解釋它們在所檢測的抗生物膜細(xì)胞的藥物中相關(guān)的有效性。一旦提供蛋白表面，諸如L-賴氨酸，曲霉屬就容易在栓表面形成規(guī)律的生物膜。曲霉屬生物膜的形態(tài)特征與在組織內(nèi)和在醫(yī)學(xué)裝置上存在的生物膜沒有不同。盡管所述生物膜很快形成，但是它仍然抵抗所有檢測的試劑。如同念珠菌生物膜，似乎生長速率不影響抗性。在曲霉屬生物膜中觀察到大量的外泌多糖，其可能對抗性很重要。對于侵入性肺部、竇和大腦曲霉病使用兩性霉素B治療的患者的初步死亡率報道分別為86%，66%和99%。只有54%的病例對14天的治療表現(xiàn)出任何反應(yīng)。盡管多烯對曲霉屬表現(xiàn)出體外功效，但是它們主要影響侵入性曲霉病的治療。MBEC檢測的結(jié)果將預(yù)測這種治療失敗。盡管迄今為止還沒有消除煙曲霉的備選的化學(xué)治療劑，但是所述組件可以用于篩選可能有潛力開發(fā)成有前途的治療的試劑。應(yīng)該確定藥物的體外成功不能外推到治療方法的成功，但是藥物的體外失敗應(yīng)該預(yù)測治療的失敗。從本研究中，預(yù)測唑類，5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、和多粘菌素B在治療生物膜念珠菌感染中不成功，而多烯可能有效或可能無效。從本研究清楚的是念珠菌和曲霉屬物種附著到塑料上，并且生物膜的形成趨向于允許這些生物體耐受暴露于比在分批培養(yǎng)中生長的相同物種高出許多倍的濃度的抗微生物劑中。當(dāng)它們能夠以生物膜形式生長時，特征性描述抵抗分批培養(yǎng)的生物體的抗真菌劑不再是令人滿意的。為了準(zhǔn)確評估特別的試劑清除生物膜生物體感染的能力，由于發(fā)現(xiàn)它們將在宿主中或天然存在，即，表現(xiàn)出深刻改變的生理并且包在保護(hù)性外泌多糖基質(zhì)中，所以敏感性檢測應(yīng)該在細(xì)胞上進(jìn)行。實施例ll如上文所述，本發(fā)明的裝置可以負(fù)載一種或多種抗生物膜試劑?？赡艿目股锬ぴ噭┑牟煌暾痛硇粤斜戆?，但不限于抗生素，包括但不限于下述種類和在種類中的成員氨基糖苷類，如慶大霉素，妥布霉素，奈替米星，阿米卡星，卡那霉素，鏈霉素，新霉素，喹諾酮類/氟喹諾酮類，萘啶酸，西諾沙星，諾氟沙星，環(huán)丙沙星，甲氟哌酸，氧氟沙星，依諾沙星,氟羅沙星，和左氧氟沙星；抗假單胞菌藥，如羧芐西林，卡茚西林，替卡西林，阿洛西林，美洛西林，哌拉西林頭孢菌素類，頭孢噻吩，頭孢匹林(Cephaprin)，頭孢氨芐，頭孢拉定，頭孢羥氨芐，頭孢唑林頭孢孟多，頭孢西丁，頭孢克洛，頭孢呋辛，頭孢替坦，頭孢雷特，頭孢呋辛醋氧乙酯，頭孢尼西頭孢噻肟，拉氧頭孢，頭孢唑肟，頭孢曲松，頭孢哌酮，頭孢他啶(Cftazidime),其它頭孢菌素類，如頭孢噻啶，和頭孢磺啶；其它卩-內(nèi)酰胺；抗生素，如亞胺培南，氨曲南p-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸，力百汀，舒巴坦；磺胺類藥，如磺胺，磺胺甲噁唑，磺胺醋酰，磺胺嘧啶，磺胺異噁唑，磺胺西汀，磺胺多辛，磺胺米隆，對-氨基苯甲酸，甲氧芐啶-磺胺甲噁唑；尿道抗菌藥，如烏洛托品，呋喃妥因，非那吡啶和其它萘基吡啶藥；青霉素類藥，如青霉素(PenicillinG)和青霉素V,青霉素酶抗性甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，氯唑西林，用于革蘭氏-陰性菌的雙氯西林青霉素/氨基青霉素藥氨芐青霉素(多鏈絲霉素)，阿莫西林，環(huán)青霉素，巴氨西林；四環(huán)素類，如四環(huán)素，氯四環(huán)素，地美環(huán)素，美他環(huán)素，多西環(huán)素,二甲胺四環(huán)素；其它抗生素，如氯霉素(Chlormycetin),紅霉素，林可霉素，克林霉素，大觀霉素，多粘菌素B(多粘菌素E),萬古霉素，