專利名稱：一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)用酶制劑的制備方法，特別涉及工業(yè)用漆酶的制備方法，確切地說是一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法。
背景技術：
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物發(fā)生氧化，同時伴隨有氧還原成水。漆酶廣泛存在于植物、細菌、昆蟲，特別是白腐真菌中。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿、食品風味的改良、飼料營養(yǎng)的改善、紡織染料的降解與轉化、紡織纖維的柔化、新型藥物開發(fā)、新型生物傳感器的研制及新型能源開發(fā)等領域具有重要(潛在)應用價值[洪宇植等(2005)生物工程學報21547-552；Xiao YZ et al(2006)Appl Microbiol Biotechnol 71493-501]，近年來成為國際酶工程學和環(huán)境科學交叉領域研究的一個熱點。
目前，真菌漆酶的生產(chǎn)大多在人工合成培養(yǎng)基中進行，需要芳香類化合物和(或)重金屬離子的誘導[Xiao YZ et al(2004)Mycologia 9626-35]。這些誘導物具有毒性，添加后使得發(fā)酵液后處理難度大、成本高，易造成環(huán)境污染。多年來，國內(nèi)外學者一直關注和致力于漆酶合成方法的探索，并取得了進展(如固態(tài)發(fā)酵和異源表達)。固態(tài)發(fā)酵技術能夠緩解酶生產(chǎn)的污染問題，然而其發(fā)酵周期過長(一般超過20天)；漆酶基因在多個不同宿主中異源表達的產(chǎn)量也普遍低于野生菌[Hong YZ et al(2006)FEMS Microbiol Lett 25896-101]，這些限制了漆酶的產(chǎn)業(yè)化進程。
靈芝(Ganoderma)具有重要的藥用價值和保健功能，以往的研究主要圍繞這兩個功能展開，而關于靈芝漆酶的應用研究尚不多見。在國內(nèi)，張曉昱等將平菇(Pleurotus sp.)與靈芝(Ganoderma sp.)混合培養(yǎng)進行固態(tài)發(fā)酵，漆酶酶活達到2,165U/g(ABTS法)[黃慧艷等(2004)中國食用菌2331-33]；王歲樓等將Ganoderma lucidum Karst No.1進行突變，突變株G301的最高漆酶產(chǎn)量為355U/L(愈創(chuàng)木酚法)[王歲樓等(2006)食品科學2753-57]。國際上也有關于靈芝漆酶的研究報道[Trevor M et al(1999)Appl Environ Microbiol 655307-5313]，較為突出的是，Ganoderma adspersum液體發(fā)酵14天的漆酶產(chǎn)量達到34,000U/L(ABTS法)[songulashvili G et al(2006)Biotechnol Lett 281425-1429]。在這些研究中，漆酶的產(chǎn)量較低，難以達到商業(yè)化應用的需求。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于已有技術存在的不足，本發(fā)明旨在提供一種高效、環(huán)保、廉價地生產(chǎn)真菌漆酶的方法，所要解決的技術問題是選擇優(yōu)良的真菌菌株為材料在環(huán)保、廉價的培養(yǎng)基中高效地發(fā)酵生產(chǎn)靈芝漆酶。
所述的優(yōu)良菌株為真菌菌株樹舌靈芝ST(Ganoderma applanatum ST)，由申請人自主選育。
所述的環(huán)保、廉價的培養(yǎng)基是用天然農(nóng)副產(chǎn)品配制得到的液體培養(yǎng)基。
本生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)基配制、種液制備、滅菌、接種、發(fā)酵、酶分離和后處理，其特征在于將樹舌靈芝ST種液接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃培養(yǎng)3～8天，最后分離得到工業(yè)用漆酶制劑。發(fā)酵培養(yǎng)基有以下組分和重量百分數(shù)玉米粉0.1％～5％，糧食麩皮1％～7％，花生餅粉1％～7％，余量為自來水，培養(yǎng)基pH3～8。
優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉0.2％～3％、糧食麩皮2％～5％、花生餅粉2％～5％、余量為自來水，培養(yǎng)基pH3～8。
所述的糧食麩皮選自麥麩皮、大米皮糠等，可單獨使用，也可混合使用，優(yōu)選麥麩皮。
