專利名稱：：5-氟尿嘧啶耐受菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及下述菌的制備方法，所述菌可以用作實(shí)體腫瘤治療藥物，能夠在厭氧環(huán)境下在腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(EC3.5.4.1;以下稱CD)，并且至少具有對(duì)抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶(以下稱為5-FU)的耐受能力的表達(dá)CD的5-FU耐受菌。此外，本發(fā)明涉及5-FU耐受菌、含有該耐受菌的藥物組合物、以及含有該耐受菌的實(shí)體腫瘤治療藥物。
背景技術(shù)：
：CD是使胞嘧啶脫氨化成為尿嘧啶的酶(例如，參見非專利文獻(xiàn)1)。CD是在微生物的代謝中起著重要作用的酶，能夠從多種不同的微生物中分離得到，不過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通常不產(chǎn)生這種CD(例如，參見非專利文獻(xiàn)2)。產(chǎn)生CD的多種細(xì)菌以及真菌將5-氟胞嘧啶(以下稱為5-FC)轉(zhuǎn)換成對(duì)細(xì)胞有致死性的具有極強(qiáng)毒性的的代謝物5-FU。5-FU導(dǎo)致生成異常的RNA以及抑制DM合成，5-FC的抗真菌作用正是通過這種5-FU的導(dǎo)致異常RNA生成和抑制DNA合成的作用。即，5-FC通過胞嘧咬透性酶而被4聶取到真菌細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)5-FC經(jīng)由CD直接轉(zhuǎn)換成5-FU。細(xì)胞內(nèi)的5-FU由5-FUMP在UMP-焦磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)換成5-FUDP。此外，其在先的磷酸化途徑分成兩條，一條生成5-FUTP，另一條生成5-FdUMP。此處，5-FUTP代替UTP,通過被摻入到RM中，生成異常的RNA,抑制正常的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果抑制真菌的生長(zhǎng)。另外，5-FdUMP作為胸腺嘧啶酸合成酶的有力的抑制劑而發(fā)揮作用，抑制DNA合成、核分裂，展示出殺菌效果。不過，因?yàn)檎５牟溉閯?dòng)物細(xì)胞不表達(dá)有意義量的CD,所以不能將5-FC脫氨為有毒的代謝物5-FU,所以5-FC即使達(dá)到表現(xiàn)出強(qiáng)的抗菌活性濃度也對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒。另一方面，5-FU對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，作為抗癌制劑而廣泛使用。從大腸桿菌(Escherichiacoli)和酵母菌(Saccharomycescerevisiae)分離、克隆出CD基因(例如參見非專利文獻(xiàn)3、4)。并且，多個(gè)研究人員通過將該CD基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞，在體外試驗(yàn)中，這些細(xì)胞表示出對(duì)5-FC的選擇性敏感度降低(例如參見非專利文獻(xiàn)3、5)。此外，使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而將CD基因?qū)肫渲械哪[瘤細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出能夠通過5-FC的動(dòng)物的全身治療而被排除(例如參見非專利文獻(xiàn)6~8)。此外，復(fù)制缺陷的腺病毒載體(例如參見非專利文獻(xiàn)9)以及陽(yáng)離子性脂質(zhì)體(例如參見非專利文獻(xiàn)IO)或者分別向人大腸癌細(xì)胞以及小鼠的巨大細(xì)胞肺癌中導(dǎo)入CD基因而加以利用。通過在這些肺瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)而賦與對(duì)5-FC的敏感度。已知在念珠菌(Candida)等真菌感染癥中使用的5-FC容易獲得耐受性(例如參見非專利文獻(xiàn)11)。因?yàn)閷?duì)5-FC的耐受性是由于與向5-FU轉(zhuǎn)換、向RNA摻入等相關(guān)的任何的酶的喪失或者突變引起的，因此認(rèn)為理論上有多種耐受性機(jī)制。在臨床上頻率最高的是白色念珠菌中的伴隨UMP-焦磷酸化酶的喪失、或者活性降低而獲得的耐受性，已經(jīng)明確5-FC敏感度與UMP-焦磷酸化酶酶活性相關(guān)。據(jù)報(bào)道在細(xì)胞核相為一倍體的Candidaglabrata中，有由于胞嘧啶透性酶或CD的缺陷而導(dǎo)致產(chǎn)生的耐受菌抹。另一方面，長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)是革蘭氏陽(yáng)性厭氧性細(xì)菌，其基因組中的GC含量高(例如，參見非專利文獻(xiàn)12)。該長(zhǎng)雙歧桿菌是非病原性的，在人或者其他動(dòng)物的大腸中構(gòu)成正常的微生物群體的的大部分(例如非專利文獻(xiàn)13)。具有提高免疫反應(yīng)(例如參見非專利文獻(xiàn)14參見)，抑制癌癥的發(fā)生的效果(例如參見非專利文獻(xiàn)15)、保護(hù)宿主免受病毒感染(例如，參見非專利文獻(xiàn)16、17)、可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)(例如參見非專利文獻(xiàn)18)等，具有促進(jìn)宿主健康的特性。雙歧桿菌種在世界范圍內(nèi)廣泛的的發(fā)酵乳制品的制備中被使用。進(jìn)而，希望雙歧桿菌的質(zhì)粒應(yīng)用于益生菌(probiotics)載體、感染性患者的經(jīng)口疫苗的栽體。例如，已知包含下述步驟的轉(zhuǎn)化體制備方法，其特征在于，該方法包括利用來(lái)自雙歧桿菌的質(zhì)粒和來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒制備能夠在雙歧桿菌和大腸桿菌中互相復(fù)制的穿梭載體的步驟、和將上述穿梭栽體與編碼目的蛋白質(zhì)的目的基因連接來(lái)制備重組載體的步驟、作為用于轉(zhuǎn)化上述制備的重組載體的宿主細(xì)胞使用在制備上述的穿梭載體中使用的雙歧桿菌(例如、參見專利文獻(xiàn)1)。根據(jù)最近的報(bào)告已明確在全身給藥后，長(zhǎng)雙歧桿菌積累于低氧的實(shí)體腫瘤中(例如，參見非專利文獻(xiàn)19、20)，帶有與長(zhǎng)雙歧桿菌hup啟動(dòng)子相融合的大腸桿菌codA的重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD在微生物中表達(dá)CD(例如，參見專利文獻(xiàn)2以及非專利文獻(xiàn)21、22)。由此證明了重組長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)于酶-藥物前體療法有效。在上述重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD的構(gòu)建中使用的pBLES100是由長(zhǎng)雙歧桿菌BK51的pTB6和大腸桿菌的pBR322構(gòu)建而成的穿梭載體。所涉及的穿梭載體pBLES100以2.2xl04個(gè)轉(zhuǎn)化子/網(wǎng)DNA有效地轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌，在該細(xì)胞中于結(jié)構(gòu)和胞質(zhì)分離方面趨于穩(wěn)定(例如，參見非專利文獻(xiàn)23)。可是，由于在轉(zhuǎn)染時(shí)，存在著帶有未修飾DM的質(zhì)粒在微生物中被限制性酶切斷的可能性，因此在外源基因的克隆中需要更高的轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明者等人提供了與pBLES100相比較，能夠以超過100倍的高效率轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒pAVOOl以及pBRASTA101(例如參見非專利文獻(xiàn)24)。如上所述，5-FU對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，作為抗癌藥物而廣泛使用。不過，將5-FU直接施用給患者時(shí)，為了避免給患者帶來(lái)副作用，例如使之在血液中的濃度為ljig/ml左右以下進(jìn)行施用，在血中的濃度超過lpg/ml的時(shí)間僅僅為1小時(shí)左右。這樣的情況在以往的方法中，很難使5-FU的抗癌作用充分發(fā)揮。在這樣的情況下，努力尋求用高濃度的5-FU持續(xù)處理腫瘤，從而克服5-FU的副作用問題。非專利文獻(xiàn)2:非專利文獻(xiàn)3:非專利文獻(xiàn)4:非專利文獻(xiàn)5:非專利文獻(xiàn)6:非專利文獻(xiàn)7:非專利文獻(xiàn)8:非專利文獻(xiàn)9:專利文獻(xiàn)l:特表2004-519236號(hào)/>才艮專利文獻(xiàn)2:特開2002-97144號(hào)/>才艮非專利文獻(xiàn)l:O，Donovanetal.,Bact.Rev.34:278(1970)Nishiyamaetal.，CancerRes.45:1753(1985)Austinetal.,Pharmacol.43:380(1992)Andersonetal.，Arch.Microbiol.152:115(1989)Mullenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.翻9:33(1992)Huberetal.，CancerRes.53:4619(1993)Mullenetal.，CancerRes.54:1503(1994)Huberetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8302(1994)Hirschowitzetal.