桿菌肽；結(jié)核病藥，如異煙肼，利福平，乙胺丁醇，吡嗪酰胺，Ethinoamide,對氨水楊酸，環(huán)絲氨酸；抗真菌劑，如兩性霉素B，環(huán)胞菌素，氟胞嘧啶咪唑類和三唑類酮康唑，咪康唑，伊曲康唑，氟康唑，灰黃霉素；局部抗真菌劑，如克霉唑，益康唑，咪康唑，特康唑，布康唑，奧昔康唑，硫康唑，環(huán)吡酮胺，鹵普羅近，托萘酯，萘替芬，多烯，兩性霉素B，那他霉素實施例12使用96-栓蓋和槽的高通量篩選(HTP)檢測提供的方法是一個怎樣使用本發(fā)明的裝置和方法評估化合物抗生物膜和浮游細(xì)菌的抗微生物活性的實例。材料列表無菌蓋和槽(l)無菌96孔組織培養(yǎng)板(3)平臺搖動器(傾斜角度大約9。)超聲發(fā)生器針頭(needlenose)鑷子(任選)方法描述形成生物膜1.使用來自新鮮過夜劃線的平板的單一菌落，制備所述生物體的混懸液，以致在TSB或其它適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中濁度匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(大約3.0Xl()Scfu/mL)。通過將所述混懸液l/30稀釋，而制備30mL接種物，初始接種物為10、fo/mL?？燎笊矬w可能需要補(bǔ)充的培養(yǎng)基以在肉湯中生長。2.打開無菌生長組件。將22mL接種物加入到槽中，并且更換栓蓋。將所述裝置放置在35'C大約9。傾斜并且每分鐘3-4次搖動的搖動平臺上，槽與搖動方向平行。目的是產(chǎn)生>105池/栓的生物膜，通常24小時的培養(yǎng)是足夠的。注意由于傾斜角太大或者平臺搖動不對稱，所以一些搖動器不適合所述檢測。操作者應(yīng)該檢査以確定搖動器滿足這一檢測必要的要求。3.稀釋并且點滴接種接種物樣品，以檢査接種物數(shù)目(應(yīng)該包含大約lXl(^cfu/mL)，并且檢測在所述培養(yǎng)物中的污染物。4.無菌對照(任選)。使用酒精灼燒的鑷子，折斷栓A1、Bl、Cl和Dl，以致不再存在細(xì)菌能夠附著的凸起。這些位置將作為本檢測的無菌對照。第2天抗生素儲液抗生素儲液應(yīng)該提前制備，并且保存在-7(TC。去離子水或適當(dāng)?shù)娜軇┯脕碇苽?120pg/ml活性劑的儲液。參考NCCLS文獻(xiàn)M100-S8關(guān)于應(yīng)該使用哪些溶劑和稀釋劑的詳細(xì)內(nèi)容。以250^L的整分試樣(足夠用于2個攻擊板)保存儲液。在-7(TC大部分抗生素的儲液穩(wěn)定最少6個月。第2天制備抗生素攻擊板1.使用96孔組織培養(yǎng)板來準(zhǔn)備攻擊板。指定要在本檢測中檢測的抗生素，并且將它們分配在A-H排。這一板設(shè)置將允許以10種濃度的8種不同的抗生素進(jìn)行檢測。注意MBEC板適合96孔板(例如Nunc)，但是不是所有96孔板都兼容。2.制備1024昭/mL的工作溶液，這通過將2005120嗎/mL的儲液加入到800^L陽離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)中進(jìn)行，其提供用于兩排的足夠的工作溶液。工作溶液必須在它們制備的同一天使用。3.攻擊板可以怎樣制備的一個實例如下將200CAMHB加入到A1，Bl,C1和D1孔中。這些將作為無菌對照。將200nLCAMHB加入到弁2列A-H孔中。這些將作為生長對照。將IOOCAMHB加入到第4-12列的所有孔中。這些將用來稀釋抗生素的工作濃度。將200^L指定抗生素的工作溶液加入到第3列的孔中。將100pL抗生素的工作溶液加入到第4和5列的孔中。使用8通道移液器準(zhǔn)備稀釋液，在列之間更換管尖#5孔混合并且轉(zhuǎn)移100^iU,6L;#6L:混合并且轉(zhuǎn)移IOOpU,7L，繼續(xù)直至,12孔;#12孔混合并且棄掉IOOpL。