專利名稱：通過CYP1A1等基因的SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測肺癌易感性的試劑盒，通過同時檢測細(xì) 胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450， family 1， subfamily A， polyp印tide 1， CYP1A1 )、 X射線交錯互 補修復(fù)基因1 (X-ray repair cross--complementing gene 1， XRCC1)和切除修復(fù)復(fù)合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2)的單核苷酸多態(tài)性位點 (SNP)來預(yù)測個體對肺癌的易感性。
背景技術(shù)：
原發(fā)性支氣管肺癌，簡稱肺癌，為當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴(yán)重威脅人類健康和 生命的疾病。腫瘤細(xì)胞源于支氣管粘膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道癥狀，病情進(jìn)展速度與細(xì)胞的生物特性有關(guān)。半個世紀(jì)以來，世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高趨勢。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報告 1997年全世界死于惡性腫瘤的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%，其中肺癌占惡性腫瘤死亡的19%，居 惡性腫瘤死因的第一位。我國1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺癌。云南錫礦的肺癌發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1960 1969年間為197.87/10萬，1970 1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的。英國 著名腫瘤學(xué)家R.Peto預(yù)言如果我國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌將超過100萬， 成為世界第一肺癌大國。病因和發(fā)病機制迄今尚未明確。 一致認(rèn)為肺癌的發(fā)病與下列因素有關(guān)①吸煙(包括主動吸煙和被動 吸煙)；②職業(yè)致癌因子，已被確認(rèn)的致人類肺癌的職業(yè)因素包括石棉、無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等；③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染)；④電離輻射；⑤飲食與營養(yǎng)，美國紐約和芝加哥開展的前瞻性人群觀察的結(jié)果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入量與十幾年后癌癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，其中最突出的是肺癌；(D其他，美國癌癥學(xué)會將結(jié)核列為肺癌的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺癌的危險性是 正常人群的10倍。其主要組織學(xué)類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霉)、機體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對肺癌的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)。已經(jīng)證明的兒個癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細(xì)胞肺癌中均有過度表達(dá)。 非小細(xì)胞肺癌中則?？梢妑as族基因的過度表達(dá)。這些深入的研究將為基因預(yù)防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 火約90%。這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感 性和對環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。CYP1A1基因位于第15號染色體15q22-q24位置，全長6.0kb， mRNA全長2601bp,共有7個外顯子， 編碼513個氨基酸的細(xì)胞色素P4501A1。 P4501A1是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類，被激活的 CYP1A1能將多種環(huán)境中的有機物質(zhì)如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環(huán)芬芳碳氛化合物轉(zhuǎn) 化為細(xì)胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的危險。國內(nèi)外的眾多研究顯示CYP1A1的多態(tài)與野生 型相比有更高的酶接觸反應(yīng)活性和可誘導(dǎo)性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的 危險度。細(xì)胞色素P450酶(CYP450)是細(xì)胞內(nèi)重要的I相代謝酶，在致癌物的活化和解毒過程中起著重 要的作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類。CYP1A1作為一種微神經(jīng)元體細(xì)胞嗨 與一些致癌物質(zhì)的生物激活有關(guān)，例如benzo[a]pyrene。同時，CYPJ Al易于被TCDD和多環(huán)的芳香族化3 合物所誘變，包括3-甲基膽蒽等實驗室用致癌物質(zhì)。目前的動物實驗表明，CYP1A1的表達(dá)與芳基碳蜜化 合物受體(AhR)禾IIArnt (AhRNuclear Translocator)的激動齊U,以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor) 的拮抗劑有關(guān)。同時，CYP1A1通過C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動。rsl048943是位于CYP1A1基因上的一個A/G多態(tài)，位于第7外顯子462號氨基酸由He轉(zhuǎn)化為Val。 目前NCBI公布的世界人口頻率A:G為0.896:0.104,雜合度0.186。世界人群的關(guān)聯(lián)分析表明，CYP1A1 11e462Val位點ValVal和Vallle基因型在肺癌病例組中的頻率明顯高于對照組，在女性中風(fēng)險度尤其突出。 