，HumanGeneTher.6:1055(1995)非專利文獻(xiàn)10:Davisetal.，Proc.AACRAbstractNo.2355，p345(1996)非專利文獻(xiàn)ll:Clin.Microbiol.Rev.11:382-402.1998非專利文獻(xiàn)12:Scardovi,Bergey，sManualofSystematicBacteriologyvol2,eds.Sneathetal.，pp.1418-1434(1986)非專利文獻(xiàn)13:Mitsuoka，ElsevierAppliedScience,pp69-114(1992)非專利文獻(xiàn)14:Yasuietal.J.DairySci.，74，1187-1195(1991)Reddyetal.,CancerRes.，53，3914-3918(1993)Duffyetal.，Pediatr.Res.，35，690-695(1994)Saaverdraetal.，Lancet.，344，1046-1049(1994)Ibrahimetal.，J.FoodProt.，56,713—715(1993)Yazawaetal.CancerGeneTher.，7，269-274(2000)Yazawaetal.BreastCancerRes.Treat.，66,165-170非專利文獻(xiàn)15:非專利文獻(xiàn)16:非專利文獻(xiàn)17:非專利文獻(xiàn)18:非專利文獻(xiàn)19:非專利文獻(xiàn)20:(2001)非專利文獻(xiàn)21:2362-2366(2002)非專利文獻(xiàn)22:200-203(2002)非專利文獻(xiàn)23:Nakamuraetal.，Biosci.BiotechnoLBiochem.，66,Fujimorietal.，Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.，5，Matsumuraetal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，121H212(1997)非專利文獻(xiàn)24:Tanakaetal.,BiosciBiotechnolBiochem.;69(2):422-425(2005，F(xiàn)eb)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問題使用了CD/5-FC的酶-前藥療法是在動(dòng)物試驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的治療方法。如果所涉及的酶-前藥療法中的導(dǎo)入了CD基因的細(xì)胞(菌)的5-FU耐受性提高的話，因?yàn)椴淮嬖谝驗(yàn)?-FU導(dǎo)致的死亡，所以期待提高導(dǎo)入CD基因的細(xì)胞(菌)的存活，顯著地提高使用了CD/5-FC的酶-前藥療法的治療效果。本發(fā)明的課題是提供制備可用作這樣的酶-前藥療法的治療藥物的、能夠表達(dá)CD且至少對(duì)抗腫瘤活性有效濃度的5-FU具有耐受能力的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的方法。此外，本發(fā)明的課題是提供用高濃度的5-FU持續(xù)處理腫瘤，可以克服5-FU的副作用問題的5-FU耐受菌、含有該耐受菌的藥物組合物以及含有該耐受菌的實(shí)體腫瘤治療藥物。用于解決問題的方法本發(fā)明人等人為了解決上述課題，努力研究，發(fā)現(xiàn)通過將向不表達(dá)CD的菌中導(dǎo)入CD基因而轉(zhuǎn)化了的CD表達(dá)菌在5-FC的存在下傳代、馴化培養(yǎng)，能夠制備保持有CD活性的5-FU耐受菌。即、將CD表達(dá)菌在加入了確定量的5-FC的培養(yǎng)用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的話，通過與CD表達(dá)菌的增殖一起表達(dá)的CD酶活性而緩慢地將5-FC轉(zhuǎn)換成5-FU，即使加入確定量的5-FC，在最初的低濃度的5-FU作用下能夠防止CD表達(dá)菌的死亡，緩慢地提高濃度，能夠選擇性地培養(yǎng)僅獲得了耐受能力的表達(dá)CD的5-FU耐受菌。此外，本發(fā)明人等人發(fā)現(xiàn)通過將不表達(dá)CD的細(xì)菌在5-FU的存在下傳代、馴化培養(yǎng)，制備5-FU耐受菌后，向該5-FU耐受菌中導(dǎo)入CD基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)化也能夠制備表達(dá)CD的5-FU耐受菌。此外，本發(fā)明人等人發(fā)現(xiàn)通過使用通過這樣的方法得到的5-FU耐受菌以高濃度的5-FU對(duì)腫瘤進(jìn)行持續(xù)的處理，能夠克服5-FU的副作用問題，由此完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及[1].在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶、并且對(duì)至少抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌的制備方法，其特征在于，該方法包括將在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌在5-氟胞嘧啶的存在下進(jìn)行傳代、馴化培養(yǎng)；和[2].[1]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，其中在厭氧環(huán)境下的肺瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌中導(dǎo)入胞嘧啶脫氨酶基因而轉(zhuǎn)化的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌，和[3].[1]或者[2]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在添加了2~500(Vg/ml的5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代、馴化培養(yǎng)，和[4].[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌，和[5].[4]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌，和[6].其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌，和[7].[6]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，其中表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌或者嬰兒雙歧桿菌，和[8].[7]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌，和[9].耐受菌的制備方法，其特征在于，所述耐受菌為在厭氧環(huán)境下的胂瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶、且對(duì)至少抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，所述方法包括(l)在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌在5-氟尿嘧啶的存在下進(jìn)行傳代、馴化培養(yǎng)，制備5-氟尿嘧啶耐受菌的步驟，和(2)向該5-氟尿嘧啶耐受菌中導(dǎo)入胞嘧啶脫氨酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟，和[10].[9]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在添加了l~100ng/ml的5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代、馴化培養(yǎng)，和[ll].[9]或者[10]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌，和[12].[ll]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、并且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧。定脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌，和[13].[12]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌，和[14].[13]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌或者嬰兒雙歧桿菌，和[15].[14]中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌，和[16].表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，其是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶、并對(duì)至少抗胂瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，且通過[l]~[15]中任一項(xiàng)所述的制備方法制備，和[17].表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，該菌在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶且能夠在添加了至少2ng/ml的5-氟胞嘧啶或者lpg/ml的5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，和[18].[16]或者[17]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性細(xì)菌，和[19].