將100mLCAMHB加入到第5-12列的孔中，以使得所有孔的體積達(dá)到200pL。這種稀釋方案將導(dǎo)致在第3列中1024pg/mL的抗生素濃度減少到第12列中的2pg/mL。這些濃度可以相應(yīng)調(diào)整，以適合研究的需要。生物膜的抗生素攻擊1.準(zhǔn)備0.9%鹽水的漂洗板(每孔20(HiL)。通過將栓放入漂洗板中大約1分鐘，而漂洗來自栓的浮游的細(xì)菌。2.生物膜接種物檢査(任選)使用灼燒的鑷子，移下栓E1、Fl、Gl禾nHl，將每個栓放置在稀釋板的200(iL鹽水中。將樣品栓E1-H1高度超聲處理5分鐘，以使生物膜細(xì)菌移下，然后連續(xù)稀釋至1(T7，并且點滴接種到TSA(或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基)上，并且培養(yǎng)過夜以確定cfW栓。3.將具有剩余的栓的蓋子轉(zhuǎn)移到攻擊板上，并且在35'C培養(yǎng)24小時?；謴?fù)存活的生物膜1.在無菌96孔微量滴定板中準(zhǔn)備鹽水漂洗板(每孔200(iL)。2.在另一個96孔微量滴定板中準(zhǔn)備CAMHB恢復(fù)板(每孔200pL)。3.將栓在鹽水中漂洗大約l分鐘。不要丟棄攻擊板。將栓轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，然后高度超聲處理5分鐘，以移下存活的生物膜。丟棄栓蓋，并且蓋上恢復(fù)板。在35。C培養(yǎng)20-24小時，以允許存活的細(xì)菌生長至混濁。如果需要關(guān)于每個孔的存活cfu/栓的數(shù)據(jù)，可以在超聲步驟后立即從恢復(fù)板的每個孔取出50(iL，并且轉(zhuǎn)移到稀釋板，在鹽水中連續(xù)稀釋，并且點滴接種(100-107)到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。確定浮游生物的MIC1.檢查攻擊板的孔的混濁度(視覺上)或者在650nm板讀數(shù)儀上檢査。2.確定在攻擊培養(yǎng)過程中每種抗生素對從生物膜上釋放出來的浮游細(xì)菌的MIC。MIC定義為抑制生物體生長的最小抗生素濃度。清澈的孔(A65(X0.1)表明抑制。3.記錄每種抗生素的MIC值。確定生物膜MBEC1.通過讀取恢復(fù)板的濁度而確定每種抗生素的MBEC。MBEC定義為抑制生物膜細(xì)菌在恢復(fù)培養(yǎng)基中再生的最小抗生素濃度。清澈的孔(A650O.l)表示抑制。2.記錄每種抗生素的MBEC值。實施例13使用96孔微量滴定板檢測生理和遺傳(P&G)使用96孔微量滴定板，可以形成不同生物體的多種生物膜，或者同種生物體的等價生物膜。這種方法可以用于研究生物膜形成或抗微生物劑檢測中的變量。應(yīng)該注意，這種檢測可以用來篩選生物膜形式的遺傳突變體，用來比較不同分離物或不同物種的細(xì)菌的MBEC值，用來比較生長為生物膜的不同分離物中的基因表達(dá)，或者用于需要不同分離物的生物膜的許多其它形式中。下文所述的方法描述用于檢測生長為生物膜的多種生物體針對單一抗微生物劑的測定。材料列表無菌蓋子和托盤無菌96孔組織培養(yǎng)板(3)旋轉(zhuǎn)搖動器超聲發(fā)生器針頭鑷子(任選)方法描述第l天形成生物膜1.使用來自新鮮過夜劃線的平板的單一菌落，準(zhǔn)備每種生物體(最多12種/板)的混懸液，以致在TSB或其它適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中濁度匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(大約3.0X108cfii/mL)。2.1/30稀釋以獲得10、fb/mL的接種物。在指定的列，每測試孔放入150pL每種生物體的起始接種物。