基于多個中國人群肺癌發(fā)病與CYP1A1 Ue462Val位點的關(guān)聯(lián)分析研究，上千例肺癌個體與健康對照個體的 分析，顯示CYPlAlIk462Val這種位于酶蛋白的血紅素結(jié)合區(qū)的變異，是中國人群中重要的肺癌遺傳易感 因素之一。酶動力學(xué)研究表明，3種基因型表達(dá)的酶活性存在差異。Val/Val活化毒物的能力最強，Ile/Val 次之，而lle/Ile最弱。研究顯示，CYP1A1 ValVal基因型是中國人群中重要的肺癌遺傳易感因素之一。XRCC1位于第19號染色體19ql3.2-13.3位置，全長32.3kb, mRNA全長2087bp,共有17個外顯子， 編碼634個氨基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對因電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效 的修復(fù)作用。XRCC1編碼的蛋白與DNA連接酶IH、聚合酶e、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶交互作用，參與DNA 的堿基切除修復(fù)(Base Excision R印air， BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態(tài)性，與 癌癥發(fā)生有密切的關(guān)系。與XRCC1相關(guān)的癌癥主要有乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、胃癌、結(jié) 腸癌、胰腺癌、肺癌等。rs25487是位于第19號染色體XRCC1基因上的一個G/A多態(tài)，弓l起XRCC1基因編碼的蛋白第399 個氨基酸由Arg變?yōu)镚ln。 Arg399Gln位于第10號外顯子，XRCC1蛋白BCRTI區(qū)域。在世界人群中的該 多態(tài)的頻率分布，G占0.72， A占0.28左右。中國人群中的分布G為0.68， A為0.32。分子生物學(xué)研究表 明，XRCC1基因上第399號氨基酸Arg-Gln的替代加強XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結(jié)合能力， 從而影響個體的腫瘤易感性。通過大量對于大規(guī)模人群的肺癌病例對照研究，XRCC1的399氨基酸突變 位點在做單因素分析時與肺癌發(fā)生相關(guān)。ERCC2,位于第19號染色體19ql3.3位置，共有23個外顯子，基因全長19.0kb, mRNA全長2355bp, 編碼含761個氨基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的核苷酸切除修復(fù)，它可識別與修復(fù)結(jié) 構(gòu)無關(guān)的大范圍的損傷，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚體，并且是基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物BTF2/TFIIH的一 個組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，屬于RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的功能 缺失導(dǎo)致基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物不能正確識別DNA損傷位點，從而使堿基切除修復(fù)無法正確進(jìn)行，導(dǎo)致DNA 上的致癌損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導(dǎo)致的疾病包括癌癥、著色性干皮病、毛發(fā)硫營養(yǎng) 不良、柯凱肉氏綜合癥。i"sl3181是位于第19號染色體ERCC2基因第23號外顯子段Lys751Gln的T/G多態(tài)。世界人群中的頻 率約為T:G =0.798: 0.202，雜合度0.322,中國人群中的頻率約為T:G-0.91: 0.09。目前的多項研究表明， Lys751Gln的氨基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，這個位點的多態(tài)性與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮膚 癌等疾病有關(guān)。ERCC2 Lys751Gln位點的多態(tài)現(xiàn)象與肺癌特別是肺鱗癌的發(fā)生存在顯著關(guān)聯(lián)。rsl799793是位于第19號染色體ERCC2基因第10號外顯子段Asp312Asn的G/A多態(tài)。世界人群中 的頻率約為G:A=0.778:0.222，中國人群中的頻率約為G:A=0.94:0.06。目前的多項研究表明，該位點的多 態(tài)會導(dǎo)致ERCC2參與構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的性能發(fā)生弱化，從而使得對DNA損傷修復(fù)的能力下降，轉(zhuǎn) 錄因子的能力也同時發(fā)生下降，導(dǎo)致一系列諸如肺癌，前列腺癌等疾病的發(fā)生。ERCC2Asp312Asn多態(tài)性 與肺癌特別是肺鱗癌發(fā)生有顯著關(guān)聯(lián)，該位點的多態(tài)現(xiàn)象被認(rèn)為是中國人群中肺癌遺傳易感因素之一。國內(nèi)外的大量的關(guān)聯(lián)分析表明，CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點基因型為G時肺癌的發(fā)生幾率 增加；XRCC1基因上rs25487號SNP位點基因型為A時肺癌的發(fā)生幾率增加;ERCC2基因上rsl3181號SNP 位點基因型為G時肺癌的發(fā)生兒率增加；ERCC2基因上rsl799793號SNP位點基因型為A時肺癌的發(fā)生 幾率增加。這四個SNPs位點的多態(tài)性可用于評估個體對肺癌的易感性。發(fā)明內(nèi)容基于CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點和ERCC2基因上