[18]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧。定耐受性腸道內(nèi)細(xì)菌，和[20].[19]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性腸道內(nèi)細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌，和[21].[20]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌或者嬰兒雙歧桿菌，和[22].[20]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其中表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌，和[23].[22]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pBLES100-S-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧咬耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105-A抹，和[24].[23]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105-A抹，和[25].[21]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧，定脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹，和[26].[21]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧淀耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧咬脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌aS-l株，和[27].[21]中所述的表達(dá)胞嗜啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌I-53-8W林，和[28].[21]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹，和[29].[21]中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌是含有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧咬脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌I-10-5株，和[30].藥物組合物，其特征在于，其中含有[16]~[29]中任一項(xiàng)所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，和[31].[30]中所述的藥物組合物，其特征在于，組合了5-氟胞嘧啶和[32].[30]或者[31]中所述的藥物組合物，其特征在于，進(jìn)一步組合了乳果糖，和；[33].實(shí)體胂瘤治療藥物，其特征在于，該藥物是用于能夠表達(dá)足夠量的由5-氟胞嘧咬轉(zhuǎn)換成有效治療量的5-氟尿嘧啶的量的胞嘧啶脫氨酶的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌和、能夠轉(zhuǎn)換成有效治療量的5-氟尿嘧啶的量的5-氟胞嘧啶組合而成的實(shí)體腫瘤治療藥物，其中表達(dá)胞嗜啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌是[16]~[29]中任一項(xiàng)所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，和.[33]中所述的實(shí)體腫瘤治療藥物，其特征在于，進(jìn)一步組合了乳果糖。圖l是雙歧桿菌屬與大腸桿菌的穿梭栽體pAV001的制備過程與表達(dá)CD的穿梭載體pAVOOl-HU-eCD的制備過程的示意圖。圖2是比較在野生型長(zhǎng)雙歧桿菌和雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD中CD蛋白的表達(dá)量的結(jié)果的示意圖。圖3是比較野生型長(zhǎng)雙歧桿菌和雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD中CD蛋白酶活性的(5-FC—5-FU的轉(zhuǎn)換活性比較)的結(jié)果得到的經(jīng)時(shí)菌數(shù)變化的示意圖。圖4是比較野生型長(zhǎng)雙歧桿菌和雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD中CD蛋白酶活性的(5-FC—5-FU的轉(zhuǎn)換活性比較)的結(jié)果得到的5-FU濃度的示意圖。具體實(shí)施方式作為本發(fā)明中5-FU耐受菌的制備方法，只要是將在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的CD表達(dá)菌在5-FC的存在下傳代、馴化培養(yǎng)的方法A;或者包括(l)將在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、并且不表達(dá)CD的菌在5-FU的存在下傳代、馴化培養(yǎng)，制備5-FU耐受菌的步驟和、(2)向該5-FU耐受菌中導(dǎo)入CD基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟的方法B，就沒有特別的限制。作為上述方法A中在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)CD表達(dá)菌，只要是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且表達(dá)CD的菌就沒有特別的限制，可以是從自然界分離出的菌，也可以是向在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)CD菌中導(dǎo)入CD基因轉(zhuǎn)化得到的重組菌。此外，在上述方法B中使用的在厭氧環(huán)境下的肺瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、并且不表達(dá)CD的菌只要是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、并且不表達(dá)CD的菌就沒有特別的限制。本發(fā)明的制備方法中使用的在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的菌，可以例如為菌(細(xì)菌)或真菌，作為該菌具體而言可以列舉雙歧桿菌屬細(xì)菌、梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌、鏈球菌屬細(xì)菌、消化^求菌屬細(xì)菌、腸球菌屬細(xì)菌、擬桿菌屬細(xì)菌、優(yōu)桿菌屬細(xì)菌等的腸道內(nèi)細(xì)菌，其中優(yōu)選雙歧桿菌屬細(xì)菌。作為屬于上述雙歧桿菌屬的細(xì)菌，具體而言，可以例舉長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、乳酸雙歧桿菌(B.lactentis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、假長(zhǎng)雙歧桿菌(B.pseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌(B.thermophirum)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)等。其中，與年齡無(wú)關(guān)的人的腸道內(nèi)常在性的已知有優(yōu)選使用長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌作為宿主菌，更優(yōu)選使用長(zhǎng)雙歧桿菌。這些菌可以是任一市售的，或者可以容易地從保藏機(jī)構(gòu)獲得，例如，可以使用長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC-15707、兩歧雙歧桿菌ATCC-11863、嬰兒雙歧桿菌ATCC-15697。對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌抹沒有特別的限制，例如可以列舉長(zhǎng)雙歧桿菌105-A林、長(zhǎng)雙歧桿菌aE-194b林、長(zhǎng)雙歧桿菌bs-601林、長(zhǎng)雙歧桿菌M101-2林，其中，例如優(yōu)選長(zhǎng)雙歧桿菌105-A抹。此外，對(duì)短雙歧桿菌林也沒有特別的限制，可以例舉例如短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹(JCM1192)、短雙歧桿菌aS-l抹、短雙歧桿菌I-53-8W抹。此外，對(duì)嬰兒雙歧桿菌抹沒有特別的限制，可以例舉例如嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)4朱(JCM1222)、嬰兒雙歧桿菌I-10-5林。此外，對(duì)乳酸雙歧桿菌林沒有特別的限制，可以例舉例如乳酸雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林(JCM1220)。方法A中，在5-FC的存在下的傳代、馴化培養(yǎng)可以通過將細(xì)菌、真菌分別接種到適合生長(zhǎng)或者增殖的培養(yǎng)用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或者瓊脂平板)中，加入例如在2~500(Vg/ml、優(yōu)選2~200(Vg/ml的范圍內(nèi)的5-FC，于37。C下，通過厭氧培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行。