專利名稱：一種通過xrcc1基因檢測肺癌易感性的試劑盒的制作方法
—種通過XRCC1基因檢測肺痛易感性的試劑盒技聿領域本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢擁用的試劑盒，尤其是一神檢擁肺痛晷j^性的試擁盒，m^檢翻xit^交襟互補修復基因l (X-ray repair crote-<compleinentinggeneI, XRCC1)的單被苷餿多態(tài)性(SNP)位點 來瓖瀾個體對肺痛的易感性。背康技術原發(fā)性支氣管肺痛，,肺痛，為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重M人類健康和生4r的疾病，腫痛細胞源于支氣蟹粘鵬或腺體，常有區(qū)域性淋巴結和血行轉移，早期常有刺 & 嗽、澳 中審血等呼吸道癥狀，病情進展速度與細鬼的生物特性有關。半個世紀以來，世界各閨胂痛的發(fā)病率和病死率都有明顯塌高的趨勢，世界衛(wèi)生組戟WHO)2Q00年報 告1997年全世界死于惡性腫痛的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%,其中肺癌占惡性腫痛死亡的19 %， ^Btt腫痛死因的第一位，我國1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫痛死亡中，肺癌由 原來的第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺痛.云南銀礦的肺痛發(fā)病率在1954 1959年間為 28.02/10萬，1960 1969年間為197.87/10萬，1970~1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見 的，.英理著名腫瘤學家ItPeto預言如果我國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我頃每年腳痛將超 過柳萬，成為世界第一肺癌大國，病因和發(fā)病機制迄今尚未明確，一致認為肺痛的發(fā)病與下列因素有關(D"gys (包括主動吸 被動吸知)②職業(yè)致痛因子，已被確認的致人類肺痛的職業(yè)因素包括石棉、無機9Nfc合物、二氣甲鵬、鉻及 其化合物、錁、氡、芥子氣、氣乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染)；④電離輻射⑤飲食與營養(yǎng)，美國紐約和芝加哥開展的簾膽性人群瑰條的結果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入量與十幾年后痛癥的發(fā)生呈負相關，其中最夷出的是肺痛⑥其他，美國痛癥學會將結核列為肺痛的發(fā)病因素之一。有結核病者患肺癌的危險性是 正常人群的10倍。其主要組織學類型是腺痛.此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霧)、機體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對肺痛的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些痛基因的活化及抑癌基因的失活密切相關。已經(jīng)證明的幾個痛基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C《B2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細敏肺痛中i&W過虔表達。 非小細胞肺痛中則?？梢妑as族基因的過度表達。這些深入的研究將為基因預防和治療肺痛班供理論基礎。XRCC1位于第19號染色體1913.2-13.3位置，全長32,3kb, mRNA全長2087bp,共有17個外顯子， 編碼634個氨基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對因電離輻射和烷基化物引起的0NA單鏈斷裂能起到有效 的i^復作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接,in、聚合酶P、多聚ADP核糖轉移籌交互作用，參與DNA 的鵬切除修復(Base Excision R印air， BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態(tài)性， 與,發(fā)生有密切的關系。與XRCC1相關的痛癥主要有乳腺痛、頭頸部鱗狀細胞痛、食管痛、胄痛、 結鵬、胰腺癌、肺痛等。SNP(single nucleotide polymorphi柳〉，即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單械基變異引毎的DNA 多態(tài)牲，被逮傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異弓l起的DNA序列多態(tài)性， 包^IMiyS轉換、頫換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中條為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占 大約90%,這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感 性、和對環(huán)境因素、藥物反應的差異。w25487是位于第19號染色體XRCC1基因上的一個G/A多態(tài)，引起XRCC1基因 {9的蛋白第399 個M酸由A堪變?yōu)镚ln。 Aig399GIn位于第10號外顯子，XRCC1蛋白BCRTI區(qū)域.在世界人群中的該 多態(tài)的頻率分布，G占0.72， A占0,28左右。中國人群中的分布G為O.幼，A為0.32。分子生物，究表 明，XRCC1基因上第399號豕基酸A屯"Gln的替代加強XRCC1蛋白與DNA-致痛物加合物的結合能力， 從面彩響個體的腫痛易感性。通過大ft對于大規(guī)模人群的肺癌病例對照研究，XRCC1的399氨基酸突變 位點在傲單因素分析時與肺痛發(fā)生相關，但是分層分析后發(fā)現(xiàn)在大童吸煙的人群中，肺痛發(fā)病風險降低， ra25487位點攜帶A型即為肺痛易感型..發(fā)明內(nèi)容基于XRCC1基因上的is25487號SNP位點可用來評估個體對肺痛的易感性的基礎上，本發(fā)明提供一 種植測胂痛易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測XRCC1基因SEQ ID NO: 1中第156位SNP的特異性引物對及特異性熒光探針、 T叫,、dNTP混合液、MgCl,溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點而設計，麟異性擴增 出SEQ ID NO: 1中包含第156位SNP位點的DNA片段的引物對，設計這類引物對是本領域技術人員能壤 輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對。特異性引物對可用常規(guī) 的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引物.本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點而設計，能通過熒光 定懸PCR技術特異性檢測出這個SNP位點肺痛易感基因型的探針。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕 易完成的，優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探針。