的rsl3181號及rsl799793號SNP位點的多態(tài)性可用于評估個體對肺癌的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一 種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢 測XRCC1基因上的rs25487號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測ERCC2基因上的rsl3181 號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的特異性引 物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCL溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的 rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而 設(shè)計，能特異性擴增出耙位點的DNA片段。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地， 試劑盒中包含貝有SEQ ID NO: l和2所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對、具 有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物對。特異性引物對可 用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這四對引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的 rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而 設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出這四個SNPs位點肺癌易感基因型的探針。設(shè)計這類探針是 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 9、 10、 11和12所示序列的Tacpan 探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光 探針不限丁這四條探針，所有可用于熒光定量PCR檢測CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點、XRCC1基 因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP 位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括lpl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液，0. lpl 25mM dNTP混合液，0.5nl 25mM MgCl2溶液，0.02nl (5units/Vl) Taq DNA聚合酶，2(VM特異性引物對(八條)各0.225(11，10pM特異性熒光探針(四條)各0.25nl，去離子水3. 58nl。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例1.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢測肺癌易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針有義引物l: 5' - GTGTTMGTGAGMGGTGAT -3' (SEQ ID NO: 1) Tm值為56'C 反義引物1: 5' - AGGATAGCCAGGAAGAGAAA -3， (SEQ ID NO: 2) Tm值為58。C 有義引物2: 5' - TAACTGGCATCTTCACTTCT -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為56。C
反義引物2:5，- TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'(SEQIDNO:4)Tm值為58°C有義引物3:5,-ACTCAGGAGTCACCAGGAA -3'(SEQIDNO:5)Ttn值為58°C反義引物3:5'-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3'(SEQIDNO:6)Tm值為58'C有義引物4:5'- ATC組GAGACAGACGAGCA -3'(SEQIDNO:7)Tm值為58'C反義引物4:5，-TCAGGAAGCCCAGGAMT -3'(SEQIDNO:8)Tm值為54°C熒光探針1:5,-TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3'(SEQIDNO:9)Tm值為64°C熒光探針2:5'-CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'卿IDNO:10) Tm值為64'C熒光探針3:5'-AATCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3'(SEQIDNO:11) Tm值為66'C熒光探針4:■5，- TGCCCMCGMGTGCTGCAG -3'(SEQIDNO:12) Tm值為64t)有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異地針對檢測CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點多態(tài)性； 有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異地針對檢測XRCC1基因上rs25487號SNP位點多態(tài)性；有義引 物3，反義引物3和熒光探針3特異地針對檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點多態(tài)性；有義引物4， 反義引物4和熒光探針4特異地針對檢測ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點多態(tài)性。熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積包含濃度為20ngAd的DNA模板2nl、 1^1 10 X熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0.1^1 25mM dNTP混合液、0. 5(U 25mM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物l、 2 、 3和4各0.225nl、 20-的反義引物1、 2 、 3和4各0.225pl、 10pM的熒光探 針l、 2 、 3和4各0. 25^1，去離子水3. 58^1。在ABI9700型PCR擴增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50'C、 2分鐘，95。C、 IO分鐘，進(jìn)行60個循環(huán)的 95°C、 30秒，60°C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在4817900型熒光定量^0 儀上讀取樣品熒光量。步驟3: SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針1最終的熒光信號明顯高于 正常對照，說明被檢測DNA的CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點基因型攜帶有G型，為肺癌易感型； 熒光探針2最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DNA的XRCC1基因上rs25487號SNP位點基因 型攜帶有A型，為肺癌易感型；熒光探針3最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DM的ERCC2 基因上的rsl3181號SNP位點基因型攜帶有G型，為肺癌易感型；熒光探針4最終的熒光信號明顯高于正 常對照，說明被檢測DNA的ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺癌易感型。