通過在添加了5-FC的培養(yǎng)用培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，用與細(xì)菌的增殖一起表達(dá)的CD酶緩緩地將5-FC轉(zhuǎn)換成5-FU,開始時(shí)以低濃度進(jìn)行作用，防止所培養(yǎng)的菌的死亡，緩緩地使?jié)舛壬仙?，可以選擇性地只培養(yǎng)獲得了耐受能力的培養(yǎng)菌。這樣，能夠再現(xiàn)性良好地回收本發(fā)明的5-FU耐受菌。上述方法B中，作為在5-FU的存在下的傳代、馴化培養(yǎng)，將細(xì)菌、真菌分別接種到適合生長(zhǎng)或者增殖的培養(yǎng)用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或者瓊脂板)上，加入例如l~100ng/ml、優(yōu)選2~10(Vg/ml的范圍內(nèi)的5-FU，在37。C下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。這樣，能夠再現(xiàn)性良好地回收5-FU耐受菌。為了制備導(dǎo)入了CD基因而被轉(zhuǎn)化了的CD的表達(dá)菌或者、在導(dǎo)入在厭氧環(huán)境下賦與生長(zhǎng)能力的基因而被轉(zhuǎn)化了的菌而使用的CD表達(dá)載體或者轉(zhuǎn)化菌的制備，可以按照市售的實(shí)驗(yàn)書，例如、基因操作手冊(cè)(講談社)、高木康敬編基因操作試驗(yàn)法(講談社)、分子克隆(MolecularCloningColdSpringHarjborLaboratory)(1982)、分子克隆第2版(MolecularCloning,2nded.ColdSpringHarborLaboratory,1989,MethodsinEnzymol.，194，1991、試驗(yàn)醫(yī)學(xué)分冊(cè).酵母通過基因試驗(yàn)法(羊土社，1994)等所述的方法進(jìn)行。此外，表達(dá)載體優(yōu)選使用適合宿主菌的載體。編碼CD的DNA可以〗吏用從例如、含有編碼來(lái)自大腸桿菌的CD的DNA的質(zhì)粒pAdexlCSCD(理化學(xué)研究所GeneBankRDBNo.1591)、或者含有編碼來(lái)自相同的大腸桿菌的CD的DNA的質(zhì)粒pMK116分離得到DNA(D丄Meadetal.,ProteinEngineering1:67-74(1986))。特別是、作為用于雙歧桿菌屬的細(xì)菌的CD表達(dá)載體，特別優(yōu)選使用例如含有插入到長(zhǎng)雙歧桿菌hup啟動(dòng)子的下游的大腸桿菌codA的重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD(參見專利文獻(xiàn)1以及非專利文獻(xiàn)21)或者、將該pBLES100-S-eCD改良了的、能轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌或短雙歧桿菌的pAVOOl-HU-eCD、或者這些質(zhì)粒的突變體。所謂的質(zhì)粒pBLESlOO-S-eCD的突變體是指具有來(lái)自pBLESlOO-S-eCD的質(zhì)粒核酸序列的突變體，在本發(fā)明中可以與pBLESlOO-S-eCD同樣地^f吏用的質(zhì)粒。此外，所謂的質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的突變體是指同樣地具有來(lái)自pAVOOl-HU-eCD的質(zhì)粒核酸序列的突變體，在本發(fā)明中可以與pAV001-HU-eCD同樣地使用的質(zhì)粒。本發(fā)明中表達(dá)CD的5-FU耐受菌只要能夠在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)、能夠表達(dá)CD的并且對(duì)至少抗腫瘤活性有效濃度的5-FU具有耐受能力，就沒有特別的限制。5-FU的抗腫瘤活性的有效濃度取決于作為對(duì)象的腫瘤或者患者等，不能一概而論?？梢粤信e例如至少0.05~0.ljig/ml的濃度。并且，在市售的5-FU制劑(注射給藥)的說明書中所述有使5-FU制劑在進(jìn)行性胃癌患者中的5-FU的血中濃度為約0.6pg/ml而持續(xù)地進(jìn)行靜脈注射。作為本發(fā)明中的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的具體的5-FU耐受能力指的是在含有至少l~200(Vg/ml、優(yōu)選2~2000ng/ml的范圍內(nèi)的5-FU的培養(yǎng)用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或者瓊脂板)，在37。C下厭氧培養(yǎng)的情況下能夠進(jìn)行生長(zhǎng)。此外，本發(fā)明中的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的5-FU耐受能力是指如果具體地表示為5-FC的濃度的話，為在含有2~500(Vg/ml、優(yōu)選3~500(Vg/ml的范圍內(nèi)的5-FC的培養(yǎng)用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或者瓊脂板)，于37。C下，在厭氧培養(yǎng)的情況下能夠生長(zhǎng)。本發(fā)明中的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的5-FU耐受能力是指在含有前述的5-FU的數(shù)值范圍的范圍內(nèi)的任一數(shù)值的5-FU的培養(yǎng)用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或者瓊脂板)，在37。C，于厭氧培養(yǎng)的情況下能夠生長(zhǎng)，或者在含有前述的5-FC的數(shù)值范圍的范圍內(nèi)任一數(shù)值的5-FC的培養(yǎng)用培養(yǎng)基(培養(yǎng)液或者瓊脂板)上，在37。C下在厭氧培養(yǎng)的情況下能生長(zhǎng)即可。作為本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的耐受能力，希望為能在添加了至少lpg/ml以上的5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的耐受能力，或者能夠在添加了至少2jig/ml以上的5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的耐受能力。本發(fā)明中的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的制備方法沒有特別的限制，可以使用從自然界分離的方法，也可以使用前述的本發(fā)明的耐受菌的制備方法等。即，本發(fā)明中的表達(dá)CD的5-FU耐受菌可以是從自然界分離的菌，也可以是使用了前述的本發(fā)明的耐受菌的制備方法等的重組菌。作為本發(fā)明中的表達(dá)CD的5-FU耐受菌，只要是具有在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能生長(zhǎng)，能表達(dá)CD，并且具有至少抗胂瘤活性有效濃度的5-FU的耐受能力這些性質(zhì)的菌或者真菌，就沒有特別的限制，具有該性質(zhì)的菌優(yōu)選具有該性質(zhì)的處于腸道內(nèi)的細(xì)菌。作為腸道內(nèi)的細(xì)菌，可以優(yōu)選例如雙歧桿菌屬細(xì)菌、梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌、鏈球菌屬細(xì)菌、消化^求菌屬細(xì)菌、腸J求菌屬細(xì)菌、擬桿菌屬細(xì)菌、優(yōu)桿菌屬細(xì)菌等，其中更優(yōu)選例如雙歧桿菌屬細(xì)菌。作為上述的雙歧桿菌屬細(xì)菌，具體而言，可以例舉例如長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、青春雙歧軒菌(B.adolescentis)、乳酸雙歧桿菌(B.lactentis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、假長(zhǎng)雙歧桿菌(B.pseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌(B.thermophirum)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)等。其中，與年齡無(wú)關(guān)的人的腸道內(nèi)內(nèi)常在性的菌已知優(yōu)選使用長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌作為宿主菌，更優(yōu)選使用長(zhǎng)雙歧桿菌。這些菌任何一個(gè)可以市售的，或者可以從保藏機(jī)構(gòu)容易地獲得?？梢允褂美纭㈤L(zhǎng)雙歧桿菌ATCC-15707、兩歧雙歧桿菌ATCC-11863、嬰兒雙歧桿菌ATCC-15697。對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌抹沒有特別的限制，可以舉例例如長(zhǎng)雙歧桿菌105-A抹、長(zhǎng)雙歧桿菌aE-194b林、長(zhǎng)雙歧桿菌bs-6014朱、長(zhǎng)雙歧桿菌M101-2林，其中，優(yōu)選例如長(zhǎng)雙歧桿菌105-A林。此外，對(duì)短雙歧桿菌株沒有特別的限制，可以舉例例如短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林(JCM1192)、短雙歧桿菌aS-l抹、短雙歧桿菌I-53-8W抹。此外，對(duì)嬰兒雙歧桿菌抹沒有特別的限制，可以舉例例如嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)4朱(JCM1222)、嬰兒雙歧桿菌I-10-5抹。此外，對(duì)乳酸雙歧桿菌抹沒有特別的限制，可以舉例例如乳酸雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹(JCM1220)。