專利名稱：：包含非天然編碼的氨基酸的人生長激素配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有hGH多肽的穩(wěn)定人生長激素(hGH)配方，所述多肽包含與聚(乙二醇)(PEG)共價連接的非天然氨基酸。
背景技術(shù)：
：人生長激素參與許多有關(guān)正常人類生長和發(fā)育的調(diào)控。這一天然產(chǎn)生的單鏈垂體激素是由191個氨基酸殘基組成，并且具有約22kDa的分子量。hGH展現(xiàn)出多種生物作用，包括線性生長(體質(zhì)形成)、泌乳、巨噬細(xì)胞活化和類胰島素作用與致糖尿病作用等(Chawla,R.等人，34:519-547(1983);Isaksson,O.等人'^"".Zev.47:483-499(1985);Hughes,J.和Friesen,H.,爿朋.P/ywo/.，47:469-482(1985))。眾所周知hGH的結(jié)構(gòu)(Goeddel,D.等人,淑騰281:544-548(1979))，并且hGH的三維結(jié)構(gòu)已通過X射線晶體學(xué)解釋(deVos,A.等人，Sc/ewce255:306-312(1992))。所述蛋白質(zhì)具有致密的球狀結(jié)構(gòu)，包含通過環(huán)連接的四個兩親a螺旋束，從N末端起始稱為A-D。關(guān)于hGH(包括其受體和變異體)和其他GH總科成員的進(jìn)一步論述提供于標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專禾U申請案第11/046,432號禾口標(biāo)題為"ModifiedHumanFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses，，的PCT國際專利申請案第PCT/US05/03537號中，所述專利都是以其全文引用的方式并入本文中。重組體hGH可作治療用，并且已批準(zhǔn)用于治療多種適應(yīng)癥。舉例而言，hGH缺乏將引起侏儒癥，十多年來，已通過外部投與所述激素成功地治療所述病癥。除hGH缺乏夕卜，也已批準(zhǔn)將hGH用于治療腎衰竭(兒童腎衰竭)、特納氏綜合癥(Turner'sSyndrome)和AIDS患者的惡病質(zhì)。近來，美國食品和藥品監(jiān)督局(FoodandDrugAdministration,FDA)已批準(zhǔn)將hGH用于治療非GH依賴性身材矮小。目甜，也正在對hGH治療衰老、老年人虛弱、短腸綜合癥和充血性心力衰竭進(jìn)行研究。hGH治療的目標(biāo)群體包括患有特發(fā)性身材矮小(ISS)的兒童和具有類GHD癥狀的成年人。目前，重組hGH當(dāng)今是作為可每日注射的產(chǎn)品銷售，且當(dāng)今市場上的五種主要產(chǎn)品為HumatropeTM(EliLilly&Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)禾[]Saizen/SerostimTM(Serono)。然而，使用生長激素作為治療劑的主要問題在于，所述蛋白質(zhì)在活體內(nèi)具有短半衰期，且因此必須通過每日皮下注射投藥來使其發(fā)揮最大效用(MacGillivray等人，J.C"w.五"心cn'"o/.Afe^^.81:1806-1809(1996))。相當(dāng)多的成就集中在通過降低制造成本、使得更易于向患者投藥、改良功效和安全性概況和引起將提供競爭優(yōu)勢的其他特性來改良投與hGH激動劑和拮抗劑的方式。舉例而言，Genentech和AlkermesNutropin曾在市場上銷售Depot,即一種適用于兒科生長激素缺乏的儲槽式hGH配方。盡管所述儲槽允許較不頻繁地投藥(每2-3周一次而非每日一次)，但也伴有不合需要的副作用，諸如降低的生物利用度和注射部位疼痛，且因此已于2004年退出市場。另一種產(chǎn)品Pegvisomant(Pfizer)也已于近期獲FDA批準(zhǔn)。PegvisomantTM是一種經(jīng)基因工程設(shè)計的hGH類似物，其對于治療肢端肥大癥起到高選擇性生長激素受體拮抗劑的作用(vanderLely等人，r&358:1754-1759(2001))。盡管PegvisomantTM中的若干氨基酸側(cè)鏈殘基都已經(jīng)聚乙二醇(PEG)聚合物衍生化，但仍需每日一次投與所述產(chǎn)品，此表明醫(yī)藥特性未達(dá)到最佳。除PEG化和儲槽式配方外，包括hGH吸入劑型和口服劑型的其它投藥途徑也正處于早期前臨床和臨床研究中，并且都尚未獲得FDA的批準(zhǔn)。因此，需要一種展現(xiàn)生長激素活性而且也提供較長血清半衰期且因此具有更優(yōu)的hGH治療水平和增加的治療半衰期的多肽。與親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫為PEG)共價連接是一種增加包括蛋白質(zhì)、肽和尤其疏水性分子的多個生物活性分子的水溶性、生物利用度；增加其血清半衰期；增加其治療半衰期；調(diào)節(jié)其免疫原性；調(diào)節(jié)其生物活性；或延長其循環(huán)時間的方法。已將PEG廣泛用于醫(yī)藥、人工移植物以及生物可相容性、無毒性和無免疫原性具有重要性的'其它應(yīng)用中。為使PEG的所需特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高，從而賦予通常與PEG聚合物連接相關(guān)的有利特性，諸如增加的水溶性和循環(huán)半衰期，同時也不會對母體分子的生物活性造成不利影響。近來，已對蛋白質(zhì)科學(xué)中的整個新技術(shù)進(jìn)行報導(dǎo)，其將有望克服與蛋白質(zhì)位點特異性修飾有關(guān)的許多缺點。具體說來，已將新組份加入原核生物大腸桿菌(^c/^hc/^aco/z',￡.co/O(例如，L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核生物釀酒酵母(S(3cc/zramycescereWw'ae，5"cereWw'ae)(例如，J.Chin等人，ScisncG301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器中，其已使得能夠于活體內(nèi)將非基因編碼的氨基酸并入到蛋白質(zhì)中。使用這一方法，已對琥珀密碼子TAG起反應(yīng)以高保真度將大量具有新穎化學(xué)、物理或生物學(xué)特性的新氨基酸有效地并入Eco"和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述氨基酸包括光親和性標(biāo)記和光敏異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看Chin,J.W.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024;禾口Chin,J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如參看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002)，ChemBioChem3(11):1135-1137;J,W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;禾口L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。所有參考文獻(xiàn)都是以其全文引用的方式并入本文。這些研究己證實，可能選擇性地且常規(guī)地引入未見于蛋白質(zhì)中、對見于20種常見、基因編碼的氨基酸中的所有官能團(tuán)具化學(xué)惰性且可用于有效且選擇性反應(yīng)形成穩(wěn)定共價鍵的化學(xué)官能團(tuán)，諸如酮基、炔基和疊氮基部分。將非基因編碼的氨基酸并入蛋白質(zhì)的能力允許引入可向天然存在的官能團(tuán)(諸如賴氨酸的s-NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸的亞氨基等)提供有價值的替代選擇的化學(xué)官能團(tuán)。人生長激素配方可為需要復(fù)水的凍干制劑或水性配方。每小瓶ProtropinTMhGH是由復(fù)水成pH7.8的5mghGH、40mg甘露糖醇、O.lmg磷酸二氫鈉、1.6mg磷酸二氫鈉組成(Physician'sDeskReference,MedicalEconomicsCo,,Orawell,N丄,第1049頁，1992)。每小瓶HumatropehGH是由復(fù)水成pH7.5的5mghGH、25mg甘露糖醇、5mg甘氨酸、1.13mg磷酸二氫鈉組成(Physician'sDeskReference,第1266頁，1992)。水性人生長激素配方的實例描述于美國專利第5,763,394號；第5,981,485號；第6，448，225號；和美國專利公開案第2003/0013653號中，所述專利的每一者都是以引用的方式并入本文中。有關(guān)生長激素配方的基本綜述，參看Pearlman等人，CurrentCommunicationsinMolecularBiology,D.Marshak禾口D.Liu編輯，第23-30頁，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989，所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。有關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的其它引人關(guān)注的公開案如下。美國專利第4,297,344號(其是以引用的方式并入本文)揭示通過加入所選擇的氨基酸(諸如甘氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、谷氨酰胺和氨基丁酸)和碳水化合物(諸如單醣、寡醣或糖醇)來使凝血因子II和VIII、抗凝血酶m和纖溶酶原耐熱穩(wěn)定。美國專利第4,783,441號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種通過加入多達(dá)500ppm包含在pH6.8-8.0下具有交替弱親水性和弱疏水性區(qū)域的鏈的表面活性物質(zhì)來防止蛋白質(zhì)(諸如胰島素)在水溶液界面處變性的方法。美國專利第4,812,557號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種使用人血清白蛋白使白細(xì)胞介素-2穩(wěn)定的方法。歐洲專利申請公開案第0303746號(其是以引用的方式并入本文)揭示用由非還原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Fkoll組成的多元醇、氨基酸、在生理pH值下具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物和膽堿鹽使生長促進(jìn)激素穩(wěn)定。歐洲專利申請公開案第0211601號(其是以引用的方式并入本文)揭示使生長促進(jìn)激素在由含有聚氧乙烯-聚氧丙烯單元且具有約U00到約40,000的平均分子量的嵌段共聚物所形成的凝膠基質(zhì)中穩(wěn)定。歐洲專利申請公開案第0193917號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種以蛋白質(zhì)與碳水化合物的復(fù)合物的水溶液為特征用于減緩釋放的生物活性組合物。國際專利公開案第89/09614號和澳大利亞專利申請案第30771/89號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種含有人生長激素、甘氨酸和甘露糖醇的穩(wěn)定醫(yī)藥配方。這類制劑在正常加工和以凍干狀態(tài)儲存以及復(fù)水后使用期間都展示出經(jīng)改良的穩(wěn)定性。美國專利第5,096,885號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種含有甘氨酸、甘露糖醇、非離子表面活性劑和緩沖劑的凍干hGH配方。美國專利第4,876,568號(其是以引用的方式并入本文)揭示可以各種穩(wěn)定劑使動物生長激素穩(wěn)定以減少水性環(huán)境中不溶物質(zhì)的形成和可溶物質(zhì)活性的保持。所述穩(wěn)定劑包括某些多元醇、氨基酸、在生理pH值下具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物和膽堿鹽。多元醇是選自由非還原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Ficoll組成的群組；氨基酸是選自由甘氨酸、肌氨酸、賴氨酸或其鹽、絲氨酸、精氨酸或其鹽、甜菜堿、N,N,-二甲基-甘氨酸、天冬氨酸或其鹽、谷氨酸或其鹽組成的群組；在生理pH值下具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物可選自聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸和其鹽；且膽堿衍生物是選自由氯化膽堿、檸檬酸二氫膽堿、酒石酸氫膽堿、碳酸氫膽堿、檸檬酸三膽堿、抗壞血酸膽堿、硼酸膽堿、葡萄糖酸膽堿、磷酸膽堿、硫酸二(膽堿)和粘液酸二膽堿組成的群組。美國專利第4,876,568號(其是以引用的方式并入本文)指出可將聚組氨酸用作動物生長激素的潛在穩(wěn)定劑，但尚未指出其使動物生長激素還是人生長激素穩(wěn)定。此外，美國專利第4,876,568號指出優(yōu)選聚-DL-賴氨酸HBr。EP374120(其是以引用的方式并入本文)揭示一種包含包括具有三個羥基的多元醇和緩沖劑的經(jīng)緩沖多元醇賦形劑的穩(wěn)定生長激素制劑，用以達(dá)成使生長激素能夠在一段足夠的時間內(nèi)保持其生物活性的pH值范圍。組氨酸被認(rèn)為是具有三個羥基的多元醇的緩沖劑。具體說來，EP374120教示可將組氨酸鹽酸鹽用作緩沖劑，以使具有三個羥基的多元醇緩沖，從而改良包含高濃度生長激素和作為穩(wěn)定劑的多元醇的溶液形式的生長激素制劑的穩(wěn)定性。此外，組氨酸鹽酸鹽必須以約3溶液重量％(對應(yīng)于約0.15M的組氨酸鹽酸鹽溶液濃度)的量加入。EP374120也教示單獨組氨酸將不賦予生長激素制劑以化學(xué)和物理穩(wěn)定性。Sorensen等人的WO93/12812(其是以引用的方式并入本文)中教示可通過組氨酸或組氨酸衍生物的存在使生長激素穩(wěn)定。如果生長激素經(jīng)凍干，那么所述組合物也可包含膨脹劑，意即糖醇、二醣和其混合物。Sorensen等人的美國專利第5,849,704號(其是以引用的方式并入本文)中揭示一種醫(yī)藥配方，其包含生長激素和作為添加劑或緩沖物質(zhì)加入以于生長激素中提供抗脫酰胺化、抗氧化或抗肽鍵裂解的穩(wěn)定性的組氨酸或組氨酸衍生物。還揭示，在組氨酸或其衍生物存在下使生長激素結(jié)晶將產(chǎn)生比己知方法制造的結(jié)晶具有更高純度的更高產(chǎn)量結(jié)晶。人生長激素變異體的配方已描述于美國專利第6,136,563號和第5,849,535號中，其是以引用的方式并入本文中。hGH通過若干降解路徑經(jīng)歷分解，包括脫酰胺、聚集、肽主鏈剪短和甲硫氨酸殘基氧化。其它產(chǎn)物是由與水溶性聚合物(諸如PEG)共價連接的hGH接合物降解產(chǎn)生。提供可接受的降解產(chǎn)物對照、已使hGH保持穩(wěn)定性一段較長時間段且對于劇烈攪動(其誘導(dǎo)聚集)穩(wěn)定的hGH醫(yī)藥配方將特別有益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供包含一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽配方。在一些實施例中，hGH多肽包含一種或一種以上翻譯后修飾。在一些實施例中，hGH多肽與連接子、聚合物或生物活性分子相連。在一些實施例中，hGH多肽與雙官能聚合物、雙功能連接子或至少一種額外的hGH多肽相連。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物相連。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸以連接子與水溶性聚合物相連或與水溶性聚合物鍵接。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，本發(fā)明為hGH多肽的單劑量凍干配方。在一些實施例中，本發(fā)明為hGH多肽的液體配方。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有介于約O.lkDa與約100kDa之間的分子量。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有介于約0.1kDa與約50kDa之間的分子量。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為分枝狀聚合物。在一些實施例中，聚(乙二醇)分枝狀聚合物的各個分枝具有介于約1kDa與約100kDa之間或介于1kDa與50kDa之間的分子量。在一實施例中，包含一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的醫(yī)藥配方包含緩沖劑、至少一種載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑和醫(yī)藥量的人生長激素(hGH)。在另一實施例中，所述至少一種載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑是選自由抗氧化劑、氨基酸、碳水化合物、螯合劑、糖醇、成鹽反離子和非離子表面活性劑組成的群組。本發(fā)明還提供以有效量的本發(fā)明的hGH分子配方治療患有由hGH介導(dǎo)的病癥的患者的方法。在本發(fā)明的一個實施例中，提供包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽配方，其使不合需要的聚集物質(zhì)的形成減到最少或引起降低生物活性或改變受體識別的化學(xué)變化。所述配方能夠保持活性一段適當(dāng)?shù)膬Υ鏁r間、易于調(diào)配，并且為向患者投與可接受。在一實施例中，包括(但不限于)PEG化hGH、包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽配方為皮下注射使用前復(fù)水的凍干配方。本發(fā)明的配方可為醫(yī)藥配方，尤其用于皮下投與的配方。在另一實施例中，本發(fā)明提供一種治療(預(yù)防性治療或治療性治療)可通過使用本文所揭示的配方調(diào)配的蛋白質(zhì)(包括但不限于經(jīng)PEG化的hGH)治療的病癥的方法。所述配方尤其可用于皮下投與。還提供一種制造物件，其包含密封本文所揭示的配方的容器以及預(yù)充式注射器。圖1繪示4'C下6周后配方緩沖液的pH值穩(wěn)定性分析。圖2繪示MetY35pAFhGH的SDS-PAGE還原性凝膠(圖2C和圖2D)和非還原性凝膠(圖2A和圖2B)。圖2A和圖2B中的凝膠裝載如下第1道MW;第2道WHOhGH;第3道WHOhGH1%;第4道Al;第5道A2;第6道A3;第7道A4;第8道A5;第9道A6;第10道A7;第ll道A8;第12道MW。圖2C和圖2D中的凝膠裝載如下第l道MW;第2道WHOhGH;第3道WHOhGH1%;第4道Bl;第5道B2;第6道B3;第7道B4;第8道B5;第9道B6;第IO道B7;第ll道B8;第12道MW。圖3A-F繪示配方組A-F的差示掃描量熱法(DSC)的熱概況。圖4繪示第B7組(圖4A)和第F2組(圖4B)的基質(zhì)的DSC熱概況。圖5提供概括全部基質(zhì)的DSC熔解溫度和Tm改變的表格。