列可以設(shè)置成最多檢測8種分離物，l個孔作為生長對照和ll種抗生素濃度，或者12種分離物，l個孔作為生長對照，禾口7種抗生素濃度(如果需要，l列可以指定為無菌對照)。3.打開無菌組件。將所述蓋子放置在含有細(xì)菌接種物的96孔微量滴定板上。將所述裝置放置在35。C大約150rpm的旋轉(zhuǎn)平臺上。一些物種可能需要更低的培養(yǎng)溫度或增加的C02。目的是產(chǎn)生〉10、fli/栓的生物膜；通常24小時的培養(yǎng)是足夠的。4.稀釋并且點滴接種接種物樣品，以檢查接種物數(shù)目(應(yīng)該包含大約lX10、fo/mL)，并且檢測在所述培養(yǎng)物中的污染物。第2天抗生素儲液抗生素儲液應(yīng)該提前制備，并且保存在-7(TC。去離子水或適當(dāng)?shù)娜軇┯脕碇苽?120g/ml活性劑的儲液。參考NCCLS文獻(xiàn)M100-S8關(guān)于應(yīng)該使用哪些溶劑和稀釋劑的詳細(xì)內(nèi)容。在-7CTC大部分抗生素的儲液穩(wěn)定最少6個月。第2天準(zhǔn)備抗生素攻擊板1.使用96孔組織培養(yǎng)板來準(zhǔn)備攻擊板。注意所述板適合96孔板(例如Nunc)，但是不是所有96孔板都兼容。2.將在陽離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)中制備的每種檢測抗生素濃度置于在需要的范圍內(nèi)2倍稀釋的抗生素的微量滴定板的一排中(每孔200iaL總體積)。第2天生物膜的抗生素攻擊1.準(zhǔn)備0.9%鹽水的漂洗板(每孔200^L)。通過將栓放入漂洗板中大約1分鐘，而漂洗來自栓的浮游的細(xì)菌。2.將所述栓蓋轉(zhuǎn)移到攻擊板上，并且在35。C培養(yǎng)24小時。第3天恢復(fù)存活的生物膜1.在無菌96孔微量滴定板中準(zhǔn)備鹽水漂洗板(每孔200pL)。2.在另一個96孔微量滴定板中準(zhǔn)備CAMHB恢復(fù)板(每孔200pL)。3.將栓在鹽水中漂洗大約l分鐘。不要丟棄攻擊板。將栓轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，然后高度超聲處理5分鐘，以移下存活的生物膜。丟棄栓蓋，并且蓋上恢復(fù)板。在35。C培養(yǎng)20-24小時，以允許存活的細(xì)菌生長至混濁。注意如果需要關(guān)于每個孔的存活cfti/栓的數(shù)據(jù)，可以在超聲處理步驟后立即從恢復(fù)板的每個孔取出50pL，并且轉(zhuǎn)移到稀釋板，在鹽水中連續(xù)稀釋，并且點滴接種(100-107)到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。第3天確定浮游生物的MIC1.檢查攻擊板的孔的混濁度(視覺上)或者在650nm板讀數(shù)儀上檢查。2.確定在攻擊培養(yǎng)過程中每種抗生素對從生物膜上釋放出來的浮游細(xì)菌的MIC(最小抑制濃度)。MIC定義為抑制生物體生長的最小抗生素濃度。清澈的孔(A65(X0.1)表明抑制。3.記錄每種抗生素的MIC值。第4天確定生物膜MBEC1.通過讀取恢復(fù)板的濁度而確定每種抗生素的MBEC(最小生物膜消除濃度)。MBEC定義為抑制生物膜細(xì)菌在恢復(fù)培養(yǎng)基中再生的最小抗生素濃度。清澈的孔(A650O.l)表示抑制。2.記錄每種抗生素的MBEC值。盡管已經(jīng)描述了一些優(yōu)選的實施方案，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明范圍下可以進(jìn)行各種改變和改進(jìn)。