作為具有該性質(zhì)的雙歧桿菌屬細(xì)菌，更具體而言，可以優(yōu)選例舉含有質(zhì)粒pBLES100-S-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105-A林(質(zhì)粒pBLES100-S-eCD或該質(zhì)粒突變體轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-A林)、含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105-A抹、含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林、含有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性短雙歧桿菌aS-l抹、含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性短雙歧桿菌I-53-8W林、含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林、含有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的表達(dá)CD的5-FU耐受性嬰兒雙歧桿菌1-10-5抹等。本發(fā)明的藥物組合物只要含有本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌就沒有特別的限制。此外，本發(fā)明的藥物組合物也可以含有一種或者2種以上的本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌。此外，本發(fā)明的藥物組合物的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的給藥量只要是表達(dá)足夠的用于從5-FC轉(zhuǎn)換成有效治療量的5-FU的量的CD的量就沒有特別的限制，優(yōu)選盡量少的量。本發(fā)明的藥物組合物只要不妨礙本發(fā)明的效果，可以除了本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌之外，含有任意的成分。作為其任意成分，例如藥理學(xué)上允許的載體、賦形劑、稀釋劑等。此外，本發(fā)明的藥物組合物與通過本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌而能夠轉(zhuǎn)換成5-FC的量的5-FU組合使用，該5-FC可以含有在本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選將5-FC與藥物組合物組合〗吏用。此外，本發(fā)明的藥物組合物也可以與促進(jìn)本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的增殖的糖類相組合，作為這樣的糖類，例如可以例舉乳果糖。本發(fā)明中的"X和Y的組合"中，X和Y可以各自為不同的形態(tài)、X和Y也可以是相同的形態(tài)(例如含有X和Y的形態(tài))中的任何一種情況。此外，X和Y各自為不同的形態(tài)的情況下，也包括X、Y的任——方還含有其他的成分的情況。當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物向患者給藥時(shí)，本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌在腫瘤內(nèi)增殖。該耐受菌在腫瘤內(nèi)存在期間內(nèi)，向患者給藥5-FC，在腫瘤內(nèi)中CD的作用下，5-FC轉(zhuǎn)換成5-FU，能夠使腫瘤細(xì)胞死亡。因?yàn)楸景l(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌在能夠使用腫瘤細(xì)胞死亡的5-FU濃度中也能生存，能夠持續(xù)地通過CD酶發(fā)揮作用，所以能夠得到以本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌為有效成分的優(yōu)良的抗腫瘤藥物。此外，本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌能夠增殖，不過在厭氧環(huán)境下的腫瘤以外的部分該表達(dá)CD的5-FU耐受菌不能生長(zhǎng)，所以，不能將5-FC轉(zhuǎn)換成5-FU，與單獨(dú)給藥5-FU的情況相比，能夠顯著地降低由于5-FU產(chǎn)生的全身性的副作用。此外，因?yàn)楸景l(fā)明的實(shí)體腫瘤治療藥物的抗腫瘤效果對(duì)腫瘤具有高特異性，所以與單獨(dú)給予5-FU的情況相比，能夠在腫瘤內(nèi)實(shí)現(xiàn)顯著高的5-FU濃度，其結(jié)果取得了極其優(yōu)良的抗腫瘤效果。作為本發(fā)明的藥物組合物的劑型，例如可以例舉含有本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的液體制劑或者固體制劑。液體制劑是將本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，向其中根據(jù)需要添加適當(dāng)?shù)纳睇}水液或者補(bǔ)充液或者藥物添加劑，通過填充到安剖或者西林瓶等進(jìn)行制備。此外，固體制劑，可以向液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，填充到安剖或者西林瓶等后，進(jìn)行凍干或者L干燥，或者向向液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，在凍干或者L干燥后將其填充到安剖或者西林瓶等中進(jìn)行制備。作為本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法，優(yōu)選非經(jīng)口給藥，可以列舉例如皮下注射、靜脈注射、局部注入、腦室內(nèi)給藥等，不過最優(yōu)選靜脈注射。并且，本發(fā)明的藥物組合物是與5-FC組合使用的。本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法和5-FC的給藥方法可以相同也可以不同，此外，給藥可以同時(shí)進(jìn)行也可以間隔進(jìn)行。優(yōu)選5-FC的給藥在本發(fā)明的藥物組合物的給藥后、本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌能夠在腫瘤細(xì)胞中充分生長(zhǎng)的時(shí)間給藥。與本發(fā)明的藥物組合物組合使用的5-FC的給藥量只要是足夠用于通過本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌從5-FC轉(zhuǎn)換成有效治療量的5-FU的量，就沒有特別的限制，優(yōu)選少的量，例如可以在5~200mg/kg的范圍內(nèi)加以適當(dāng)選擇。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以組合使用促進(jìn)本發(fā)明的表達(dá)CD的5-FU耐受菌的增殖的糖類，作為這樣的糖類，可以例舉例如乳果糖。這樣的糖類可以含在本發(fā)明的藥物組合物中進(jìn)行給藥，也可以作為其他的藥物組合物，同時(shí)或者間隔給藥。下面通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，不過本發(fā)明的技術(shù)范圍不局限于這些例示。參考例1[表達(dá)CD的長(zhǎng)雙歧桿菌的制備]按照特許2004-339677中所述的方法制備表達(dá)CD的長(zhǎng)雙歧桿菌。穿梭栽體pAVOOl的構(gòu)建(質(zhì)粒的構(gòu)建)從長(zhǎng)雙歧桿菌和大腸桿菌的穿梭載體pBLES100(參見專利文獻(xiàn)2以及非專利文獻(xiàn)23)通過PCR擴(kuò)增含有來(lái)自糞腸3求菌(Enterococcusfaecalis)的大觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(AAD盒)的序列，亞克隆到pCR-BluntII-TOPO栽體(Invitrogen)中，制備pCRTOPO-Scal-AAD-Eam11051。并且，分別向正向引物中添加Scal、反向引物中添加Eaml1051限制性酶切位點(diǎn)。如圖1所示，從Invitrogen公司購(gòu)入的克隆載體pGFPuv(DEFINITION:CloningvectorpGFPuv.ACCESSION:U62636VERSION:U62636.1GI:1490528)由GFPuv基因和它兩端的多克隆位點(diǎn)(Multi-CloningSite、MCS)、氨節(jié)抗性基因、大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)所構(gòu)成。將該pGFPuv的氨卡抗性基因部位用限制性酶Eaml1051和Seal切割，制備切取的長(zhǎng)片段。同樣地使用限制性酶Eaml1051和Scal,制備含有切割了pCRT0P0-Scal-AAD-Eam11051的AAD盒的片段(約1100bp)。制備使用T4DM連接酶連接了上述2個(gè)片段的pGFPuv-SpR。并且，在大腸桿菌中分別確認(rèn)制備的質(zhì)粒pGFPuv-SpR在賦與大觀霉素耐受性性質(zhì)的同時(shí)缺失了氨芐抗性性質(zhì)。將pGFPuv-SpR用限制性酶Sa11(存在于GFPuv基因上游的多克隆位點(diǎn)內(nèi))和SpeI(存在于GFPuv基因下游的多克隆位點(diǎn)內(nèi))進(jìn)行消化，制備去除了GFPuv基因的質(zhì)粒pAVN。根據(jù)來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒pTB6的完整堿基序列信息確定含有RepB、SD0、DD0、AT-richrepeats、DnaA-bindingmotifs的約1900bp的序列和長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒復(fù)制單位相同。