圖6繪示全部基質(zhì)的DSC熔解溫度的概要。圖7繪示對于配方組AHV/AH比率的分析。圖8繪示對于各樣本焓(AUC)改變的分析。圖9A-D繪示與WHOhGH標(biāo)準(zhǔn)品相比第B組、第C組、第E組和第F組中樣本的RP-HPLC數(shù)據(jù)集。圖10A繪示對于第E5組中不同Y35pAF峰的分析(繪制各時間點處所有峰值的相對百分比以觀察主要MetY35pAFhGH峰的任何改變和所有改變)，且圖10B繪示初級脫酰胺/氧化峰的急劇上升(放大的脫酰胺峰一脫酰胺作用隨時間變化(1=0至4周)而增加)。RP-HPLC分析是使用AgilentChemstation軟件執(zhí)行。圖11繪示對于橫過基質(zhì)的初級脫酰胺/氧化峰的分析。(對于(C下4周后MetY35pAFhGH的分析)圖12繪示對于經(jīng)配方組次級脫酰胺/氧化的峰的分析。(對于fC下4周后MetY35pAFhGH的分析)圖13繪示對于配方組主要GH峰的分析。(對于4'C下4周后MetY35pAFhGH的分析)圖14繪示對于配方組B和C中已經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)的樣本的初級脫酰胺/氧化的峰的RP-HPLC分析(對于經(jīng)5個冷凍/解凍循環(huán)后MetY35pAFhGH峰的分析)。圖15繪示對于配方組B和C中已經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)的樣本的次級脫酰胺的峰的RP-HPLC分析(對于經(jīng)5個冷凍/解凍循環(huán)后MetY35pAFhGH的分析)。圖16繪示對于配方組B和C中已經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)的樣本的主要GH峰的RP-HPLC分析(對于經(jīng)5個冷凍/解凍循環(huán)后MetY35pAFhGH的分析)。圖17繪示RP-HPLC分析的結(jié)果。圖18繪示SEC-HPLC分析的結(jié)果。圖19繪示cIEX-HPLC分析的結(jié)果。圖20繪示SEC-HPLC積分的實例。圖21繪示RP-HPLC積分的實例。圖22繪示對配方研究(t=0)中對照樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道標(biāo)記12;第2道Ref.Std;第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道:S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。圖23繪示對配方研究(t=0)中對照樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道標(biāo)記12;第2道Ref.Std;第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖24繪示對配方研究(t=0)中對照樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖24而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖24而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖25繪示對于在(C下儲存1周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖25而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道.-S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖25而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG陽hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖26繪示對于在4'C下儲存1周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖26而g，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖26而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖27繪示對于在4t:下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖27而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖27而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖28繪示對于在4'C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖28而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖28而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖29繪示對于在4'C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖29而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖29而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖30繪示對于在4'C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖30而^，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10填P6MS。對于圖30而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖31繪示對于在4'C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖32繪示對于在4卩下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖33繪示對于在4'C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(1(Xg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖34繪示對于在4。C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(l嗎)；第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖35繪示對于在4"下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道:PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(lMg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖36繪示對于在4r下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(lpg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet*(污染)；第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖37繪示對于在25"C下儲存1周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖37而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖37而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖38繪示對于在25'C下儲存1周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖38而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖38而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖39繪示對于在25'C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖39而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖39而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖40繪示對于在25。C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖40而，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖40而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖41繪示對于在25。C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖41而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖41而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖42繪示對于在25。C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖42而言，圖A第1道:'標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖42而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG陽hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖43繪示對于在25。C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖44繪示對于在25。C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖45繪示對于在25X:下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(1ng);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖46繪示對于在25'C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(lpg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖47繪示對于在25'C下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(1jag);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖48繪示對于在25"C下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(l|_ig);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT陽P。圖49繪示對于在40。C下儲存1周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖49而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖49而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖50繪示對于在4(TC下儲存1周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖50而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖50而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖51繪示對于在4(TC下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖51而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖51而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖52繪示對于在4(TC下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖52而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖52而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖53繪示對于在40'C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖53而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖53而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖54繪示對于在40'C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖54而言，圖A第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖54而言，圖B第1道標(biāo)記12標(biāo)準(zhǔn)品；第2道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖55繪示對于在4(TC下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖56繪示對于在4(TC下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖57繪示對于在4(TC下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(1pg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT陽P。圖58繪示對于在4(TC下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道hGH(l^g);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。圖59繪示對于在4'C下儲存1周的復(fù)水樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖59而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖59而言，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖60繪示對于在4'C下儲存1周的復(fù)水樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖60而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖60而言，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖61繪示對配方研究(攪動/UV對照)中對照樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖61而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖61而言，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT陽P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖62繪示對配方研究(攪動/UV對照)中對照樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖62而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖62而言，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖63繪示對于在環(huán)境溫度下攪動4小時的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖63而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖63而言，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖64繪示對于在環(huán)境溫度下攪動4小時的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖64而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖64而自'，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖65繪示對于在環(huán)境溫度下曝露至UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖65而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖65而g，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT陽P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖66繪示對于在環(huán)境溫度下曝露至UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖66而言，圖A第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。對于圖66而言，圖B第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。圖67繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MT-P)的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(1^g);第3道H7MT-P8mg/mLt=0;第4道H7MT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MT-P8mg/mLF/T2;第6道H7MT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MT-P14mg/mLt=0;第11道H7MT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MT-P14mg/mLF/T5。