進一步優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉0.7％，麥麩皮3％，花生餅粉3％，余量為自來水，培養(yǎng)基pH5～6。
所述的種液制備就是將樹舌靈芝ST接種在上述培養(yǎng)基中于22～35℃、100～200r/min培養(yǎng)3～6天，然后將種液按1～15％(體積分數(shù))接種量接入同樣的培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)制備漆酶。
分離得到的漆酶制劑或凍干貯藏，或經(jīng)稀釋后直接應用于食品、飲料、紡織印染、污水處理等工業(yè)領域。但若應用于生物傳感器等高技術領域則需進一步純化制備純漆酶制劑。
所述的純化在低溫下進行，將粗酶制劑經(jīng)離心分離、超濾濃縮、透析和柱層析處理制備純漆酶制劑。
本發(fā)明在漆酶生產(chǎn)過程中使用的菌株為靈芝(具有保健功能)，所用的培養(yǎng)基成分為常見的農(nóng)副產(chǎn)品，其發(fā)酵廢渣可用作高蛋白類飼料。本發(fā)明發(fā)酵獲得的漆酶活力在9,000U/L以上(愈創(chuàng)木酚法)，目前該產(chǎn)量處于漆酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)法的國際領先水平。與其它研究相比，本發(fā)明生產(chǎn)漆酶具有以下優(yōu)點(1)培養(yǎng)基組分簡單、廉價且來源廣泛；(2)酶合成無需毒性物質(zhì)誘導，發(fā)酵產(chǎn)物可循環(huán)利用，后加工處理簡便，基本無環(huán)境污染；(3)酶產(chǎn)率高、發(fā)酵周期短，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
申請人自主選育的樹舌靈芝ST(Ganoderma applanatum ST)已于2006年09月18日送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM206100。
四.
具體實施例方式
1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備玉米、麩皮和花生餅用粉碎機粉磨成粉末，過60～200目篩后使用效果更佳。
(1)取玉米粉0.2份、糧食麩皮2份、花生餅粉2份，自來水95.8份，檸檬酸調(diào)pH4，121℃滅菌30～50min，備用。
(2)取玉米粉3份、糧食麩皮5份、花生餅粉5份，自來水87份，檸檬酸調(diào)pH5，121℃滅菌30～50min，備用。
(3)取玉米粉0.2份、麥麩皮5份、花生餅粉5份，自來水89.8份，檸檬酸調(diào)pH5，121℃滅菌30～50min，備用。
(4)取玉米粉3份、大米皮糠2份，花生餅粉2份，自來水93份，氨水調(diào)pH8，121℃滅菌30～50min，備用。
(5)取玉米粉0.3份、麥麩皮3份、大米皮糠1份，花生餅粉3份，自來水92.7份，氨水調(diào)pH8，121℃滅菌30～50min備用。
(6)取玉米粉2份、大米皮糠2份，麥麩皮1份，花生餅粉4份，自來水91份(自然pH)，121℃滅菌30～50min備用。
(7)取玉米粉0.7份、麥麩皮3份，花生餅粉3份，自來水93.3份(自然pH)，121℃滅菌30～50min備用。
2、樹舌靈芝ST種液的制備在土豆培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基20％土豆汁、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、0.4g維生素B，加1.5％瓊脂制成固體培養(yǎng)基)斜面上4℃保存的樹舌靈芝ST接種于已高溫滅菌的上述(1)～(7)的任一發(fā)酵培養(yǎng)基中，22～35℃、100～200r/min培養(yǎng)3～6天，即制成種液。
3、接種與發(fā)酵培養(yǎng)將制備的樹舌靈芝ST種液按1～15％體積分數(shù)接種于已滅菌的上述(1)～(7)的任一發(fā)酵培養(yǎng)基中，100～200r/min、22～35℃培養(yǎng)3～8天至產(chǎn)酶高峰。以愈創(chuàng)木酚為底物測定漆酶活力的方法參照文獻[洪宇植等(2005)生物工程學報21547-552]。
4、酶分離與純化在漆酶活力達到高峰時，發(fā)酵液經(jīng)過濾去除菌體和廢渣，濾液即是漆酶粗制劑。濾液或者冷凍干燥后貯藏備用，或者加水適當稀釋后直接用于食品飲料業(yè)、紙漿漂白、工業(yè)染料脫色(特別是紡織染料)、紡織纖維軟化、飼料加工等領域。
