一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法。所述方法的具體步驟為：1)配制測活液；2)測定Trx標(biāo)準(zhǔn)曲線；3)測活步驟：取樣品和測活液放入孔中，在37℃下反應(yīng)1小時，并測定各孔樣品在反應(yīng)前后520nm處的熒光強(qiáng)度；樣品中的Trx活性＝(反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度–反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度)×稀釋倍數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出樣品中活性Trx含量；用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度，計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的Trx活力單位。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明樣本需求量少，特別適合血清、血漿檢測，簡化了檢測操作步驟，降低了因檢測程序復(fù)雜引入的檢測結(jié)果的離散性、提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【專利說明】
一種熒光増效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及到一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硫氧還蛋白(Trx)存在于所有活細(xì)胞中，與細(xì)胞生長與存活密切相關(guān)。硫氧還蛋白也會分泌到細(xì)胞外，存在于血液及細(xì)胞外液中。該蛋白活性變化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，硫氧還蛋白ELISA試劑盒，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，依靠抗原、抗體的特異性反應(yīng)，檢測硫氧還蛋白的蛋白水平。然而，硫氧還蛋白極易被體內(nèi)的代謝物、中間產(chǎn)物修飾改變活性，組織和細(xì)胞中硫氧還蛋白的蛋白水平，不能確切地反映硫氧還蛋白的功能狀態(tài)。此外，ELISA試劑盒有獨特的組織特異性，實驗中可能用到不同來源的樣本，需要辨別哪種ELISA試劑盒能測手中的樣本。至今，實驗室研究中，硫氧還蛋白的測活方法主要有兩種:胰島素測活法(Luthman,B1chemistry 21:6628-6633 ； 1982.)、終點法(Arner ,Methods Enzymol300:226-239.； 1999.)及改良后的終點法(Wu，Y.Atherosclerosis 212:351-355;2010.)。胰島素測活法，適合酶動力學(xué)研究，不適合大批量樣本的測定。終點法及改良后的終點法，各實驗室所用的條件及標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，步驟較復(fù)雜，所測得的結(jié)果難以比較。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種高靈敏度、高效且簡便的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法。
[0004]本發(fā)明所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，所述檢測方法采用四種試劑，分別為檢測緩沖液、酶溶液、底物液和標(biāo)準(zhǔn)品；所述檢測緩沖液為NADPH、磷酸鉀緩沖液;所述標(biāo)準(zhǔn)品為人硫氧還蛋白；所述酶溶液為牛硫氧還蛋白還原酶溶液;所述底物液為牛胰島素溶液；
[0005]所述方法的具體步驟為:
[0006]I)配制測活液:現(xiàn)取檢測緩沖液0.978ml、酶溶液0.09ml、底物液1.632ml，混合配制成測活液；
[0007]2)測定硫氧還蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:取檢測緩沖液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白質(zhì)量濃度為0.1%，得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液;將人硫氧還蛋白用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成0、1、2、3、4、5yg/ml六個濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)液樣品；每個濃度標(biāo)準(zhǔn)液樣品取20μ1，進(jìn)行測活操作;計算每一個標(biāo)準(zhǔn)液樣品在反應(yīng)前后在520nm處的熒光強(qiáng)度值之差，并制作出Δ A52Qnm對人硫氧還蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0008]3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出樣品中活性人硫氧還蛋白含量；用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度，計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的人硫氧還蛋白活力單位。
[0009]所述的測活操作為:取多個酶標(biāo)條，固定于酶標(biāo)條專用架上，分別設(shè)置對照孔和實驗孔，每份樣品需要I個對照孔和2個實驗孔，記錄各孔位置;實驗孔中，取樣品20μ1和測活液30μ1放入孔中，在37 0C下反應(yīng)I小時;對照孔中，放置樣品20μ1，作為反應(yīng)前樣品；設(shè)定熒光酶標(biāo)儀的激發(fā)光為480nm，發(fā)射光為520nm，測定各孔樣品在反應(yīng)前后520nm處的焚光強(qiáng)度;樣品中的人硫氧還蛋白活性=(反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度-反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度)X稀釋倍數(shù)。
[0010]本發(fā)明所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，所述血清白蛋白為人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
[0011 ]將所述的檢測緩沖液、酶溶液、底物液和標(biāo)準(zhǔn)品分別盛裝入容量依次為2ml、ΙΟΟμ1、1.7ml及200μ1的塑料試劑瓶或EP管中，然后置于包裝盒內(nèi)得到熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測試劑盒。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法的樣本需求量少，僅需20μ1血清、血漿，特別適合血清、血漿檢測，能非常專一地檢測人血清或血漿硫氧還蛋白活性，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在O?80ng;而且進(jìn)一步簡化了檢測操作步驟，更好地滿足自動檢測設(shè)備基本流程配置的需要，進(jìn)一步降低了因檢測程序復(fù)雜引入的檢測結(jié)果的離散性、提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。其解決了硫氧還蛋白活性檢測試劑盒不適用于現(xiàn)行常用自動檢測設(shè)備基本流程配置需要的問題，而且顯著提高了檢測靈敏度。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0014]實施例1