圖68繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MT-P)的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lng);第3道H7MT-P8mg/mLt=0;第4道H7MT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MT-PSmg/mLF/T2;第6道H7MT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MT-P14mg/mLt=0;第11道H7MT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MT-P14mg/mLF/T5。圖69繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MGT-P)的SDS-PAGE分析(非還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lng);第3道H7MGT-P8mg/mLt=0;第4道H7MGT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MGT-P8mg/mLF/T2;第6道H7MGT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MGT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MGT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MGT-P14mg/mLt=0;第11道H7MGT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MGT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MGT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MGT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MGT-P14mg/mLF/T5。圖70繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MGT-P)的SDS-PAGE分析(還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lpg);第3道H7MGT-P8mg/mLt=0;第4道H7MGT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MGT-P8mg/mLF/T2;第6道H7MGT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MGT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MGT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MGT-P14mg/mLt=0;第11道H7MGT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MGT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MGT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MGT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MGT-P14mg/mLF/T5。圖71繪示對于對照樣本和經(jīng)歷攪動6小時和UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lpg);第4道渦旋/UV對照H7MT-P8mg/mL;第5道渦旋/UV對照H7MT-P14mg/mL;第6道渦旋/UV對照H7MGT-P8mg/mL;第7道渦旋/UV對照H7MGT-P14mg/mL;第8道渦旋H7MT-P8mg/mL;第9道渦旋H7MT-P14mg/mL;第10道渦旋H7MGT-P8mg/mL;第11道渦旋H7MGT-P14mg/mL;第12道UVH7MT-P8mg/mL;第13道UVH7MT-P14mg/mL;第14道UVH7MGT-P8mg/mL;第15道UVH7MGT-P14mg/mL。圖72繪示對于對照樣本和經(jīng)歷攪動6小時和UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lpg);第4道渦旋/UV對照H7MT-P8mg/mL;第5道渦旋/UV對照H7MT-P14mg/mL;第6道渦旋/UV對照H7MGT-P8mg/mL;第7道渦旋/UV對照H7MGT-P14mg/mL;第8道渦旋H7MT-P8mg/mL;第9道渦旋H7MT-P14mg/mL;第10道渦旋H7MGT-P8mg/mL*(已污染)；第11道渦旋H7MGT-P14mg/mL;第12道UVH7MT-P8mg/mL;第13道UVH7MT-P14mg/mL;第14道UVH7MGT-P8mg/mL;第15道UVH7MGT-P14mg/mL。圖73繪示對于在4T:或4(TC下儲存1周的樣本和暴露至熱伸展條件的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(1pg);第4道H7MT-P8mg/mL4°C;第5道H7MT-P14mg/mL4°C;第6道H7MGT-P8mg/mL4°C;第7道H7MGT陽P14mg/mL4'C;第8道H7MT-P8mg/mL40°C;第9道H7MT-P14mg/mL40°C;第10道H7MGT墨P8mg/mL40°C;第11道H7MGT-P14mg/mL40°C;第12道H7MT-P8mg/mL熱伸展條件；第13道H7MT-P14mg/mL熱伸展條件；第14道H7MGT-P8mg/mL熱伸展條件；第15道H7MGT-P14mg/mL熱伸展條件。圖74繪示對于在4'C或4(TC下儲存1周的樣本和暴露至熱伸展條件的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(1貼)；第4道H7MT-P8mg/mL4'C;第5道H7MT-P14mg/mL4°C;第6道H7MGT-P8mg/mL4。C;第7道H7MGT-P14mg/mL4°C;第8道H7MT-P8mg/mL40°C;第9道H7MT墨P14mg/mL40°C;第10道H7MGT陽P8mg/mL40°C;第11道H7MGT-P14mg/mL40。C;第12道H7MT-P8mg/mL熱伸展條件；第13道H7MT-P14mg/mL熱伸展條件；第14道H7MGT-P8mg/mL熱伸展條件；第15道H7MGT-P14mg/mL熱伸展條件。圖75繪示對于在4。C或40。C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第l道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(1pg);第3道H7MT-P8mg/mL4°C;第4道H7MT-P14mg/mL4°C;第5道H7MGT-P8mg/mL4'C;第6道H7MGT-P14mg/mL4°C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT-P8mg/mL40。C;第10道H7MGT-P14mg/mL40°C。圖76繪示對于在4'C或4(TC下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lpg);第3道H7MT-P8mg/mL4°C;第4道H7MT-P14mg/mL4°C;第5道H7MGT-P8mg/mL4°C;第6道H7MGT-P14mg/mL4'C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT-P8mg/mL40。C;第10道H7MGT-P14mg/mL40°C。圖77繪示對于在4'C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lpg);第4道P6MT;第5道H6MT;第6道P6GT;第7道P6MS;第8道P6MTMet;第9道P6MT;第10道P7GT;第11道P6MGT;第12道P6MGT-P;第13道P6MT-P;第14道P6GT-P。圖78繪示對于在4。C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(l|Llg);第4道P6MT;第5道H6MT;第6道P6GT;第7道P6MS;第8道P6MTMet;第9道P6MT;第10道P7GT;第11道P6MGT;第12道P6MGT-P;第13道P6MT-P;第14道P6GT-P。圖79繪示對于在25'C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(1貼)；第3道P6MT;第4道H6MT;第5道P6GT;第6道P6MS;第7道P6MTMet;第8道P6MT;第9道P7GT;第10道P6MGT;第ll道P6MGT-P;第12道P6MT-P;第13道P6GT-P。圖80繪示對于在25°〇下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(lpg);第3道P6MT;第4道H6MT;第5道P6GT;第6道P6MS;第7道P6MTMet;第8道P6MT;第9道P7GT;第10道P6MGT;第ll道P6MGT-P;第12道P6MT-P;第13道P6GT-P。圖81繪示對于在4。C或40。C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(0.5pg);第3道H7MT-P8mg/mL4。C;第4道H7MT-P14mg/mL4'C;第5道H7MGT墨P8mg/mL4°C;第6道H7MGT-P14mg/mL4°C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT匿P8mg/mL4CTC;第10道H7MGT-P14mg/mL40°C。圖82繪示對于在4。C或4(TC下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品；第2道hGH(0.5pg);第3道H7MT-P8mg/mL4。C;第4道H7MT-P14mg/mL4°C;第5道H7MGT-P8mg/mL4°C;第6道H7MGT-P14mg/mL4°C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT-P8mg/mL40。C;第10道H7MGT-P14mg/mL40。C。圖83繪示對于樣本的SDS-PAGE分析。第1道PEG-hGH標(biāo)準(zhǔn)品(第2批)；第2道hGH(1pg);第4道39.9mg/mL非還原性；第5道24.3mg/mL非還原性；第6道1.1mg/mL非還原性；第8道39.9mg/mL還原性；第9道24.3mg/mL還原性；第10道1.1mg/mL還原性。具體實施例方式定義應(yīng)了解，本發(fā)明不限于本文所述的特定方法、方案、細(xì)胞系、構(gòu)筑體和試劑且因此其可變化。還應(yīng)了解，本文所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施例的目的，且不意欲限制將僅受隨附權(quán)利要求書限制的本發(fā)明的范疇。除非本文中另作清楚指示，否則如本文和隨附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一"和"所述"包括復(fù)數(shù)個參考物。因此，例如提及一種"hGH"是對一種或一種以上所述蛋白質(zhì)的參考，且包括所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的所述蛋白質(zhì)的等效物等。除非另作定義，否則本文所使用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解的含義相同的含義。盡管可使用與本文所述者相似或相同的任何方法、裝置和材料實施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)描述優(yōu)選方法、裝置和材料。本文所提及的所有公開案和專利都是以引用的方式并入本文中以達(dá)到描述和揭示(例如)所述公開案中所述的可能與本發(fā)明結(jié)合使用的構(gòu)筑體和方法的目的。本文所討論的公開案僅提供本申請案申請R期之甜的揭示內(nèi)容。本文在任何方面都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明者無權(quán)由于現(xiàn)有發(fā)明或任何其他原因使所述揭示案的日期提前。美國專利申請案第11/046,432號是以其全文引用的方式并入本文。因此，美國專利申請案第11/046,432號中標(biāo)號為79-153的段落中所提供的揭示內(nèi)容完全適用于制造、純化、表征和使用本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸hGH多肽和經(jīng)修飾的非天然氨基酸hGH多肽的方法、組合物、技術(shù)和策略，所述適用的程度就如同這里揭示內(nèi)容完全是本發(fā)明所提供的一樣。如本文所使用的"生長激素"或"GH"應(yīng)包括那些具有人生長激素的至少一種生物活性的多肽和蛋白質(zhì)，以及GH類似物、GH同功異型物、GH模擬物、GH片段、雜交GH蛋白、融合蛋白、寡聚體和多聚體、其同源物、糖基化模式變異體、變異體、剪接變異體和突變蛋白質(zhì)，不管是否具有相同生物活性且也不管其合成或制造方法如何；所述合成或制造方法包括(但不限于)重組方法(由cDNA、基因組DNA、合成DNA或其它形式的核酸制造)、活體外方法、活體內(nèi)方法、通過微注射核酸分子方法、合成法、轉(zhuǎn)基因法和基因活化方法。術(shù)語"hGH多肽"涵蓋包含一種或一種以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。有關(guān)完整的天然存在的全長GH氨基酸序列以及成熟的天然存在的GH氨基酸序列和天然存在的突變體的內(nèi)容，分別參看美國專利申請案第11/046,432號中的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3，所述專利是以引用的方式并入本文中。在一些實施例中，本發(fā)明的hGH多肽與生長激素多肽的這些序列或任何其它序列實質(zhì)相同。術(shù)語"hGH多肽"還包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽和前藥，和所述鹽的前藥、天然存在的hGH的多晶型物、水合物、溶劑合物、生物活性片段、生物活性變異體和立體異構(gòu)體，以及天然存在的hGH的激動劑、模擬物和拮抗劑變異體和其多肽融合物。術(shù)語"hGH多肽"涵蓋在氨基端、羧基端或二者處包含額外氨基酸的融合物。示范性融合物包括(但不限于)例如甲硫氨?；L激素，其中甲硫氨酸因重組表達(dá)而與hGH的N末端相連；用于純化的目的的融合物(包括但不限于，聚組氨酸或親和性表位)；具有血清白蛋白結(jié)合肽的融合物；和具有血清蛋白(諸如血清白蛋白)的融合物。美國專利第5,750,373號(以引用的方式并入本文中)描述一種用于選擇新穎蛋白質(zhì)(諸如生長激素和對于個別受體分子具有已改變的結(jié)合特性的抗體片段變異體)的方法。所述方法包含將編碼所需蛋白質(zhì)的基因與絲狀噬菌體M13的基因III外殼蛋白的羧基端結(jié)構(gòu)域融合。多個參考文獻(xiàn)都已揭示通過聚合物接合或糖基化來修飾多肽。術(shù)語"hGH多肽"包括與諸如PEG的聚合物接合的多肽，且可包含半胱氨酸、賴氨酸或其它殘基的一種或一種以上額外衍生作用。此外，hGH多肽可包含連接子或聚合物，其中與所述連接子或聚合物接合的氨基酸可為根據(jù)本發(fā)明的非天然氨基酸，或可利用此項技術(shù)中已知的技術(shù)(諸如與賴氨酸或半胱氨酸偶合)使其與天然編碼的氨基酸接合。已報導(dǎo)hGH多肽的聚合物接合。例如參看美國專利第5,849,535號、第6,136,563號和第6,608,183號，所述專利是以引用的方式并入本文中。美國專利第4,904,584號揭示耗盡PEG化賴氨酸的多肽，其中至少一個賴氨酸殘基己缺失或經(jīng)任何其它氨基酸殘基置換。WO99/67291揭示一種用于使蛋白質(zhì)與PEG接合的工藝，其中所述蛋白質(zhì)上至少一個氨基酸殘基已缺失，并且所述蛋白質(zhì)是在足以達(dá)成與所述蛋白質(zhì)接合的條件下與PEG接觸。WO99/03887揭示屬于生長激素總科的PEG化多肽變異體，其中半胱氨酸殘基己經(jīng)位于所述多肽指定區(qū)域中的非基本氨基酸殘基取代。WO00/26354揭示一種制造具有降低的致過敏性的糖基化多肽變異體的方法，與相應(yīng)的母體多肽相比，所述多肽變異體包含至少一個額外的糖基化位點。美國專利第5,218,092號(其是以引用的方式并入本文中)揭示對粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽進(jìn)行修飾從而當(dāng)與天然多肽相比時引入至少一個額外的碳水化合物鏈。術(shù)語"hGH多肽"還包括糖基化hGH，諸如但不限于，在任何氨基酸位置處經(jīng)糖基化的多肽、N連接或O連接糖基化形式的多肽。也可將含有單核苷酸改變的變異體看作hGH多肽的生物活性變異體。此外，還包括剪接變異體。術(shù)語"hGH多肽"還包括通過化學(xué)方式連接或以融合蛋白形式表達(dá)的任一種或一種以上hGH多肽或任何其它多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、聚合物、小分子、連接子、配位體或任何類型的其它生物活性分子的hGH多肽雜二聚體、均二聚體、雜多聚體或均多聚體，以及例如含有特定缺失或其它修飾但仍保持生物活性的多肽類似物。除非另作特定說明(意即，當(dāng)聲明所述比較是基于諸如SEQIDNO:1、3的另一hGH序列時)，否則有關(guān)本文所述的hGH中氨基酸位置的所有相關(guān)內(nèi)容都是基于如標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專禾U申請案第11/046,432號中所列的SEQIDNO:2中的位置，所述專利是以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，與美國專利申請案第11/046,432號(其是以引用的方式并入本文中)中所列的SEQIDNO:1、2、3或任何其它GH序列中的位置對應(yīng)的氨基酸位置可易于以諸如hGH融合物、變異體、片段等的任何其它hGH分子鑒別。舉例而言，可使用諸如BLAST的序列比對程序比對并鑒別蛋白質(zhì)中與美國專利申請案第11/046,432號(其是以引用的方式并入本文中)的SEQIDNO.1、2、3或其它GH序列中的位置對應(yīng)的特定位置。預(yù)期本文所述的關(guān)于美國專利申請案第11/046,432號(其是以引用的方式并入本文中)中的SEQIDNO:1、2、3或其它GH序列中的氨基酸的取代、缺失或添加還指在本文所述或此項技術(shù)中已知的諸如hGH融合物、變異體、片段等的任何其它hGH分子中的相應(yīng)位置處進(jìn)行的取代、缺失或添加，且都明顯地涵蓋于本發(fā)明中。術(shù)語"hGH多肽"或"hGH"涵蓋包含一種或一種以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。本發(fā)明的hGH多肽可包含一種或一種以上天然氨基酸的修飾與一種或一種以上非天然氨基酸修飾的組合。己對天然存在的hGH多肽中多個氨基酸位置中的示范性取代進(jìn)行描述，包括(但不限于)調(diào)節(jié)hGH多肽的一種或一種以上生物活性的取代，所述活性的調(diào)節(jié)諸如(但不限于)增加激動劑活性、增加多肽溶解性、降低蛋白酶易感性、將所述多肽轉(zhuǎn)化成拮抗劑等，且其都涵蓋于術(shù)語"hGH多肽"中。