特異性熒光探針可用常規(guī) 的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有可用 f熒光定1: PCR檢測SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含董包括10 X熒光定楚PCR反應緩沖液， O.lfil 25nM dNTP混合液， 0.6|il 25nM MgCl,溶液， 0.025(il (5units/|U) T叫咖A聚合酶， 幼HM特異性引物對(兩條)各0.225!11. 10nM特異性熒光探針0.25ji1, 去離子水5. 575|U。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20iC。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件，實簾例l.檢測試劑盒的使用 步 1: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組咖A。 步，2:熒光定1;PCR反應使用可檢擁肺癌易感性的熒光定JtPCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針 有義引物5， - TAACTGGCATCTTCACTTCT -3'(SEQ ID NO: 2)加值為56卩 反義引物5' - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3' (SEQ ID NO: 3) Tn值為581C 熒光探針5' - CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3' (SEQ ID NO: 4) Tta值為641C熒光定i PCR反應體系為總體積10 il，包含濃度為20ng/jil的DNA模板2ji1、 10 X熒光定量PCR 反應級沖液、0. 25aM cfl4TP泡合液、0.6^1 25nM l^Cl, JfiFfK、 0. 025fil (5units/(il) T叫IMA'聚合,、 20HM的有義引物和反義引物各0.225ni、 10|Ui的熒光探針0.25jU，去離子水5* 575jil。在ABI9700型PCR擴増儀上進行反應，反應條件為501C、 2分鐘，訴1C、 10分鐘，進行抑個循環(huán)的 訴1C、 30秒，601C、 l分鐘。反應結束后在旭I7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。 步驟3: SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針^的熒光倌號明顯離于正 常對照，說明被檢測DNA的XRCC1基因上ra25487號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺痛易鵬，實旌例2.指導人們主動，腫痛的服務目前在上海主鏈生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項服務。 步，l: DNA提取對被檢9H者進行股務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習憤問巻調(diào)査表，依照取樣盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅am附法進行口腔上飾通的咖A抽提.步驟2:基因分型檢新使用本發(fā)明提供的試劑盒,對被檢測者DNA的XRCC1基因上的rs25487號SNP位點進行熒光定量PCR 檢翻，確定該SNP位點的基因型。步驟3:指導人們主動預防肺痛通過對被檢潿者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測報吿和被檢測者個體化ttiK掛導報吿，基因檢 淵挺吿詳細說明了被檢淵者肺癌易感程度的布低以及患病的概率大小。個體化tt康賴導報告以lfett翻者的 基困分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問巻調(diào)査結果，評估被檢測者Mi痛逮傳易感的相對風險， 同時制定出針對于被檢淵者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等，并 為被檢測者普及預防肺癌的健康知識。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<1加> 一種通過XRCC1基因檢測肺痛易感性的試劑盒〈160> 4<210> <211> <212> <213>1300 咖A 人屬,<柳> 1agatcacaccccccaagtacggactgtcacctgctccttagc卿cggag人種(Homo sapiens, human)taactggcat cttcacttct gccccccacc agctgtgcct ttgcc幼cac 60agccaggtcc t鄉(xiāng)cctggg aggccgcatc gtgcgta鄉(xiāng)agtgggtgct 120cgcatgcgtc ggcggctgcc ctcccggagg taaggcctca cacgccaacc 180tcctgtgctg ggcaatgcca gg幼tctgga ggggagtcag actggggcct 240幼cacaggtg gtcccagccc agagccagca gactactgag鄉(xiāng)agcgggg 300<210> <211> <212> <213>2加 DNA人工序列<220><223>引物 <柳> 2taact鵬at cttcacttct 20<210> <211> <212> <213>319DNA人工序列<220> <223>引物<柳> 3tocagattcc tggcattgc 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列<2加><223>探針 <柳> 4cggctgccct cccag鄉(xiāng) 18
權利要求
1.一種用于檢測肺癌易感性的試劑盒，其特征在于包括檢測XRCC1基因SEQ ID NO1中第156位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對SEQIDNO: 1中第156 位SNP位點而設計，麟異性擴増出包含SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對SEQ IDNO, 1中第 156位SNP位點而設計，能通過熒光定愛PCR技術特異性檢測出該SNP位點肺痛易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: 2和3所 示序列的引物對，
5. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的特異性熒光探針選自.具有SEQ IDN(h 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量FCR反 應緩沖液，0. l(il 25nM dNTP泡合液，0.6fil 25oM MgCl,溶液，0.025ril (5units/ il) T叫DNA豳合糖， 20一特異性引物對(兩條〉各0.225(il， 10jiM特異性熒光探針0.25ji1,去離子水5.575jxl。本試劑盒供 —人份檢擁應用，試劑盒的保存溫度為-201C.
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測XRCC1基因SEQ ID NO1中第156位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測分析個體的XRCC1基因上SNP位點基因攜帶型來預測個體對肺癌的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101130811SQ20061003038
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司