通過PCR擴(kuò)增含有來(lái)自pTB6的長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒復(fù)制單位約1900bp的堿基，制備亞克隆到pCR-BluntII-TOPO載體的pCRTOPO-Apal-1900-Scal。并且，分別向正向引物中添加Apal位點(diǎn)、向反向引物中添加Seal限制性酶切位點(diǎn)。將用限制性酶Apal和Seal消化后的pAVN的長(zhǎng)片賴(約2400bp)與同樣地用限制性酶Apal和Seal消化后的pCRTOPO-Apal-1900-Seal短片段(約1900bp)使用T4DNA連接酶連接，制備長(zhǎng)雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭載體pAVOOl(約4300bp)。2.CD基因表達(dá)載體pAVOOl-HU-eCD(表達(dá)載體的構(gòu)建)然后將pBLES100-S-eCD用P艮制性酶Hindi11和Spel切割,切取含有HU基因啟動(dòng)子、來(lái)自大腸桿菌的CD基因和HU基因終止子的約2900bp的序列。制備向同樣地將穿梭載體pAVOOl的多克隆位點(diǎn)內(nèi)的限制性酶切割部位以HindIII和Spel切割得到的長(zhǎng)片段上，使用T4DM連接酶連接了上述的約2900bp片段的pAVOOl-HU-eCD(約7100bp)。3.向雙歧桿菌屬導(dǎo)入CD基因表達(dá)載體pAVOOl-HU-eCD從野生型長(zhǎng)雙歧桿菌在MRS培養(yǎng)基中于37'C厭氧條件下培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液通過離心分離分離菌體，制備懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中的菌體懸濁液。然后，使用按照非專利文獻(xiàn)23所所述的電轉(zhuǎn)化法，將胞嘧咬脫氨酶基因表達(dá)載體pAVOOl-HU-eCD導(dǎo)入到上述的菌懸濁液中。將導(dǎo)入的重組長(zhǎng)雙歧桿菌(長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD在含有抗生素大觀霉素的瓊脂培養(yǎng)基上根據(jù)克隆形成進(jìn)行篩選。(重組長(zhǎng)雙歧桿菌中胞嘧啶脫氨酶的表達(dá))將長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD或者野生型長(zhǎng)雙歧桿菌分別在含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基中于37。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2天以上，通過從培養(yǎng)液離心分離將菌體(lxl(TCFU)分離，超聲波破碎后分別提取菌體內(nèi)蛋白。將上述提取的蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行分離，通過Western法確認(rèn)胞嘧啶脫氨酶蛋白的表達(dá)。并且，分別作為一次抗體4吏用兔抗月包嘧p定脫氨酶單克隆抗體(SawadayTechnology)、作為二次抗體使用西洋地黃辣根過氧化物酶-抗兔免疫球蛋白G復(fù)合體(SantaCruzBiotechnology,Inc)。作為4言號(hào)的感光法，4吏用冷丟卩CCD成像Fluo-S-MAX(BIO-RAD)檢測(cè)由ECL法發(fā)出的信號(hào)。其結(jié)果，野生型長(zhǎng)雙歧桿菌中檢測(cè)不到信號(hào)，胞嗜啶脫氨酶無(wú)表達(dá)，而在長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD中檢測(cè)到信號(hào)，確認(rèn)胞嘧啶脫氨酶蛋白的表達(dá)(參見圖2)。(長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD中胞嘧。定脫氨酶酶活性；5-FC—5-FU的轉(zhuǎn)換活性的測(cè)定)將長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD或者野生型長(zhǎng)雙歧桿菌分別接種到含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基中，在37。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2天以上，通過從培養(yǎng)液離心分離分離菌體(2x1(TCFU)，在4.5mL的MRS培養(yǎng)基中再次懸浮。然后，使其最終濃度為2mg/mL添加0.5mL的5-FC(20mg/mL),在37。C厭氧條件下培養(yǎng)。在第0、4、8、18、24小時(shí)時(shí)從培養(yǎng)液分別回收通過離心分離去除了菌體的上清，通過氣相層析分析(5-FUGC-MSmethods,BML)測(cè)定轉(zhuǎn)換了的5-FU的濃度。經(jīng)時(shí)菌數(shù)變化如圖3、5-FU濃度如圖4各自所示。分析結(jié)果在野生型長(zhǎng)雙歧桿菌中僅僅檢測(cè)到極其少量的5-FU，而在長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD中，檢測(cè)到在第4小時(shí)后為39.2pg/mL、在笫24小時(shí)后為102.1pg/mL的5—FU。實(shí)施例1[長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD的S-FU耐受菌]將參考例1得到的長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD接種到含有50jig/mL的5-FC的5mL的含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基中，在37。C厭氧培養(yǎng)72小時(shí)。然后，取出lmL培養(yǎng)后的培養(yǎng)基，接種到相同地含有5(Vg/mL的5-FC的9mL的含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基中，以相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)24小時(shí)。通過將該接種操作重復(fù)3次，制備5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD。然后，接種到含有5-FU為2(Vg/mL的含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基中，以相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)24小時(shí)，確i人制備的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD的5-FU耐受性生長(zhǎng)。之后，用甘油懸浮菌，將其作為甘油儲(chǔ)液在-8(TC保存。將該保存的菌體樣品和野生型長(zhǎng)雙歧桿菌接種到含有5-FU250ng/mL的含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基中，比較生長(zhǎng)的時(shí)候，野生型沒有生長(zhǎng)，不過保存的樣品在第二天出現(xiàn)菌的增殖，對(duì)5-FU保持了耐受性。對(duì)培養(yǎng)后的菌液通過平板測(cè)定法測(cè)定生長(zhǎng)的菌數(shù)時(shí)，野生型在檢測(cè)限以下(指的是103CFU/mL以下)，不過保存的樣品的菌液生長(zhǎng)了2~3xl09CFU/mL的菌。[5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌的5-FU耐受性濃度測(cè)定]將實(shí)施例1得到的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD或者野生型長(zhǎng)雙歧桿菌分別在MRS培養(yǎng)基上于37。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2天以上。將這些培養(yǎng)液用厭氧性稀釋液稀釋后，分別涂布在含有0、25、50、100、250、500、1000、2000ng/mL的5-FU的BL瓊脂培養(yǎng)基上，測(cè)定在37。C經(jīng)過2~3天的厭氧培養(yǎng)后的生長(zhǎng)菌數(shù)。使用不含5-FU的BL瓊脂培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5次，此外使用含有5-FU的BL瓊脂培養(yǎng)基的進(jìn)行3次。其結(jié)果示于表1(5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD)以及表2(野生型長(zhǎng)雙歧桿菌)。從表1的結(jié)果可知5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD的5-FU耐受性濃度為2000pg/mL以上。一方面野生型長(zhǎng)雙歧桿菌在至少含5-FU25jag/mL以上時(shí)不生長(zhǎng)(表2)。表15-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD5<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>sd:標(biāo)準(zhǔn)偏差CV:變動(dòng)系數(shù)表2野生型長(zhǎng)雙歧桿菌<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>sd:標(biāo)準(zhǔn)偏差CV:變動(dòng)系數(shù)[5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌的5-FU耐受性特性的保持]將實(shí)施例1中得到的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD使用含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基在"。