在一些實施例中，hGH多肽另外包含調(diào)節(jié)hGH多肽的生物活性的添加、取代或缺失。舉例而言，所述添加、取代或缺失可調(diào)節(jié)hGH的一種或一種以上特性或活性。舉例而言，所述添加、取代或缺失可調(diào)節(jié)對hGH多肽受體的親和性、調(diào)節(jié)(包括但不限于，增加或降低)受體二聚作用、使受體二聚體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期、調(diào)節(jié)治療半衰期、調(diào)節(jié)多肽穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)蛋白酶的裂解、調(diào)節(jié)劑量、調(diào)節(jié)釋放或生物利用度、便利純化或改良或改變特定投藥路徑。類似地，hGH多肽可包含蛋白酶裂解序列、分泌信號序列、反應(yīng)性基團(tuán)、抗體結(jié)合域(包括但不限于，F(xiàn)LAG或聚His)或其它基于親和性的序列(包括但不限于，F(xiàn)LAG、聚His、GST等)或改良對于多肽的檢測(包括但不限于，GFP)、純化或其它特質(zhì)的連接分子(包括但不限于，生物素)。術(shù)語"hGH多肽"還涵蓋均二聚體、雜二聚體、均多聚體和雜多聚體，其與相同或不同非天然編碼的氨基酸側(cè)鏈、天然編碼的氨基酸側(cè)鏈連接，包括(但不限于)通過非天然編碼的氨基酸側(cè)鏈直接連接或通過連接子間接連接。示范性連接子包括(但不限于)小有機(jī)化合物；各種長度的水溶性聚合物，諸如聚(乙二醇)或葡聚糖；或各種長度的多肽。"非天然編碼的氨基酸"是指不為20種常見氨基酸中的任一種或吡咯賴氨酸或硒半胱氨酸的氨基酸?？梢耘c術(shù)語"非天然編碼的氨基酸"相同意義使用的其它術(shù)語為"非天然氨基酸("non-naturalaminoacid"、"unnaturalaminoacid")"、"非天然存在的氨基酸"和其各種以連字符連接和不以連字符連接的型式。術(shù)語"非天然編碼的氨基酸"還包括(但不限于)通過對天然編碼的氨基酸(包括但不限于，20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸)進(jìn)行修飾(例如，翻譯后修飾)而產(chǎn)生但其本身未通過翻譯復(fù)合物天然并入到生長多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸和0-磷酸酪氨酸。"氨基端的修飾基團(tuán)"是指可連接到多肽氨基端的任何分子。類似地，"羧基端的修飾基團(tuán)"是指可連接到多肽羧基端的任何分子。水端修飾基團(tuán)包括(但不限于)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質(zhì)(諸如血清白蛋白)或增加肽的血清半衰期的其它部分。此項技術(shù)中和本文中使用術(shù)語"官能團(tuán)"、"活性部分"、"活化基團(tuán)"、"離去基團(tuán)"、"反應(yīng)位點"、"化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)"和"化學(xué)反應(yīng)性部分"是指分子中截然不同、可定義的部分或單元。所述術(shù)語在某種程度上與化學(xué)技術(shù)中的含義同義，且用于在本文中表明分子中執(zhí)行某種功能或活性并與其它分子反應(yīng)的部分。本文中使用術(shù)語"鍵"或"連接子"是指通常由化學(xué)反應(yīng)形成且通常為共價鍵的基團(tuán)或鍵結(jié)。水解穩(wěn)定的鍵意思是在水中實質(zhì)穩(wěn)定且在有用pH值下(包括但不限于，在生理學(xué)條件下)于一段較長時間段內(nèi)、可能甚至無限期不與水反應(yīng)的鍵。水解不穩(wěn)定或可降解的鍵意思是在水中或水溶液(例如包括血液)中可降解的鍵。酶解不穩(wěn)定或可降解鍵意思是可經(jīng)一種或一種以上酶降解的鍵。如此項技術(shù)中所了解，PEG和相關(guān)聚合物可在聚合物主鏈中或聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上末端官能團(tuán)之間的連接基團(tuán)中包括可降解鍵。舉例而言，由PEG羧酸或活性PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應(yīng)所形成的酯鍵一般在生理學(xué)條件下水解釋放所述試劑。其它水解可降解鍵包括(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應(yīng)產(chǎn)生的亞胺鍵；由醇與磷酸基反應(yīng)形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與酵的反應(yīng)產(chǎn)物的腙鍵；作為醛與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的縮醛鍵；作為甲酸與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的原酸酯鍵；由包括(但不限于)聚合物(諸如PEG)末端處的胺基與肽的羧基形成的肽鍵；和由包括(但不限于)聚合物末端的亞磷酰胺基與寡核苷酸的5'羥基所形成的寡核苷酸鍵。當(dāng)用于本文中時，術(shù)語"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性劑"意思是可影響與有機(jī)體相關(guān)的生物系統(tǒng)、路徑、分子或相互作用的任何物理或生化特性的任何物質(zhì)，所述有機(jī)體包括(但不限于)病毒、細(xì)菌、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物和人類。具體說來，如本文所使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于診斷、治愈、減輕、治療或預(yù)防人類或其他動物的疾病或另外增強(qiáng)人類或動物的身體或精神的良好狀態(tài)的任何物質(zhì)。生物活性分子的實例包括(但不限于)肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、硬性藥物(harddrug)、軟性藥物、碳水化合物、無機(jī)原子或分子、染料、脂質(zhì)、核苷、放射性核、寡核苷酸、毒素、細(xì)胞、病毒、脂質(zhì)體、微粒和膠粒。適用于本發(fā)明中的生物活性劑的種類包括(但不限于)藥物、前藥、放射性核、顯影劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管藥、抗焦慮劑、激素、生長因子、類固醇藥、微生物來源的毒素和其類似物。"雙官能聚合物"是指包含兩種離散官能團(tuán)的聚合物，其能夠與其它部分(包括但不限于，氨基酸側(cè)基)特異性反應(yīng)形成共價或非共價鍵。可使用一個官能團(tuán)與特定生物活性組份上的基團(tuán)反應(yīng)且另一基團(tuán)與第二生物組份上的基團(tuán)反應(yīng)的雙功能連接子形成一種接合物，其包括第一生物活性組份、雙功能連接子和第二生物活性組份。已知用于使各種化合物與肽連接的多種程序和連接子分子。例如參看歐洲專利申請案第188,256號；美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4,680,338號和第4,569,789號，所述專利是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"是指包含兩種或兩種以上離散官能團(tuán)的聚合物，其能夠與其它部分(包括但不限于，氨基酸側(cè)基)特異性反應(yīng)形成共價或非共價鍵。雙官能聚合物或多官能聚合物可為任何所需長度或分子量，且可經(jīng)選擇以于一種或一種以上與GH連接的分子(例如，hGH分子)之間提供特定所需間隔或構(gòu)象。如本文所使用的術(shù)語"水溶性聚合物"是指可溶于水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與hGH多肽的鍵可相對于未經(jīng)修飾形式導(dǎo)致以下改變包括(但不限于)血清半衰期增加或經(jīng)調(diào)節(jié)；或治療半衰期增加或經(jīng)調(diào)節(jié)；免疫原性經(jīng)調(diào)節(jié)；實體相關(guān)特性經(jīng)調(diào)節(jié)，諸如聚集和多聚體形成；受體結(jié)合改變；和受體二聚化或多聚化改變。水溶性聚合物可或可不具有其自身的生物活性。適當(dāng)聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單d-do烷氧基或芳氧基衍生物(美國專利第5,252,714號中描述，其是以引用的方式并入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚順丁烯二酸酐、N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、寡醣、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括但不限于甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇共聚物和其衍生物、聚乙烯基乙醚和oH3-聚[(2-羥乙基)]-DL-天冬酰胺和其類似物，或其混合物。所述水溶性聚合物的實例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。如本文所使用的術(shù)語"聚烷二醇"或"聚(垸二醇)"是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。術(shù)語"聚烷二醇"涵蓋線性與分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa與100kDa之間。舉例而言，其它示范性實施例列于商業(yè)供應(yīng)商目錄中，諸如ShearwaterCorporation目錄"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)中。如本文所使用的術(shù)語"經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期"意思是經(jīng)修飾hGH的循環(huán)半衰期相對于其未經(jīng)修飾形式的正或負(fù)改變。血清半衰期是通過在投與hGH后于各種時間點時取得血液樣本且測定各樣本中所述分子的濃度來進(jìn)行測量。血清濃度與時間的相關(guān)性使得能夠計算血清半衰期。血清半衰期合意地增加至少約兩倍，但較小增加可例如在其允許令人滿意的給藥方案或避免有毒作用的情況下有益。在一些實施例中，所述增加為至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。如本文所使用的術(shù)語"經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期"意思是治療有效量的hGH的半衰期相對于其未經(jīng)修飾形式的正或負(fù)改變。治療半衰期是通過投藥后在各種時間點時測量所述分子的藥代動力學(xué)和/或藥效特性來進(jìn)行測量。治療半衰期增加合意地允許特別有益的給藥方案、特別有益的總劑量或避免不合需要的作用。在一些實施例中，治療半衰期增加是由效力增加、經(jīng)修飾分子與其目標(biāo)的結(jié)合增加或減少、酶(諸如蛋白酶)對所述分子分解的增加或減少或未經(jīng)修飾分子的另一參數(shù)或作用機(jī)制的增加或減少引起。術(shù)語"實質(zhì)純"是指可實質(zhì)或基本無通常伴有見于天然存在的環(huán)境(意即，天然細(xì)胞或在重組產(chǎn)生hGH多肽的情況下的宿主細(xì)胞)中的蛋白質(zhì)或與其相互作用的組份的hGH多肽?？蓪嵸|(zhì)無細(xì)胞材料的hGH多肽包括(以干重計)具有小于約30%、小于約25%、小于約20%、小于約15%、小于約10%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1%污染蛋白的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)通過宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生hGH多肽或其變異體時，所述蛋白質(zhì)可以占細(xì)胞干重約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更低的量存在。當(dāng)通過宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生hGH多肽或其變異體時，所述蛋白質(zhì)可以約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更低細(xì)胞干重存在于培養(yǎng)基中。因此，當(dāng)通過諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細(xì)管電泳的適當(dāng)方法測定時，如通過本發(fā)明的方法所制造的"實質(zhì)純"hGH多肽可具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度水平，尤其至少約75%、80%、85%的純度水平且更尤其至少約90%的純度水平、至少約95%的純度水平、至少約99%或更高的純度水平。當(dāng)用于核酸或蛋白質(zhì)時，術(shù)語"經(jīng)分離"表示所述核酸或蛋白質(zhì)無至少某些與其天然狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞組份，或已將所述核酸或蛋白質(zhì)濃縮到大于其在活體內(nèi)或活體外制造時的濃度的程度。其可為均質(zhì)態(tài)。經(jīng)分離的物質(zhì)可為干燥或半干燥狀態(tài)；或在溶液中，包括(但不限于)水溶液。其可為包含其它醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和/或賦形劑的醫(yī)藥組合物的組份。純度和均質(zhì)性通常是使用分析化學(xué)技術(shù)(諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜)測定。作為制劑中存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)實質(zhì)經(jīng)純化。特別說來，使經(jīng)分離基因與側(cè)接到所述基因且編碼除所需基因外的蛋白質(zhì)的丌放式閱讀框分離。術(shù)語"經(jīng)純化"表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中實質(zhì)產(chǎn)生出一條譜帶。具體說來，意思可為所述核酸或蛋白質(zhì)為至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99°/。純或更高純度。如本文所使用的術(shù)語"受檢者"是指作為治療、觀察或?qū)嶒災(zāi)繕?biāo)的動物，在一些實施例中為哺乳動物，且在其它實施例中為人類。如本文所使用的術(shù)語"有效量"是指所投與的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的量，其將在一定程度上緩解所治療的疾病、病況或病癥的一種或一種以上癥狀?？赏杜c含有本文所述的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物以達(dá)到預(yù)防、增強(qiáng)和/或治療性治療的目的。術(shù)語"增強(qiáng)"意思是增加或延長所需作用的效力或持續(xù)時間。因此，就增強(qiáng)治療劑的作用而言，術(shù)語"增強(qiáng)"是指增加或延長其它治療劑對系統(tǒng)的作用的效力或持續(xù)時間的能力。如本文所使用的"增強(qiáng)有效性的量"是指適于增強(qiáng)所需系統(tǒng)中另一治療劑的作用的量。當(dāng)用于患者時，有效用于此用途的量將視疾病、病癥或病況的嚴(yán)重程度和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應(yīng)和治療醫(yī)師的判斷而定。如本文所使用的術(shù)語"經(jīng)修飾"是指對指定多肽所作的任何改變，諸如對多肽長度、多肽的氨基酸序列、化學(xué)結(jié)構(gòu)、共翻譯修飾或翻譯后修飾的改變。"(經(jīng)修飾)"形式的術(shù)語意思是所討論的多肽視情況經(jīng)修飾，也就是說，所討論的多肽可經(jīng)修飾或不經(jīng)修飾。術(shù)語"翻譯后經(jīng)修飾"是指己并入多肽鏈后對天然氨基酸或非天然氨基酸進(jìn)行的可發(fā)生于所述氨基酸的任何修飾。舉例而言，所述術(shù)語涵蓋共翻譯活體內(nèi)修飾、共翻譯活體外修飾(諸如無細(xì)胞翻譯系統(tǒng))、翻譯后活體內(nèi)修飾和翻譯后活體外修飾。在預(yù)防性應(yīng)用中，將含有經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物投與易受特定疾病、病癥或病況影響或另外有患特定疾病、病癥或病況風(fēng)險的患者。所述量定義為"預(yù)防有效量"。在此使用中，確切量也視患者的健康狀態(tài)、體重和其類似情況而定。認(rèn)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實驗(例如，劑量遞增臨床實驗)確定所述預(yù)防有效量。在預(yù)防性應(yīng)用中，將含有經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物以足以治愈或至少部分抑制所述疾病、病癥或病況的癥狀的量投與已罹患疾病、病癥或病況的患者。所述量定義為"治療有效量"，且將視疾病、病癥或病況的嚴(yán)重程度和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應(yīng)和治療醫(yī)師的判斷而定。認(rèn)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實驗(例如，劑量遞增臨床實驗)確定所述治療有效量。術(shù)語"治療"用于指預(yù)防和/或治療性治療。當(dāng)投與需要產(chǎn)生代謝物的有機(jī)體時，可代謝非天然編碼的氨基酸多肽，隨后用于產(chǎn)生所需作用，包括所需治療作用。除非另作說明，否則使用此項技術(shù)中眾所周知的常規(guī)方法質(zhì)譜法、NMR、HPLC、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和藥理學(xué)。實施方式"信本發(fā)明提供包含至少一個非天然氨基酸的hGH分子。在本發(fā)明的某些實施例中，具有至少一個非天然氨基酸的hGH多肽包括至少一種翻譯后修飾。