在前述說明書中的術(shù)語和表述用于本文作為描述的術(shù)語，并且沒有限制，并且在應(yīng)用所述術(shù)語和表述時沒有排除所示和所述的特征的等價物或其部分的目的，它被視作僅由下述權(quán)利要求定義和限定的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種處理一種或多種生物膜的方法，其包括a)生長生物膜，其中所述生長包括使生物膜經(jīng)受剪切力；b)將所述生長的生物膜在攻擊板上暴露于一種或多種抗生物膜試劑；c)在恢復(fù)板上移下并且中和所述暴露的生物膜；d)通過評估任何生物膜在所述攻擊板上的生長而確定MIC值；e)通過評估任何生物膜在所述恢復(fù)板上的生長而確定MBEC值；和f)通過評估所述恢復(fù)板可存活細(xì)胞計數(shù)而確定MBC值。2.—種處理一種或多種生物膜的方法，其包括選擇抗生物膜試劑的有效組合，其中有效的組合基本上由兩種或多種相同或不同劑量的活性劑組成；將所述生物膜與抗生物膜試劑的組合接觸；并且對于每種組合，確定MIC、MBEC、MBC、或它們的組合。3.權(quán)利要求l的方法，其中確定MIC、MBEC禾nMBC值。4.權(quán)利要求1的方法，其還包括在接觸步驟之后，中和所述抗生物膜試劑。5.權(quán)利要求3的方法，其還包括分解并且收集所述生物膜。6.—種用于檢測固著微生物的MBEC檢測，其包括在預(yù)選的第一板上形成生物膜；移下所述生物膜并且將所述生物膜放置在第二板上；將所述生物膜暴露于至少一種活性劑；和確定所述活性劑抗所述生物膜的效力。7.—種用于確定生物膜的MIC、MBEC和MBC值和確定適合處理所述生物膜的組合物的處理方法，其包括1)提供具有第一基底和第一蓋子的第一組件，所述第一蓋子具有從其上延伸出來的凸起，所述第一組件設(shè)置成在一個或多個凸起上生長一種或多種生物膜；2)提供包含第二基底和所述第一蓋子的第二組件，所述第二組件設(shè)置成將在所述凸起上的生物膜暴露于一種或多種抗生物膜試劑；3)提供包括第三基底和所述第一蓋子的第三組件，所述第三組件設(shè)置成漂洗在所述凸起上的任何生物膜；和4)包括第四基底和所述第一蓋子的第四組件，所述第四組件設(shè)置成并且適于將所述生物膜從所述凸起上移下。8.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載營養(yǎng)組合物的第一基底的第一組件。9.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載一種或多種生物膜試劑的第二基底的第二組件。10.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載漂洗組合物的第三基底的第三組件。11.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載恢復(fù)組合物的第四基底的第四組件。全文摘要本發(fā)明是一種可以用于選擇具有抗生長為生物膜的微生物的功效的抗生素組合的診斷板。所述板允許在多個凸起上生長生物膜，并且隨后將在所述板的所有凸起上的生物膜同時用獨(dú)立的濃度和抗生物膜試劑的組合進(jìn)行攻擊。當(dāng)與它們以浮游狀態(tài)生長時相比較，所述浮游狀態(tài)通常用于確定它們的抗生素敏感水平，當(dāng)它們生長為生物膜時，微生物對抗生素的抗性更高。在抗生物膜試劑攻擊中脫離生物膜的微生物的生長確定最小抑制濃度(MIC)，其與浮游狀態(tài)的微生物的敏感性相關(guān)。在隨后的恢復(fù)步驟中來自生物膜的任何存活的微生物的生長確定最小生物膜根除濃度(MBEC)，其與生長為生物膜的微生物的敏感性相關(guān)。在恢復(fù)步驟中計數(shù)存活的微生物確定最小殺生物濃度(MBC)。文檔編號C12Q1/06GK101283104SQ200680030645公開日2008年10月8日申請日期2006年7月24日優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日發(fā)明者奧瓦爾·切里,默爾·E·奧爾森申請人:創(chuàng)新技術(shù)公司