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2天以上。取該培養(yǎng)液5pL接種到不含抗生素大觀霉素含的5mL的MRS培養(yǎng)基中，在37。C厭氧條件下進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的菌液同樣地進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)地進(jìn)行30天的傳代培養(yǎng)。將連續(xù)傳代培養(yǎng)30日后的菌液用厭氧性稀釋液稀釋后，分別涂布在含有5-FU250yg/mL含的BL瓊脂培養(yǎng)基和不含5-FU的BL瓊脂培養(yǎng)基上，在37。C下厭氧培養(yǎng)2~3天后，測(cè)定生長(zhǎng)的菌數(shù)。試驗(yàn)進(jìn)行5次。其結(jié)果示于表3。從表3的結(jié)果可知，5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌的5-FU耐受性性質(zhì)至少在連續(xù)傳代培養(yǎng)30天后也能保持。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>sd:標(biāo)準(zhǔn)偏差CV:變動(dòng)系數(shù)[5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌各5-FU非耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌在添加5一FC的的體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)]將參考例1的長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD(5-FU非耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌)和在實(shí)施例1中得到的長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD(S-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌)分別在含有抗生素大觀霉素的MRS培養(yǎng)基于37。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2天以上。之后分別接種到含有5、25、50、100、"0、500|ug/mL的5-FC的MRS培養(yǎng)基的50—培養(yǎng)液中，在37。C厭氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)后的菌液的濁度(OD-600nm)，調(diào)查各菌有無(wú)增殖(表4)。5-FU非耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌在5-FC濃度為50ug/mL以上的濃度的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)顯著受到抑制，不過5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌能夠在全部濃度中生長(zhǎng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例2[使用5-FU添加培養(yǎng)基制備的長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD的5_FU耐受菌]將長(zhǎng)雙歧桿菌接種到含有1、5、10、50、100、50(Vg/mL的5-FU的5mL的MRS培養(yǎng)基中、在3丌C厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)1~5天，測(cè)定各自的濁度(OD-600nm)，調(diào)查有無(wú)生長(zhǎng)(表5)。其結(jié)果，在含有5G0fig/mL的5-FU的培養(yǎng)基中在5日后一點(diǎn)都沒有生長(zhǎng)，不能制備耐受菌抹。然后，從確認(rèn)有增殖的培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中取出lmL,分別接種到含有相同的濃度的5-FU的9mL的MRS培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)24小時(shí)。通過將該接種操作重復(fù)3次，制備針對(duì)各5-FU濃度的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌。然后，向MRS培養(yǎng)基中接種各5_FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌，將培養(yǎng)后的菌液分別接種到含有250ng/mL的5-FU的MRS培養(yǎng)基中，使用濁度(OD-600nm)測(cè)定24小時(shí)后有無(wú)增殖(表6)。其結(jié)果，用含有1~100pg/mL的5-FU的培養(yǎng)基制備的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌與實(shí)施例1得到的5-FU耐受菌林同樣地對(duì)5-FU具有耐受性。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例3將實(shí)施例2得到的5-FU耐受菌株以與參考例l相同的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，確認(rèn)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶。制備的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-FU耐受菌抹與實(shí)施例1得到的5-FU耐受菌林同樣具有對(duì)5-FU的耐受性，而且，對(duì)5-FU的耐受能力至少保持在7天以上。實(shí)施例4與實(shí)施例1相同地制備短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌的5-FU耐受菌林。下述表7中所述了5-FU耐受性雙歧桿菌的菌林的總結(jié)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>工業(yè)實(shí)用性通過本發(fā)明，能夠容易地制備CD/5-FC的酶-前藥療法中極其有用的、保持CD活性并且表現(xiàn)出5-FU耐受性的雙歧桿菌屬細(xì)菌等的5-FU耐受菌。例如向癌癥患者施用保持了CD活性且表現(xiàn)出5-FU耐受性的雙歧桿菌屬細(xì)菌的話，該雙歧桿菌屬細(xì)菌在腫瘤內(nèi)增殖，在存在于腫瘤內(nèi)的期間，如果將5-FC經(jīng)口給藥的話，其從腸道^皮吸收，在腫瘤內(nèi)部的CD的作用下，5-FC轉(zhuǎn)換成5-FU，能夠使腫瘤細(xì)胞死亡，在能夠使腫瘤細(xì)胞死亡的5-FU濃度下，5-FU耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌能夠生存、且通過CD而持續(xù)發(fā)揮酶作用，由此能夠得到以該雙歧桿菌屬微生物為有效成分的優(yōu)良的抗腫瘤藥物。此外，在本發(fā)明的表達(dá)CD的5-氟尿嘧啶耐受菌增殖的腫瘤以外的部分，因?yàn)?-FC不轉(zhuǎn)換成5-FU，所以與直接施用5-FU的情況相比，能夠?qū)?-FU的副作用抑制到極低的水平。而且，因?yàn)楸景l(fā)明的實(shí)體腫瘤治療藥物的抗腫瘤效果對(duì)腫瘤具有高度的特異性，所以與直接施用5-FU的情況相比，能夠在腫瘤內(nèi)實(shí)現(xiàn)很高的5-FU濃度，結(jié)果獲得極其優(yōu)良的抗腫瘤效果,權(quán)利要求1.在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶且對(duì)至少抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌的制備方法，其特征在于，將在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌在5-氟胞嘧啶的存在下傳代、馴化培養(yǎng)。2.權(quán)利要求1所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌是向在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌中，導(dǎo)入胞嘧啶脫氨酶基因而轉(zhuǎn)化了的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌。3.權(quán)利要求1或者2中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在添加了2~500(Vg/ml的5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代、馴化培養(yǎng)。4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的胞嘧啶脫氨酶表達(dá)菌是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)且表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌。5.權(quán)利要求4中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌。6.權(quán)利要求5中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌。7.權(quán)利要求6中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌或者嬰兒雙歧桿菌。