在一實施例中，所述至少一種翻譯后修飾包含利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的適于特定反應(yīng)性基團(tuán)的化學(xué)方法使包含第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子與至少一個包含第一反應(yīng)性基團(tuán)的非天然氨基酸連接，所述分子包括(但不限于)標(biāo)記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細(xì)胞毒性化合物、藥物、親和標(biāo)記、光親和標(biāo)記、反應(yīng)性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標(biāo)記、熒光團(tuán)、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團(tuán)、與其它分子共價或非共價相互作用的基團(tuán)、光籠鎖部分(photocagedmoiety)、光化輻射可激發(fā)部分、光致異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學(xué)可裂解基團(tuán)、光可裂解基團(tuán)、延長的側(cè)鏈、經(jīng)碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標(biāo)記部分、生物物理學(xué)探針、發(fā)磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電子致密基團(tuán)、磁性基團(tuán)、插入基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標(biāo)記、小分子、量子點、納米傳導(dǎo)物、放射性核苷酸、無線電傳導(dǎo)物、中子俘獲劑或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì)。所需蛋白質(zhì)或多肽可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或十個或十個以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白質(zhì)中可存在包含l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或IO個以上不同非天然氨基酸的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或IO個以上不同位點。在某些實施例中，天然存在型式的蛋白質(zhì)中存在的至少一個(但少于全部)特定氨基酸經(jīng)非天然氨基酸取代。本發(fā)明提供基于包含至少一種非天然編碼的氨基酸的GH超基因家族成員、尤其hGH的方法和組合物。將至少一個非天然編碼的氨基酸引入GH超基因家族成員(諸如hGH)中可允許應(yīng)用涉及特定化學(xué)反應(yīng)(包括但不限于，與一個或一個以上非天然編碼的氨基酸反應(yīng)而不與20種常見氨基酸反應(yīng))的接合化學(xué)方法。在一些實施例中，通過非天然編碼的氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)拱翘烊痪幋a的氨基酸的GH超基因家族成員與水溶性聚合物(諸如，聚乙二醇(PEG))連接。本發(fā)明提供一種以PEG衍生物選擇性修飾蛋白質(zhì)的高效方法，其涉及將非基因編碼的氨基酸(包括(但不限于)含有未見于20種天然并入的氨基酸中的官能團(tuán)或取代基的氨基酸，所述官能團(tuán)或取代基包括(但不限于)酮、疊氮基或乙炔部分)選擇性并入對選擇性密碼子起反應(yīng)的蛋白質(zhì)，且隨后以適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性PEG衍生物對那些氨基酸進(jìn)行修飾。并入后，可接著通過利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于非天然編碼的氨基酸中所存在的特定官能團(tuán)或取代基的化學(xué)方法對氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行修飾。已知的多種化學(xué)方法都適用于本發(fā)明中以將水溶性聚合物并入蛋白質(zhì)中。此項技術(shù)中已良好確立可使用PEG修飾生物材料的表面(例如，參看美國專利第6,610,281號；Mehvar，R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1):125-136(2000)，所述專利是以引用的方式并入本文中)。標(biāo)題為"ModifiedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專利申請案第11/046,432號(其是以其全文引用的方式并入本文中)中提供有關(guān)重組核酸方法、選擇性密碼子、正交tRNA、正交氨?；鵷RNA合成酶和具有各種反應(yīng)性基團(tuán)的非天然編碼的氨基酸，所述反應(yīng)性基團(tuán)包括但不限于羰基、肼、酰肼、氨基氧基、疊氮基和炔基。此申請案中也討論非天然編碼的氨基酸的細(xì)胞攝入和生物合成。本申請案也詳細(xì)描述用于將一個或一個以上非天然編碼的氨基酸并入hGH且表達(dá)hGH多肽的位點。Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746(2003)(其是以引用的方式并入本文中)中描述含有羰基的非天然氨基酸(諸如對乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和間乙?；?(+/-)-苯丙氨酸)。//.^存#天然賓基澄游多嚴(yán)可并入非天然氨基酸以達(dá)成各種目的，包括(但不限于)修整蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或功能的改變、改變尺寸、酸度、親核性、氫鍵、疏水性、蛋白酶目標(biāo)位點的可接取性、靶向部分(包括但不限于用于蛋白質(zhì)陣列)、加入生物活性分子、連接聚合物、連接放射性核、調(diào)節(jié)血清半衰期、調(diào)節(jié)組織滲透性(例如腫瘤)、調(diào)節(jié)活性轉(zhuǎn)運體、調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞或器官特異性或分布、調(diào)節(jié)免疫原性、調(diào)節(jié)蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)可具有增強(qiáng)的或甚至完全新穎的催化或生物物理特性。舉例而言，可通過將非天然氨基酸包涵于蛋白質(zhì)中視情況改變以下特性毒性、生物分布、結(jié)構(gòu)特性、光譜特性、化學(xué)和/或光化學(xué)特性、催化能力、半衰期(包括但不限于，血清半衰期)、與其它分子反應(yīng)(包括但不限于共價或非共價反應(yīng))的能力和其類似特性。包括包含至少一種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的組合物可用于包括(但不限于)新穎的治療、沴斷、催化酶、工業(yè)酶、結(jié)合蛋白(包括但不限于抗體)和包括(但不限于)有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。例如，參看Dougherty,(2000)t/wwa^ra/Jmzwo爿c/tfe/Vo6eso//Vo/ez'w5Vrac/wawt/F頭"/o"'CurrentOpinioninChemicalBiology，4:645-652。在本發(fā)明的一個方面中，組合物包括至少一種具有至少一個(包括但不限于至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。非天然氨基酸可相同或不同，包括但不限于，包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上不同非天然氨基酸的蛋白質(zhì)中可存在1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或IO個以上不同位點。另一方面，組合物包括具有至少一種(但小于全部)蛋白質(zhì)中所存在的特定氨基酸的蛋白質(zhì)經(jīng)非天然氨基酸取代。對于具有一個以上非天然氨基酸的指定蛋白質(zhì)而言，非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于，所述蛋白質(zhì)可包括兩種或兩種以上不同類型的非天然氨基酸，或可包括相同非天然氨基酸中的兩種)。對于具有兩種以上非天然氨基酸的指定蛋白質(zhì)而言，非天然氨基酸可相同、不同或為多種相同種類的非天然氨基酸與至少一種不同非天然氨基酸的組合。本發(fā)明的特征為具有至少一個非天然氨基酸的引人關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組合物和方法制造的具有至少一種非天然氨基酸的多肽或蛋白質(zhì)。賦形劑(包括但不限于醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑)也可存在于蛋白質(zhì)中。通過在真核細(xì)胞中制造所需的具有至少一種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽，蛋白質(zhì)或多肽通常將包括真核翻譯后修飾。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包括至少一個非天然氨基酸和至少一種于活體內(nèi)由真核細(xì)胞所作的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾不是通過原核細(xì)胞進(jìn)行。舉例而言，翻譯后修飾包括(但不限于)乙?；?、酰基化、脂質(zhì)修飾、-棕櫚?；⒆貦八猁}添加、磷酸化、醣酯鍵修飾、糖基化和其類似修飾。一方面，翻譯后修飾包括通過GlcNAc-天冬氨酸鍵使寡醣(包括但不限于，(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))與天冬氨酸連接。參看標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolyp印tidesandTheirUses"的美國專利申請案第11/046,432號表1,所述專利是以引用的方式并入本文中，其列出有關(guān)真核蛋白的N連接的寡醣的一些實例(也可以存在未展示的額外殘基)。另一方面，翻譯后修飾包括通過GalNAc-絲氨酸或GalNAc-甲硫氨酸鍵或GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-甲硫胺酸鍵使寡醣(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或甲硫氨酸連接。另一方面，翻譯后修飾包括前體(包括但不限于，降鈣素前體、降鈣素基因相關(guān)的肽前體、前甲狀旁腺激素原、前胰島素原、胰島素原、甜阿皮黑素原、阿黑皮素原和其類似物)的蛋白水解加工；組裝成多亞基蛋白質(zhì)或大分子組裝；翻譯到細(xì)胞(包括但不限于，細(xì)胞器，諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體(Golgiapparatus)、核、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等，或通過分泌路徑)中的另一位點。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包含分泌或定位序列、表位標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、GST融合物或其類似物。美國專利第4,963,495號和第6,436,674號(其是以引用的方式并入本文)中詳細(xì)描述經(jīng)設(shè)計以改良hGH多肽的分泌的構(gòu)筑體。非天然氨基酸的一個優(yōu)勢在于其存在可用于加入額外分子的額外化學(xué)部分。這些修飾可在真核或非真核細(xì)胞中于活體內(nèi)或活體外進(jìn)行。因此，在某些實施例中，翻譯后修飾是通過非天然氨基酸進(jìn)行。舉例而i，翻譯后修飾可通過親核-親電反應(yīng)進(jìn)行。目前用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的大部分反應(yīng)都涉及于親核與親電反應(yīng)搭配物之間形成共價鍵，包括(但不限于)a-鹵酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。在這些情況下，選擇性是通過蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)量和可接取性測定。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可使用其它更多的選擇性反應(yīng)，諸如非天然酮基氨基酸與酰肼或氨基氧基化合物于活體外和活體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)。例如參看Cornish等人,(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science.276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500;Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024;Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;和Chin等人，(2003)Science,301:964-7，所有參考文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。這使得能夠用大量包括熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物和細(xì)胞毒性分子的試劑選擇性標(biāo)記實際上任何蛋白質(zhì)。也參看標(biāo)題為"Glycoproteinsynthesis"的美國專利第6,927,042號，其是以引用的方式并入本文中?？膳chGH連接的分子包括(但不限于)染料、熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物、聚合物(包括但不限于，聚乙二醇衍生物)、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒性化合物、親和標(biāo)記、生物素衍生物、樹脂、珠粒、第二蛋白質(zhì)或多肽(或更多)、聚核苷酸(包括但不限于，DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物和其類似物〃本發(fā)明提供通過選擇性修飾蛋白質(zhì)產(chǎn)生的非天然氨基酸多肽配方，其涉及遺傳并入非天然氨基酸。///.^體/^產(chǎn)主包##基齒薪碼游賓基凝游AG//多it可使用經(jīng)修飾的tRNA和tRNA合成酶加入或取代并非天然存在的系統(tǒng)中編碼的氨基酸于活體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的hGH多肽。使用并非天然存在的系統(tǒng)中編碼的氨基酸產(chǎn)生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。這些方法涉及產(chǎn)生獨立于相對于翻譯系統(tǒng)為內(nèi)源性的合成酶和tRNA起作用(且因此有時稱為"正交")的翻譯機(jī)器。通常，翻譯系統(tǒng)包含f.交tRNA(0-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS優(yōu)先以翻譯系統(tǒng)中的至少一種非天然存在的氨基酸使O-tRNA氨基乙酰化，且O-tRNA識別所述系統(tǒng)中的其它tRNA不識別的至少一種選擇性密碼子。因此，翻譯系統(tǒng)對所編碼的選擇性密碼子起反應(yīng)將非天然編碼的氨基酸插入所述系統(tǒng)中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中，由此將氨基酸"取代入"所編碼的多肽中的位置中。用于將特定的合成氨基酸插入到多肽中的技術(shù)中己描述多種正交tRNA和氨?；鵷RNA合成酶，且一般適用于本發(fā)明中。舉例而言，酮基特異性O(shè)-tRNA/氨酰基tRNA合成酶己描述于Wang,L.等人，Proc.Wa".爿cad"X4100:56-61(2003)和Zhang，Z.等人，腸cA亂42(22):6735誦6746(2003)中。示范性O(shè)-RS或其部分是通過聚核苷酸序列編碼，且其包括美國專利申請公開案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的氨基酸序列，所述專利各自以引用的方式并入本文。與O-RS—起使用的相應(yīng)O-tRNA分子也描述于例如美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。疊氮基特異性0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶系統(tǒng)的實例搖述于Chin,J.W.等人/爿附.C力亂5bc,124:9026-9027(2002)中。對疊氮基-L-Phe的示范性O(shè)-RS序列包括(但不限于)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931號)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNOs:14-16和29-32和氨基酸序列SEQIDNOs:46-48和61-64，所述專利是以引用的方式并入本文中。其它O-tRNA序列包括(但不限于)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931號)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNOs:1-3，所述專利是以引用的方式并人本文中。對特定非天然編碼的氨基酸具恃異性的0-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶對的其它實例描述于美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，其是以引用的方式并入本文中。在釀酒酵母中并入含酮基氨基酸與含疊氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人，Sczewce301:964-967(2003)中。已報導(dǎo)若干其它正交對。已描述潛在并入大腸桿菌中的非天然氨基酸的源自釀酒酵母tRNA和合成酶的谷氨?；?例如參看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U,S.A.96:4780-4785)、天冬氨?；?例如參看Pastrnak，M.等人，(2000)Helv.Chim.Acta83:2277-2286)和酪氨酰基(例如參看Ohno,S.等人，(1998)J.Biochem.(Tokyo.Jpn.)124:1065-1068;禾口Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)系統(tǒng)。已描述源自大腸桿菌谷氨?；?例如參看Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)和酪氨酰基(例如參看Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶用于釀酒酵母中。已將大腸桿菌酪氨酰基系統(tǒng)用于哺乳動物細(xì)胞活體內(nèi)并入3-碘-L-酪氨酸。參看Sakamoto,K.等人，(2002)NucleicAcidsRes.30:4692-4699。