實施例2.指導(dǎo)人們主動預(yù)防肺癌的服務(wù)目前在上海主健生物工程有限公司己經(jīng)開展了這項服務(wù)。 步驟l: DNA提取對被檢測者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DM的CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上 rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點同 時進(jìn)行熒光定量PCR檢測，確定這四個SNPs位點的基因型。步驟3:指導(dǎo)人們主動預(yù)防肺癌通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導(dǎo)報告。基因 檢測報告詳細(xì)說明了被檢測者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導(dǎo)報告以被檢測者
的基因分型檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査結(jié)果，評估被檢測者肺癌遺傳易感的相對風(fēng)險。 同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議等，并 為被檢測者普及預(yù)防肺癌的健康知識。序歹U表<110〉上海主健生物工程有限公司<120>通過CYP1A1等基因的SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒<160> 12<210〉 <211> 〈212〉 <213>120 腿人工序列<220><223>引物 <400> 1gtgtt卿tg卿鄉(xiāng)tgst<210〉 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220>〈223〉引物 <400> 2Elgg8t3gCC3 gg33gag388 〈210〉 3〈211> 20 〈212> DNA <213>人工序列<220><223〉引物 <400> 3taactggcat cttcacttct
<210> 4 <211> 19〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 <400> 4tcc卿ttcc tggcattgc〈210〉 5<211〉 19<212> DNA <213>人工序列<220〉〈223〉引物 〈400〉 53ctcaggsgt C3cc3ggaa<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列〈220〉<223>引物 <400〉 6tctgttctct gcaggagga<210> 7 <211> 20 <212>隨 <213〉人工序列<220〉<223>引物
<400> 7atcaaag卿c卿cgagca<210> 8 <211〉 18 <212>腿 <213〉人工序列〈220〉<223>引物 〈400〉 8tcaggaagcc caggaaat<210> 9〈211〉 20<212> DNA <213〉人工序列<220〉<223〉探針 <400> 9tatcggtgag accgttgccc〈210〉 10 <211> 18 <212〉 DNA <213>人工序列<220><223>探針 <400> 10CggCtgCCCt CCCElg3gg<210> 11 〈211〉 22 <212>腿說明書第8/9頁201820〈213〉人工J予夕U <220><223〉探針 <400> 11aatctgctct atcctctgca gc<210> 12 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列〈220><223>探針 <400> 12tgccc幼cga agtgctgcsg
權(quán)利要求
1.一種檢測肺癌易感性的試劑盒，包括同時檢測CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和ERCC2基因上的rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對CYP1A1基因上的 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和 ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含CYP1A1基因上的rsl048943號SNP 位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的 rs 1799793號SNP位點的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對CYP1A1基因上的 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和 ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出這四個SNPs位 點肺癌易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID N0: l和2所 示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對 以及具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 9、 10、 11和12所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括lul IOX熒光定量PCR反 應(yīng)緩沖液，0. 1^1 25mM 混合液，0.5^1 25mM MgCh溶液，0,1 (5unitsAd) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(八條)各0.225nl， 10nM特異性熒光探針(四條)各0.25^1，去離子水3.58nl。本 試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rS13181號SNP位點和ERCC2基因上的rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測分析個體的CYP1A1基因、XRCC1基因和ERCC2基因上的SNPs位點基因攜帶型來預(yù)測個體對肺癌的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101153323SQ20061011666
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司