粗酶制劑依次按下述步驟可獲得純酶，所有操作在4～10℃進行①6,000g離心10min，上清液超濾濃縮10～50倍；②上清液在2mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH8.0)透析3～6小時，然后10,000g離心10min；③上清液上預先用透析液平衡的DEAE-SepharoseFF離子交換柱，并用0～0.3mol/L的硫酸銨進行梯度洗脫，活性組分脫鹽后用滅菌水(或去離子水)稀釋，即可獲得純酶制劑(純酶制劑除了可用于上述粗酶的應用領域外，還能用于生物傳感器等研究)。
5、發(fā)酵后處理由于菌株和培養(yǎng)基對人畜均安全，且過濾出的菌體和廢渣含有豐富的營養(yǎng)成分，因此可用作飼料。
6、具體操作例(1)、玉米、麥麩和豆餅粉碎后過60目篩，按玉米粉0.7％，麥麩皮3％，花生餅粉3％的比例配比，余量為自來水(自然pH5～6)，配制后于121℃滅菌40min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
(2)、從樹舌靈芝ST的保藏斜面挑取兩塊約1cm2的菌絲塊，接種到裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，130r/min、28℃培養(yǎng)4天至漆酶活力達到700～1500U/L，制成種液。按8％的體積分數(shù)將種液接種到350mL新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基(1L三角瓶)中，繼續(xù)培養(yǎng)5天，酶活在9,000U/L(愈創(chuàng)木酚法)以上。
(3)、發(fā)酵液用八層紗布過濾去除菌體和廢渣，濾液即是粗漆酶制劑。濾液經(jīng)超濾濃縮凍干以便貯存，或加水稀釋直接用于食品飲料業(yè)、紙漿漂白、染料脫色、污水處理、纖維軟化、飼料加工、酒精生產(chǎn)等。若需進一步純化得到純漆酶制劑，按“4、酶分離與純化”中所述的純化步驟進行處理。菌體和廢渣用作飼料。
權利要求
1.一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法，以樹舌靈芝ST為出發(fā)菌株，包括培養(yǎng)基配制、種液制備、滅菌、接種、發(fā)酵、酶分離和后處理，其特征在于將樹舌靈芝菌株接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃培養(yǎng)3～6天制備種液，然后將該種液接種到同樣的發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃繼續(xù)培養(yǎng)3～8天，最后分離得到漆酶制劑；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基有以下組分和重量百分數(shù)玉米粉0.1％～5％、糧食麩皮1％～7％、花生餅粉1％～7％，水余量，pH3～8。
2.根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基各組分重量百分數(shù)為玉米粉0.2％～3％、糧食麩皮2％～5％、花生餅粉2％～5％，水余量，pH3～8。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基各組分重量百分數(shù)為玉米粉0.7、麥麩皮3％、花生餅粉3％，水余量，pH5～6。
4.根據(jù)權利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于玉米粉、糧食麩皮、花生餅粉細度過60～200目篩。
全文摘要
一種靈芝漆酶的清潔高效生產(chǎn)方法，以申請人自主選育的樹舌靈芝ST為出發(fā)菌株，將其先接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中制備種液，再將種液接種到同樣的發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～35℃培養(yǎng)3～8天，分離后得到漆酶制劑。發(fā)酵培養(yǎng)基由0.1～5％的玉米粉，1～7％的糧食麩皮、1～7％的花生餅粉和余量水組成。本方法生產(chǎn)的漆酶活力在9000U/L以上(愈創(chuàng)木酚法)，該產(chǎn)量處于漆酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)法的國際領先水平。培養(yǎng)基為農(nóng)副產(chǎn)品，無毒、廉價、無污染。本方法工藝簡單、周期短、產(chǎn)率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK1935992SQ200610096638
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權日2006年10月13日
發(fā)明者洪宇植, 肖亞中, 李妍妍, 王林, 房偉 申請人:安徽大學