使用0-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶涉及選擇編碼非天然編碼的氨基酸的特定密碼子。盡管可使用任何密碼子，但一般需要選擇稀少或從未用于表達(dá)0-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶的細(xì)胞中的密碼子。舉例而言，示范性密碼子包括無義密碼子，諸如終止密碼子(琥珀、赭石和蛋白石)；四個或四個以上堿基密碼子；和稀少或未經(jīng)使用的其它天然的三堿基密碼子?？墒褂么隧椉夹g(shù)中已知的突變誘發(fā)方法(包括但不限于，位點特異性突變誘發(fā)、盒式突變誘發(fā)、限制性選擇性突變誘發(fā)等)將特定的選擇性密碼子引入hGH多肽編碼序列的適當(dāng)位置中。用于產(chǎn)生可用于并入非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)合成機(jī)器組份(諸如0-RS、0-tRNA和正交O-tRNA/O-RS對)的方法描述于Wang,L.等人，Sc/e"ce292:498-500(2001);Chin,j.W.等人，丄4m.C/zem.Soc.124:9026-9027(2002);Zhang,Z等人，歷oc力em&^y42:6735-6746(2003)中。用于活體內(nèi)并入非天然編碼的氨基酸的方法和組合物描述于美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，其是以引用的方式并入本文中。用于選擇有機(jī)體活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中所使用的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也描述于美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。標(biāo)題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的PCT公開案第W004/035743號(其是以其全文引用的方式并入本文中)中描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA對。標(biāo)題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第W004/094593號(其是以其全文引用的方式并入本文中)中描述用于將非天然編碼的氨基酸并入真核宿主細(xì)胞中的正交RS和tRNA對。所述方法也于標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專利申請案第11/046,432號中進(jìn)行詳細(xì)描述，所述專利是以引用的方式并入本文中。產(chǎn)生正交tRNA和RS對的方法中所使用的有機(jī)體包含各種有機(jī)體和各種組合。舉例而言，所述方法的第一和第二有機(jī)體可相同或不同。在一實施例中，有機(jī)體視情況為原核有機(jī)體，包括(但不限于)詹氏伊諒球^(M"/w"ococo^ya""^c/^)、礞濕^孝伊^^^7^麥(MeZ/w"o&(3Ceri"w^jermoaw^^ro/>/n'cwm)、凝端〃,忿嚴(yán)(//a/o6ac化n.wm)、(Esc/^n'c/u^co/0、A/;^才f球蘑(A/w/g,Wiw)、蔵！織游艱蘑(P/w"'o^s)、薪遂仗濕;/身(Z5/^〃義MA")、邀〃氛藥/f"裒3一4.磨(/1/7^"/.r)、寧,辨^;韻磨(ZMerwo/力z7z")或其類似物?；蛘?，有機(jī)體視情況包括真核有機(jī)體，包括(但不限于)植物(包括但不限于，復(fù)雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌(包括但不限于，酵母等)、動物(包括但不限于，哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等)或其類似動物。在另一實施例中，第二有機(jī)體為原核有機(jī)體，包括(但不限于)唐"氏伊錄球^"、嗜.熟^養(yǎng)伊;綜,^、極凝寧i蘑、犬應(yīng),^、/Vi才f承^、極耢〃#^^、蔵,《歡燕球^、嚴(yán)遂汰效球朦、^^礞濕霱賓才f葸、〃氛教^:教慮或其類似物?；蛘?，第二有機(jī)體可為真核有機(jī)體，包括(但不限于)酵母、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、菌類、哺乳動物細(xì)胞或其類似物。在各種實施例中，所述第一有機(jī)體與第二有機(jī)體不同。K求天然存在效募基麼fAG好多l(xiāng)^游泣f本發(fā)明預(yù)期將一個或一個以上非天然存在的氨基酸并入hGH多肽?？蓪⒁粋€或一個以上非天然存在的氨基酸并入不破壞多肽活性的特定位置處。這可通過進(jìn)行"保守性"取代達(dá)成，包括(但不限于)以疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，體積大的氨基酸取代體積大的氨基酸、親水性氨基酸取代親水性氨基酸和/或?qū)⒎翘烊淮嬖诘陌被岵迦霝榛钚圆恍璧奈恢弥?。hGH的區(qū)域可描述于下，其中hGH中的氨基酸位置是通過中間一行(美國專利申請案第11/046,432號中的SEQIDNO:2，所述專利是以引用的方式并入本文中)指示螺旋A螺旋B螺旋C螺旋D-[34-74]-[75-96]-[97-105〗-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]N端A-B環(huán)B-C環(huán)C-D環(huán)C端可使用各種生物化學(xué)方法和結(jié)構(gòu)方法選擇hGH多肽內(nèi)以非天然編碼的氨基酸進(jìn)行取代的所需位點。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員易于顯而易見，多肽鏈的任何位置都適于選擇用于并入非天然編碼的氨基酸，且選擇可基于合理設(shè)計或出于任何或非特別需要的目的隨機(jī)選擇。選擇所需位點可用于產(chǎn)生具有任何所需特性或活性的hGH分子(包括(但不限于)激動劑、超強(qiáng)激動劑(super-agonist)、反相激動劑、拮抗劑、受體結(jié)合調(diào)節(jié)劑、受體活性調(diào)節(jié)劑)、形成二聚體或多聚體、與天然分子相比不改變活性或特性或操縱多肽的任何物理或化學(xué)特性(諸如溶解性、聚集或穩(wěn)定性)。舉例而言，可使用此項技術(shù)中已知的點突變分析、丙氨酸掃描或同源物掃描方法鑒別hGH多肽的生物活性所需的多肽位置。例如參看Cunningham,B.和Wells,J.，Sc&wce,244:1081-1085(1989)(鑒別對于hGH生物活性至關(guān)重要的14個殘基)禾口Cunningham,B.等人Sc/ewce243:1330-1336(1989)(使用同源物掃描突變誘發(fā)鑒別抗體和抗體表位)。美國專利第5,580,723號、第5,834,250號、第6,013,478號、第6，428,954號和第6,451,561號(其是以引用的方式并入本文)中描述通過用目標(biāo)物質(zhì)鑒別影響多肽活性的活性結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)性分析多肽(諸如hGH)結(jié)構(gòu)和功能的方法。除那些通過丙氨酸或同源物掃描突變誘發(fā)鑒別為對生物活性至關(guān)重要的殘基外的殘基可為以非天然編碼的氨基酸進(jìn)行取代的良好候選物，此視所尋求的多肽的所需活性而定?；蛘?，鑒別為對生物活性至關(guān)重要的位點也可為以非天然編碼的氨基酸進(jìn)行取代的良好候選物，此也視所尋求的多肽的所需活性而定。另一替代選擇將使得能夠以非天然編碼的氨基酸于多肽鏈上各位置中進(jìn)行一系列取代，并且觀察多肽活性的作用。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將易于顯而易見，用于將經(jīng)非天然氨基酸取代的位置選擇到任何多肽中的任何方式、技術(shù)或方法都適用于本發(fā)明中。也可檢驗含有缺失的天然存在的hGH多肽突變體的結(jié)構(gòu)和活性，以測定可能耐受以非天然編碼的氨基酸進(jìn)行的取代的蛋白質(zhì)區(qū)域。例如參看Kostyo等人，歷oc力e附.^op/y^.925:314(1987);Lewis,U.等人/歷o/.C7zera.'253:2679-2687(1978)有關(guān)hGH的內(nèi)容。以類似方式，可使用蛋白酶消化和單克隆抗體鑒別引起hGH受體結(jié)合的hGH區(qū)域。例如參看Cunningham,B.等人5We"ce243:1330-1336(1989);Mills,J.等人，五"docn'"o/ogy,107:391-399(1980);Li,C,Mo/.Ce〃.歷oc/e肌，46:31-41(1982)(表明可缺失殘基134與149之間的氨基酸而不會損失活性)。已去除可能不耐受以非天然編碼的氨基酸進(jìn)行的取代的殘基后，可由hGH的三維晶體結(jié)構(gòu)和其結(jié)合蛋白檢驗每一剩余位置處所建議的取代的影響。參看deVos,A.等人，Sdewce，255:306-312(1992)有關(guān)hGH內(nèi)容；所有晶體結(jié)構(gòu)的hGH都可于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)(包括3HHR、1AXI和1HWG)(PDB，.可于國際互聯(lián)網(wǎng)rcsb.org得到)中得到，所述蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為含有蛋白質(zhì)和核酸大分子的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的中央數(shù)據(jù)庫。因此，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可易于鑒別可經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的氨基酸位。在一些實施例中，本發(fā)明的hGH多肽包含一個或一個以上定位于不破壞多肽螺旋或卩折疊二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)區(qū)域中的非天然存在的氨基酸。并入非天然編碼的氨基酸的示范性殘基可為從潛在受體結(jié)合區(qū)域(包括但不限于，位點I和位點II)排除、可完全或部分暴露到溶劑、與鄰近殘基具有最小或無氫鍵相互作用、可在最小限度上暴露到鄰近反應(yīng)性殘基并且可在如通過hGH多肽與其受體結(jié)合或未與其結(jié)合的三維晶體結(jié)構(gòu)、二級、三級或四級結(jié)構(gòu)所預(yù)測具高度靈活性(包括但不限于，C-D環(huán))或結(jié)構(gòu)上具剛性(包括但不限于，B螺旋)的區(qū)域中的那些殘基。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼的氨基酸并入與hGH二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)的一個或一個以上以下區(qū)域中的任何位置處與SEQIDNO:2中1-5(N端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，g卩A-B環(huán))、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，即B-C環(huán))、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，即C-D環(huán))、154-183(D螺旋)、184-191(C端)對應(yīng)的位置。在其它實施例中，GH多肽(例如，本發(fā)明的hGH多肽)包含至少一個經(jīng)位于GH(例如hGH)的至少一個區(qū)域中的至少一個氨基酸取代的非天然存在的氨基酸，所述至少一個區(qū)域是選自由與SEQIDNO:2中N端(1-5)、A-B環(huán)的N末端(32-46)、B-C環(huán)(97-105)、C-D環(huán)(132-149)和C端(184-191)對應(yīng)的區(qū)域組成的群組。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼的氨基酸并入GH(例如hGH)以下位置的一個或一個以上位置處SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的第1位前(意即，在N端)、I位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的29位、30位、33位、34位、35位、37位、39位、40位、49位、57位、59位、66泣、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、122位、126位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、159位、183位、186位和187位或其任何組合對應(yīng)的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的子集包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的29位、33位、35位、37位、39位、49位、57位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、186位和187位或其任何組合對應(yīng)的位點。對于GH(例如hGH)和其與GH(例如hGH)受體相互作用的晶體結(jié)構(gòu)的檢驗表明，這些氨基酸殘基的側(cè)鏈完全或部分與溶劑接近且非天然編碼的氨基酸的側(cè)鏈可指向蛋白質(zhì)表面外并且指向溶劑中。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位置包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、88位、91位、92位、94位、95位、99位、101位、103位、111位、131位、133位、134位、135位、136位、139位、140位、143位、145位和155位或其任何組合對應(yīng)的位點。對于GH(例如hGH)和其與GH(例如hGH)受體相互作用的晶體結(jié)構(gòu)的檢驗表明，這些氨基酸殘基的側(cè)鏈完全暴露至溶劑且天然殘基的側(cè)鏈指向溶劑中。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的子集包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的30位、74位、103位或其任何組合對應(yīng)的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的另一子集包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合對應(yīng)的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的另一子集包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合對應(yīng)的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的又一子集包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合對應(yīng)的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的另一子集包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合對應(yīng)的位點。在某些實施例中，并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的位點包括與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位對應(yīng)的位點。在一些實施例中，并入GH(例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸中的至少一者含有羰基，例如酮基。在某些實施例中，至少一個并入GH(例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸中的為對乙酰苯丙氨酸。在GH(例如hGH)含有多個非天然編碼的氨基酸的一些實施例中，一個以上并入GH(例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸為對乙酰苯丙氨酸。在GH(例如hGH)含有多個非天然編碼的氨基酸的一些實施例中，實質(zhì)所有并入GH(例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸為對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一個或一個以上位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置第l位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應(yīng)的位置30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應(yīng)的位置35位、92位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于一個或一個以上這些位置對應(yīng)的位置與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在對應(yīng)于(但不限于)SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位的位置處與水溶性聚合物連接。在一些實施例中，與GH(例如hGH)連接的水溶性聚合物包括一個或一個以上聚乙二醇分子(PEG)。聚合物(例如PEG)可為線性或分枝聚合物。通常，本發(fā)明中所使用的線性聚合物(例如PEG)的MW可為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。通常，本發(fā)明中所使用的分枝聚合物(例如PEG)的MW可為約1kDa到約100kDa，或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。聚合物(諸如PEG)將于本文中進(jìn)一歩進(jìn)行描述。在某些實施例中，GH(例如hGH)與水溶性聚合物(例如PEG)之間的鍵為肟鍵。本發(fā)明的某些實施例涵蓋包括通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物連接的GH(例如hGH)的組合物，其中所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，水溶性聚合物為PEG，例如線性PEG。在涵蓋至少一個通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的一些實施例中，PEG的MW可為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在涵蓋至少一個通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的一些實施例中，PEG的MW可為約1kDa到約100kDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。