[0015]—種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，所述檢測方法采用四種試劑，分別為檢測緩沖液、酶溶液、底物液和標(biāo)準(zhǔn)品；所述檢測緩沖液為NADPH、磷酸鉀緩沖液;所述標(biāo)準(zhǔn)品為人硫氧還蛋白(hTrxl);所述的檢測緩沖液中NADPH的濃度為2mM，磷酸鉀濃度為250mM;所述酶溶液為濃度5μΜ的牛硫氧還蛋白還原酶溶液;所述底物液為10mg/mL的牛胰島素溶液；
[0016]所述方法的具體步驟為:I)配制測活液:現(xiàn)取檢測緩沖液0.978ml、酶溶液0.09ml、底物液1.632ml，混合配制成測活液；
[0017]2)測定硫氧還蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:取檢測緩沖液，在其中加入人血清白蛋白，使人血清白蛋白質(zhì)量濃度為0.1%,得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液;將人硫氧還蛋白用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成O、1、2、
3、4、5yg/ml六個濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)液樣品；每個濃度標(biāo)準(zhǔn)液樣品取20μ1，進(jìn)行測活操作;計算每一個標(biāo)準(zhǔn)液樣品在反應(yīng)前后在520nm處的焚光強(qiáng)度值之差，并制作出△ A52Qnm對人硫氧還蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018]所述的測活操作為:取多個酶標(biāo)條，固定于酶標(biāo)條專用架上，分別設(shè)置對照孔和實驗孔，每份樣品需要I個對照孔和2個實驗孔，記錄各孔位置;實驗孔中，取樣品20μ1和測活液30μ1放入孔中，在37 0C下反應(yīng)I小時;對照孔中，放置樣品20μ1，作為反應(yīng)前樣品；設(shè)定熒光酶標(biāo)儀的激發(fā)光為480nm，發(fā)射光為520nm，測定各孔樣品在反應(yīng)前后520nm處的焚光強(qiáng)度;樣品中的人硫氧還蛋白活性=(反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度-反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度)X稀釋倍數(shù)；
[0019]3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出樣品中活性人硫氧還蛋白含量；用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度，計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的人硫氧還蛋白活力單位。
[0020]將上述檢測緩沖液、酶溶液、底物液和標(biāo)準(zhǔn)品分別盛裝入容量依次為2ml、ΙΟΟμΙ、1.7ml及200μ1的塑料試劑瓶中，然后置于包裝盒內(nèi)得到熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測試劑盒。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測的樣本需求量少，僅需20μ1血清、血漿，特別適合血清、血漿檢測，能非常專一地檢測人血清或血漿硫氧還蛋白活性，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在O?80ng;而且進(jìn)一步簡化了檢測操作步驟，更好地滿足自動檢測設(shè)備基本流程配置的需要，進(jìn)一步降低了因檢測程序復(fù)雜引入的檢測結(jié)果的離散性、提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。其解決了硫氧還蛋白活性檢測試劑盒不適用于現(xiàn)行常用自動檢測設(shè)備基本流程配置需要的問題，而且顯著提高了檢測靈敏度。
【主權(quán)項】
1.一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，其特征在于，所述檢測方法采用四種試劑，分別為檢測緩沖液、酶溶液、底物液和標(biāo)準(zhǔn)品；所述檢測緩沖液為NADPH、磷酸鉀緩沖液;所述標(biāo)準(zhǔn)品為人硫氧還蛋白；所述酶溶液為牛硫氧還蛋白還原酶溶液;所述底物液為牛胰島素溶液； 所述方法的具體步驟為: .1)配制測活液:現(xiàn)取檢測緩沖液0.978ml、酶溶液0.09ml、底物液1.632ml，混合配制成測活液； .2)測定硫氧還蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:取檢測緩沖液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白質(zhì)量濃度為0.1%，得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液;將人硫氧還蛋白用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成0、l、2、3、4、5yg/ml六個濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)液樣品；每個濃度標(biāo)準(zhǔn)液樣品取20μ1，進(jìn)行測活操作;計算每一個標(biāo)準(zhǔn)液樣品在反應(yīng)前后在520nm處的熒光強(qiáng)度值之差，并制作出A A52Qnm對人硫氧還蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線； .3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出樣品中活性人硫氧還蛋白含量；用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度，計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的人硫氧還蛋白活力單位。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，其特征在于，所述的測活操作為:取多個酶標(biāo)條，固定于酶標(biāo)條專用架上，分別設(shè)置對照孔和實驗孔，每份樣品需要I個對照孔和2個實驗孔，記錄各孔位置;實驗孔中，取樣品20μ1和測活液30μ1放入孔中，在37°C下反應(yīng)I小時;對照孔中，放置樣品20μ1，作為反應(yīng)前樣品；設(shè)定熒光酶標(biāo)儀的激發(fā)光為480nm，發(fā)射光為520nm，測定各孔樣品在反應(yīng)前后520nm處的熒光強(qiáng)度;樣品中的人硫氧還蛋白活性=(反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度-反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度)X稀釋倍數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，其特征在于，所述血清白蛋白為人血清白蛋白或牛血清白蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測方法，其特征在于，將所述的檢測緩沖液、酶溶液、底物液和標(biāo)準(zhǔn)品分別盛裝入容量依次為2ml、ΙΟΟμΙ、1.7ml及200μ1的塑料試劑瓶或EP管中，然后置于包裝盒內(nèi)得到熒光增效的高通量硫氧還蛋白活性檢測試劑盒。
【文檔編號】G01N21/64GK106092998SQ201610683460
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月17日 公開號201610683460.8, CN 106092998 A, CN 106092998A, CN 201610683460, CN-A-106092998, CN106092998 A, CN106092998A, CN201610683460, CN201610683460.8
【發(fā)明人】梁巍, 劉軍, 杜澄
【申請人】北京中科研源科技發(fā)展有限公司