8.權(quán)利要求7中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌。9.5-氟尿嘧啶耐受菌的制備方法，所述的耐受菌的特征在于是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶、且對(duì)至少抗胂瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶的耐受菌，所述制備方法的特征在于，包括(1)將在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌在5-氟尿嘧啶的存在下傳代、馴化培養(yǎng)，制備5-氟尿嘧啶耐受菌的步驟，和、(2)向該5-氟尿嘧啶耐受菌中導(dǎo)入胞嘧啶脫氨酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟。10.權(quán)利要求9所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，用添加了1~1GGjug/ml的5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代、馴化培養(yǎng)。11.權(quán)利要求9或者10中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌是在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的細(xì)菌。12.權(quán)利要求11中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的菌是不表達(dá)胞嘧咬脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌。13.權(quán)利要求12中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的腸道內(nèi)細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌。14.權(quán)利要求13中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌或者嬰兒雙歧桿菌。15.權(quán)利要求14中所述的耐受菌的制備方法，其特征在于，不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的雙歧桿菌屬細(xì)菌是不表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的長(zhǎng)雙歧桿菌。16.表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，所述菌為在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶、且對(duì)至少抗肺瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶具有耐受能力的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，且是由權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的。17.表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，其在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶、且能夠在至少添加了2ng/ml的5-氟胞嘧啶或者1mg/ml的5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。18.權(quán)利要求16或者17中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性細(xì)菌。19.權(quán)利要求18中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性腸道內(nèi)細(xì)菌。20.權(quán)利要求19中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性腸道內(nèi)細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌。21.權(quán)利要求20中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌或者嬰兒雙歧桿菌。22.權(quán)利要求20中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其中表達(dá)胞嗜啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性雙歧桿菌屬細(xì)菌是表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌。23.權(quán)利要求22中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pBLES100-S-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105-A林。24.權(quán)利要求23中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧咬耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105-A林。25.權(quán)利要求21中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹。26.權(quán)利要求21中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌aS-1林。27.權(quán)利要求21中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性短雙歧桿菌I-53-8W抹。28.權(quán)利要求21中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌:其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pAVOOl-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林。29.權(quán)利要求21中所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌:其特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌是具有質(zhì)粒pAV001-HU-eCD或該質(zhì)粒突變體的、表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受性嬰兒雙歧桿菌1-10-5林。30.藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求16~29中任一項(xiàng)所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌。31.權(quán)利要求30中所述的藥物組合物，其特征在于，組合了5-氟胞嘧咬。32.權(quán)利要求30或者31中所述的藥物組合物，其特征在于，進(jìn)一步組合了乳果糖。33.實(shí)體腫瘤治療藥物，其組合有能夠表達(dá)充分的量的用于從5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)換有效治療量的5-氟尿嘧啶的量的胞嘧啶脫氨酶的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌，和能夠轉(zhuǎn)換成有效治療量的5-氟尿嘧啶的量的5-氟胞嘧啶，所述實(shí)體腫瘤治療藥物的特征在于，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌是權(quán)利要求16~29中任一項(xiàng)所述的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的5-氟尿嘧啶耐受菌。34.權(quán)利要求33所述的實(shí)體腫瘤治療藥物，其特征在于，進(jìn)一步組合了乳果糖。全文摘要本發(fā)明提供下述耐受菌的制備方法，所述耐受菌為在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(CD)且對(duì)至少抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶(5-FU)具有耐受能力的表達(dá)CD的5-FU耐受菌。具體而言，包括將在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)的表達(dá)CD的菌在5-氟胞嘧啶(5-FC)的存在下傳代、馴化培養(yǎng)的方法A，或者包括將(1)在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)能夠生長(zhǎng)、且不表達(dá)CD的菌在5-FU的存在下傳代、馴化培養(yǎng)，制備5-FU耐受菌的步驟，和(2)向該5-FU耐受菌中導(dǎo)入CD基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟的方法B。此外，本發(fā)明還提供這種表達(dá)CD的5-FU耐受菌以及含有該耐受菌的藥物組合物。文檔編號(hào)C12N1/21GK101155911SQ20068001134公開日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年4月4日優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日發(fā)明者天野純,浜地芳典,藤森實(shí),谷口俊一郎申請(qǐng)人:阿內(nèi)羅藥物科學(xué)株式會(huì)社