在一些實施例中，所述GH為GH，例如hGH;且在部分這些實施例中，所述GH(例如，hGH)具有至少約80%與SEQIDNO:2相同的序列；在一些實施例中，所述GH(例如，hGH)具有為SEQIDNO:2序列的序列。在一些實施例中，所述GH(例如，hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸；在部分這些實施例中，至少一個肟鍵是介于非天然編碼的氨基酸與至少一個水溶性聚合物之間。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸含有羰基，諸如酮基；在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸為對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，對乙酰苯丙氨酸在與SEQIDNO:2的35位對應(yīng)的位置處經(jīng)取代。因此，在一些實施例中，本發(fā)明提供通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物連接的GH(例如hGH)，其中所述共價鍵為后鍵。在某些實施例中，水溶性聚合物為PEG，且所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在某些實施例中，水溶性聚合物為作為分枝PEG的PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約1kDa到約100kDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。在一些實施例中，本發(fā)明提供GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)含有非天然編碼的氨基酸，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將非天然編碼的氨基酸并入GH(例如hGH)中與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約1kDa到約100kDa，或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。在一些實施例中，本發(fā)明提供GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)含有非天然編碼的氨基酸，其為含羰基的非天然編碼的氨基酸；其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于非天然編碼的含羰基氨基酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將非天然編碼的含羰基氨基酸并入GH(例如hGH)中與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處。2.在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約1kDa到約100kDa，或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。在一些實施例中，本發(fā)明提供含有包括酮基的非天然編碼的氨基酸的GH(例如hGH)，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于含有酮基的非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將含有酮基的非天然編碼的氨基酸并入GH(例如hGH)中與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約1kDa到約100kDa，或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。在一些實施例中，本發(fā)明提供含有非天然編碼的氨基酸(其為對乙酰苯丙氨酸)的GH(例如hGH)，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于對乙酰苯丙氨酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將對乙酰苯丙氨酸并入GH(例如hGH)中與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約1kDa到約100kDa，或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。在某些實施例中，本發(fā)明提供包括SEQIDNO:2的GH(例如hGH)，且其中所述GH(例如hGH)在與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處經(jīng)通過肟鍵與MW為約30kDa的線性PEG連接的對乙酰苯丙氨酸取代。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置第1位前(意即，在N端)、l位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDN0:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置35位、92位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH),其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位對應(yīng)的位置。在PEG為線性PEG的實施例中，所述PEG的MW可為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa,或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置第l位前(意即，在N端)、l位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位.、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、l卯位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置35位、92位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO1或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應(yīng)的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相應(yīng)氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH(例如hGH),其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相應(yīng)氨基酸的35位對應(yīng)的位置。在PEG為線性PEG的實施例中，所述PEG的MW可為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在一些實施例中，本發(fā)明提供GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其中所述GH是通過共價鍵與多個水溶性聚合物(例如多個PEG)連接，其中一個或一個以上所述共價鍵為介于非天然編碼的氨基酸的至少一者與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。所述GH(例如hGH)可與約2-100個水溶性聚合物(例如PEG)，或約2-50個水溶性聚合物(例如PEG)，約2-25個水溶性聚合物(例如PEG),或約2-10個水溶性聚合物(例如PEG),或約2-5個水溶性聚合物(例如PEG),或約5-100個水溶性聚合物(例如PEG),或約5-50個水溶性聚合物(例如PEG),或約5-25個水溶性聚合物(例如PEG)，或約5-10個水溶性聚合物(例如PEG),或約10-100個水溶性聚合物(例如PEG),或約10-50個水溶性聚合物(例如PEG),或約10-20個水溶性聚合物(例如PEG),或約20-100個水溶性聚合物(例如PEG),或約20-50個水溶性聚合物(例如PEG)，或約50-100個水溶性聚合物(例如PEG)連接?？蓪⑺鲆粋€或一個以上非天然編碼的氨基酸并入GH(例如hGH)中本文所述的任何位置處。在一些實施例中，將至少一個非天然編碼的氨基酸并入GH(例如hGH)中與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸包括至少一個非天然編碼的氨基酸，其為含羰基的非天然編碼的氨基酸，例如含酮基的非天然編碼的氨基酸，諸如對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，GH(例如hGH)包括對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，將對乙酰苯丙氨酸并入GH(例如hGH)中與SEQIDNO:2中35位對應(yīng)的位置處，其中所述對乙酰苯丙氨酸是通過肟鍵與所述聚合物中的一者(例如所述PEG中的一者)連接。在一些實施例中，水溶性聚合物(例如PEG)中的至少一者是通過與非天然編碼的氨基酸中至少一者的共價鍵與GH(hGH)連接。在一些實施例中，所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，多個水溶性聚合物(例如PEG)是通過與多個非天然編碼的氨基酸的共價鍵與GH(hGH)連接。在一些實施例中，至少一個共價鍵為肟鍵；在一些實施例中，多個共價鍵為肟鍵；在一些實施例中，實質(zhì)所有所述鍵為肟鍵。所述多個水溶性聚合物(例如PEG)可為線性聚合物、分枝聚合物或其任何組合。在并入一個或一個以上線性PEG的實施例中，所述線性PEG的MW為約0.1kDa到約100kDa，或約1kDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在并入一個或一個以上分枝PEG的實施例中，所述分枝PEG的MW為約1kDa到約100kDa，或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。應(yīng)了解，使用多個水溶性聚合物(例如PEG)的實施例大體上將使用MW比使用單一PEG的實施例中PEG的MW低的聚合物。因此，在一些實施例中，多個PEG的總MW為約0.1-500kDa，或約0.1-200kDa，或約0.1-100kDa，或約1-1000kDa，或約1-500kDa，或約1-200kDa，或約1-100kDa，或約10-1000kDa，或約10-500kDa，或約10-200kDa,或約10-100kDa，或約10-50kDa，或約20-1000kDa，或約20-500kDa，或約20-200kDa，或約20-100kDa，或約20-80kDa，約20-60kDa，約5-100kDa，約5-50kDa或約5-20kDa。人GH拮抗劑包括(但不限于)在1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、103位、109位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、123位和127位具有取代或在1位(意即，N端)具有添加或其任何組合(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3中的相應(yīng)氨基酸，或任何其它GH序列)的拮抗劑。多種非天然編碼的氨基酸可在hGH多肽的指定位置經(jīng)取代或并入hGH多肽的指定位置中?？偟恼f來，選擇特定非天然編碼的氨基酸用于基于對hGH多肽與其受體的三維晶體結(jié)構(gòu)的檢查進(jìn)行的并入，優(yōu)先用于保守性取代(意即，取代Phe、Tyr或Trp的含芳基非天然編碼的氨基酸，諸如對乙酰苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)和需要引入hGH多肽中的特定接合化學(xué)(例如，當(dāng)需要實現(xiàn)Hmsgen[3+2]與具有炔部分的水溶性聚合物的環(huán)加成或與具有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺鍵隨后并入膦部分時，引入4-疊氮基苯丙氨酸)。在一實施例中，'所述方法另外包括將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中，其中所述非天然氨基酸包含第一反應(yīng)性基團(tuán)；及使所述蛋白質(zhì)與包含第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子(包括但不限于，標(biāo)記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細(xì)胞毒性化合物、藥物、親和標(biāo)記、光親和標(biāo)記、反應(yīng)性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標(biāo)記、熒光團(tuán)、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團(tuán)、與其它分子共價或非共價相互作用的基團(tuán)、光籠鎖部分、光化輻射可激發(fā)部分、光致異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學(xué)可裂解基團(tuán)、光可裂解基團(tuán)、延長的側(cè)鏈、經(jīng)碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標(biāo)記部分、生物物理學(xué)探針、發(fā)磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電子致密基團(tuán)、磁性基團(tuán)、插入基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標(biāo)記、小分子、量子點、納米傳導(dǎo)物、放射性核苷酸、無線電傳導(dǎo)物、中子俘獲劑或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì))接觸。在一些情況下，將使非天然編碼的氨基酸取代與hGH多肽內(nèi)的其它添加、取代或缺失組合以影響hGH多肽的其它生物特質(zhì)。在一些情況下，所述其它添加、取代或缺失可增加hGH多肽的穩(wěn)定性(包括但不限于，對蛋白水解降解的抗性)或增加hGH多肽對其受體的親和性。在一些情況下，所述其它添加、取代或缺失可增加hGH多肽的溶解性(包括但不限于，當(dāng)在大腸桿菌或其它宿主細(xì)胞中表達(dá)時)。在一些實施例中，添加、取代或缺失可在大腸桿菌或其他重組宿主細(xì)胞中表達(dá)后增加多肽的溶解性。在一些實施例中，除對并入在大腸桿菌或其他重組宿主細(xì)胞中表達(dá)后導(dǎo)致多肽溶解性增加的非天然氨基酸的另一位點進(jìn)行選擇外，還選擇經(jīng)天然編碼或非天然編碼的氨基酸取代的位點。在一些實施例中，hGH多肽包含調(diào)節(jié)對hGH多肽受體的親和性、調(diào)節(jié)(包括但不限于，增加或降低)受體二聚化、使受體二聚體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期、調(diào)節(jié)釋放或生物利用度、便利純化或改良或改變特定投藥途徑的另一添加、取代或缺失。多種所述改變已于標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專利申請案第11/046,432號中得以描述，所述專利是以其全文引用的方式并入本文中。類似地，hGH多肽可包含蛋白酶裂解序列、反應(yīng)性基團(tuán)、抗體結(jié)合域(包括但不限于，F(xiàn)LAG或聚His)或其它基于親和性的序列(包括但不限于，F(xiàn)LAG、聚His、GST等)或改良對于多肽的檢測(包括但不限于，GFP)、純化或其它特質(zhì)的連接分子(包括但不限于，生物素)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸的取代產(chǎn)生GH(例如hGH)拮抗劑。用于并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的子集包括l位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、103位、109位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、123位、127位或1位前(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l、3的相應(yīng)氨基酸或任何其它GH序列)添加。在一些實施例中，GH(例如hGH)拮抗劑包含至少一個在使GH充當(dāng)拮抗劑的區(qū)域1-5(N端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，即A-B環(huán))、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，即B-C環(huán))、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，即C-D環(huán))、154-183(D螺旋)、184-191(C端)中進(jìn)行的取代。在其它實施例中，并入非天然編碼的氨基酸的示范性位點包括螺旋A的氨基末端區(qū)與一部分C螺旋內(nèi)的殘基。在另一實施例中，以非天然編碼的氨基酸(諸如對-疊氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代G120。在其它實施例中，使上文所列的取代與使GH(例如hGH多肽)成為GH(例如hGH)拮抗劑的額外取代組合。舉例而言，非天然編碼的氨基酸是在本文所鑒別的一個位置處經(jīng)取代，且同時在G120(例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)處引入取代。在一些實施例中，GH(例如hGH)拮抗劑包含與存在于GH(例如hGH)分子的受體結(jié)合區(qū)中的水溶性聚合物連接的非天然編碼的氨基酸。在一些情況下，l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或IO個以上氨基酸經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代。在一些情況下，GH(例如hGH)多肽另外包括以一個或一個以上非天然編碼的氨基酸對天然存在的氨基酸進(jìn)行1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上取代。舉例而言，在一些實施例中，GH(例如hGH)的以下區(qū)域中的一個或一個殘基經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代1-5(N端)、32-46(A-B環(huán)的N末端)、97-105(B-C環(huán))禾卩132-149(C-D環(huán))禾D184-191(C端)。在一些實施例中，GH(例如hGH)的以下區(qū)域中的一個或一個以上殘基經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代1-5(N端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，即A-B環(huán))、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，即B-C環(huán))、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，即C-D環(huán))、154-183(D螺旋)、184-191(C端)。在一些情況下，所述一個或一個以上非天然編碼的殘基與一個或一個以上具有較低分子量的線性或分枝PEG(質(zhì)量為約5-20kDa或更低)連接，從而相對于連接到單一較高分子量PEG的物質(zhì)使結(jié)合親和性得以增強(qiáng)且具有可比較的血清半衰期。在一些實施例中，以下位置處的GH(例如hGH)殘基中至多兩個經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代29位、30位、33位、34位、35位、37位、39位、40位、49位、57位、59位、(56位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、122位、126位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、159位、183位、186位和187位。在一些情況下，進(jìn)行以下取代對的任一者&38乂*與K140X*;K41Xf與K145X*;Y35X承與E88X承；Y35X糸與F92X*;Y35X氺與Y143X*;F92X承與Y143X*,其中乂*表示非天然編碼的氨基酸。并入兩個或兩個以上非天然編碼的氨基酸的優(yōu)選位點包括以下殘基的組合29位、33位、35位、37位、39位、49位、57位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、186位和187位。用于并入兩個或兩個以上非天然編碼的氨基酸的特別優(yōu)選的位點包括以下殘基的組合35位、88位、91位、92位、94位、95位、99位、101位、103位、111位、131位、133位、134位、135位、136位、139位、140位、143位、145位和155位。用于并入具有兩個或兩個以上非天然編碼的氨基酸的GH(例如hGH)中的優(yōu)選位點包括以下殘基的組合SEQIDNO:2第1位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)或其任何組合。K絲樣主激贈齢激頓就為獲得經(jīng)克隆hGH多肽的高水平表達(dá)，將編碼本發(fā)明的hGH多肽的聚核苷酸亞克隆到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有用于直接轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，且如果對于編碼蛋白質(zhì)的核酸而言，還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知適當(dāng)?shù)募?xì)菌啟動子，且例如描述于Sambrook等人MolecularCloning,ALaboratoryManual(200l)和Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology(1999)中。用于表達(dá)本發(fā)明的hGH多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可利用包括(但不限于)丈應(yīng),蘑、^"應(yīng)^蘑(萬"c/〃M)、,i俊卓應(yīng)蘑(AeWomo"似_/7"o,esce/w)、銜綠,卓應(yīng)蘑(尸"Mrfomoracwaerag/wtm)、戀4俊卓應(yīng)麥(jRsewt/o歸W(M/wf油)禾口沙/7歷虔(5W歸we〃a)中者(Palva等人，Gene22:229-235(1983);Mosbach等人，Nature302:543-545(1983))。所述表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒為市售。用于哺乳動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)為己為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知且也為市售。在使用正交tRNA和氨?；鵷RNA合成酶(上文所述)表達(dá)本發(fā)明的hGH多肽的情況下，供表達(dá)的宿主細(xì)胞是基于其使用正交組份的能力選擇。示范性宿主細(xì)胞包括革蘭氏陽性細(xì)菌(Gram-positivebacteria)(包括但不限于，顏，潛,^(^e心)、祐草免敏,,(5.w&"fe)或鏈霉^(幼^o，c"))及革蘭氏陰性細(xì)菌(丈嚴(yán)/,蘑、^i俊卓應(yīng)蘑(尸^w/卿o"mywomyce/M)、欽泰俊卓應(yīng)蘿(尸sra(io腳rt(Waeragz'wojfl)、,^俊卓應(yīng)虔(尸sei^omowfiW/n^'&))以及酵母和其他真核細(xì)胞?？墒褂萌绫疚乃龅陌?-tRNA/0-RS對的細(xì)胞。本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞或非真核宿主細(xì)胞提供合成包含極大有用量的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。一方面，組合物視情況包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，或可以活體內(nèi)蛋白質(zhì)制造方法(詳見本文提供的重組蛋白質(zhì)制造和純化方法)達(dá)成的量的蛋白質(zhì)。另一方面，所述蛋白質(zhì)視情況以包括(但不限于)每升包括(但不限于)細(xì)胞溶解產(chǎn)物、緩沖劑、醫(yī)藥學(xué)緩沖劑或其它液體懸浮液(包括但不限于，包括但不限于約1nl到約100L或100L以上的任一體積)中至少10微克蛋白質(zhì)、至少50微克蛋白質(zhì)、至少75微克蛋白質(zhì)、至少100微克蛋白質(zhì)、至少200微克蛋白質(zhì)、至少250微克蛋白質(zhì)、至少500微克蛋白質(zhì)、至少1毫克蛋白質(zhì)或至少10毫克蛋白質(zhì)的濃度存在于組合物中。在真核細(xì)胞中制造大量(包括但不限于，高于以包括但不限于活體外翻譯的其它方法通常可能產(chǎn)生的量)包括至少一個非天然氨基酸的蛋白質(zhì)為本發(fā)明的一個特征。本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞或非真核宿主細(xì)胞提供生物合成包含極大有用量的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。舉例而言，可制造出包括(但不限于)每升細(xì)胞提取液、細(xì)胞溶解產(chǎn)物、培養(yǎng)基、緩沖液和/或類似物至少10)!g、至少50pg、至少75pg、至少100pg、至少200ng、至少250|xg或至少500(ig、至少1mg、至少2mg、至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少6mg、至少7mg、至少8mg、至少9mg、至少10mg、至少20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g或10g以上蛋白質(zhì)的濃度的包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)、載體、宿主細(xì)胞、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基和與hGH多肽宿主細(xì)胞的分離己于標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專利申請案第11/046,432號中進(jìn)一步描述，所述專利是以引用的方式并入本文中。K層錄眾減本發(fā)明的hGH多肽通常是在重組系統(tǒng)中表達(dá)后經(jīng)純化?？赏ㄟ^此項技術(shù)已知的多種方法從宿主細(xì)胞中純化出hGH多肽。細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的hGH多肽可具有弱溶解性或不溶(包涵體的形式)?？梢子诶帽疚乃沂镜姆椒ê痛隧椉夹g(shù)中已知的方法對hGH多肽進(jìn)行氨基酸取代，所述取代是出于增加重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的溶解性的目的選擇。在蛋白質(zhì)不溶的情況下，可通過離心從宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)物中收集蛋白質(zhì)，且隨后可進(jìn)一步使細(xì)胞均質(zhì)化。在蛋白質(zhì)具弱溶解性的情況下，可加入包括但不限于聚乙烯亞胺(PEI)的化合物以誘使部分可溶蛋白質(zhì)沉淀。隨后，可通過離心便利地收集已沉淀的蛋白質(zhì)?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員己知的多種方法破碎重組宿主細(xì)胞或使其均質(zhì)化以從所述細(xì)胞內(nèi)釋放包涵體?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)執(zhí)行宿主細(xì)胞的破碎或均質(zhì)化，所述技術(shù)包括(但不限于)以酶破碎細(xì)胞、超聲波處理、杜恩斯均質(zhì)化(doimcehomogenization)或高壓釋放破碎。在本發(fā)明方法的一個實施例中，使用高壓釋放技術(shù)破碎大腸桿菌宿主細(xì)胞，從而釋放hGH多肽的包涵體。當(dāng)處理hGH多肽的包涵體時，有益的使重復(fù)的均質(zhì)化時間減到最小，以便使包涵體的產(chǎn)量最大化，而不會因諸如溶解、機(jī)械剪切或蛋白質(zhì)水解等因素而有所損失。接著，可使用此項技術(shù)中已知的多種適當(dāng)增溶劑中的任一種溶解不溶或已沉淀的hGH多肽?？梢阅蛩鼗螓}酸胍溶解hGH多肽。應(yīng)使溶解的hGH多肽的體積減到最小，從而能夠便利地使用易處理的批量大小制造大批量。這一因素對于可以數(shù)千升體積成批生長重組宿主的大規(guī)模商業(yè)工廠而言尤為重要。此外，當(dāng)在大規(guī)模商業(yè)工廠中制造hGH多肽、尤其供人類使用的醫(yī)藥時，如可能，應(yīng)當(dāng)避免可損壞機(jī)器和容器或蛋白制品本身的有害化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的方法中已表明，可使用較溫和的變性劑尿素替代較苛刻的變性劑鹽酸胍來溶解hGH多肽包涵體。使用尿素在有效溶解hGH多肽包涵體的同時也顯著減小損壞hGH多肽的制造和純化過程中所利用的不銹鋼設(shè)備的風(fēng)險。在可溶hGH蛋白的情況下，可將hGH分泌到細(xì)胞周質(zhì)間隙或培養(yǎng)基中。此外，可溶hGH可存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在執(zhí)行純化步驟甜可能需要濃縮可溶hGH?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從例如細(xì)胞溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基中濃縮可溶hGH。此外，可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)破碎宿主細(xì)胞，并且將可溶hGH從宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)間隙中釋放出來。當(dāng)將hGH多肽制造為融合蛋白時，可去除融合序列。可通過酶裂解或化學(xué)裂解實現(xiàn)融合序列的去除。可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實現(xiàn)融合序列的酶去除。對于去除融合序列的酶的選擇將通過融合物的身份確定，且如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見，反應(yīng)條件將通過酶的選擇予以確定。化學(xué)裂解可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試劑(包括但不限于溴化氰、TEV蛋白酶和其它試劑)實現(xiàn)?？赏ㄟ^所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從經(jīng)裂解的融合序列中純化出所裂解的hGH多肽。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見，所述方法將通過融合序列和hGH多肽的身份和特性確定。用于純化的方法可包括(但不限于)尺寸排阻色譜法、疏水相互作用色譜法、離子交換色譜法或透析法，或其任何組合。也可純化hGH多肽，從而將DNA從蛋白質(zhì)溶液中去除。DNA可通過此項技術(shù)中已知的任何適當(dāng)方法(諸如沉淀或離子交換色譜法)予以去除，且也可通過用核酸沉淀劑(諸如但不限于硫酸魚精蛋白)沉淀來去除?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法使hGH多肽與已沉淀的DNA分離，包括但不限于，離心或過濾。去除宿主核酸分子對于將使用hGH多肽治療人類的工廠而言為一重要因素，而且本發(fā)明的方法會將宿主細(xì)胞DNA減少到醫(yī)藥學(xué)上可接受的程度。小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵的方法也可用于蛋白質(zhì)表達(dá)中，包括(但不限于)發(fā)酵罐、搖瓶、流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)。這些方法的每一種都可在分批、饋料分批或連續(xù)模式工藝中執(zhí)行。一般可使用此項技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)方法回收本發(fā)明的人hGH多肽。舉例而言，可將培養(yǎng)基或細(xì)胞溶解產(chǎn)物離心或過濾以去除細(xì)胞碎片?？蓪⑸锨逡簼饪s或稀釋到所需體積，或?qū)⑵渫笧V到適當(dāng)緩沖液中以調(diào)節(jié)制劑供進(jìn)一歩純化。進(jìn)一步純化本發(fā)明的hGH多肽包括使去酰胺化和剪短形式的hGH多肽變異體與完整形式分離。以下示范性程序中的任一者都可用于純化本發(fā)明的hGH多肽親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(包括但不限于使用DEAESEPHAROSE);二氧化硅色譜；高效液相色譜(HPLC);反相HPLC(RP-HPLC);凝膠過濾色譜(包括但不限于使用SEPHADEXG-75);疏水相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜焦聚；置換色譜；電泳程序(包括但不限于制備型等電聚焦)；差別溶解性(differentialsolubility)(包括但不限于硫酸銨沉淀);SDS-PAGE;或萃取。根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知和使用的標(biāo)準(zhǔn)程序，可部分或?qū)嵸|(zhì)完全將本發(fā)明的蛋白質(zhì)純化成均質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)、包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的抗體、包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的結(jié)合搭配物等。因此，可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種回收并純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括(但不限于)硫酸銨或乙醇沉淀、酸或堿萃取、柱色譜、親和柱色譜、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、凝集素色譜、凝膠電泳和其類似方法?？梢曅枰獙⒌鞍踪|(zhì)再折疊步驟用于制造正確折疊的成熟蛋白質(zhì)。當(dāng)需要高純度時，可在最終純化步驟中使用高效液相色譜(HPLC)、親和色譜或其它適當(dāng)方法。在一實施例中，將所制造的抗非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì))的抗體用作純化試劑包括(但不限于)用于包含一種或一種以上非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的基于親和性的純化。部分純化或純化成均質(zhì)后，視需要，將多肽視情況用于多種用處，包括(但不限于)用作檢定組份、治療劑、預(yù)防劑、診斷劑、研究試劑和/或作為抗體制造的免疫原。除本文所述的其它參考文獻(xiàn)外，多種純化/蛋白質(zhì)折疊方法也已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，包括(但不限于)以下參考文獻(xiàn)中所述的那些方法R.Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag，N.Y.(1982);Deutscher,MethodsinEnzymologv第182巻GuidetoProteinPurification,AcademicPress,Inc.N.Y,(1990);Sandana,(1997)BioseparationofProteins,AcademicPress,Inc.;Bollag等人(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss,NY;Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ，HarrisandAngal,(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Harris禾口Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag，NY;JansonandRyden,(1998)ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethodsandArmlications,第2版Wiley-VCH,NY;禾口Walker(1998),ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ:和本文所引用的參考文獻(xiàn)。在真核宿主細(xì)胞或非真核宿主細(xì)胞中以非天然氨基酸制造所需蛋白質(zhì)或多肽的一個優(yōu)勢在于所述蛋白質(zhì)或多肽通常將以其天然構(gòu)象折疊。然而，在本發(fā)明的某些實施例中，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，合成、表達(dá)和/或純化后，蛋白質(zhì)可具有與相關(guān)多肽的所需構(gòu)象不同的構(gòu)象。在本發(fā)明一方面中，視情況使所表達(dá)的蛋白質(zhì)變性且隨后使其復(fù)性。這是利用此項技術(shù)中已知的方法實現(xiàn)，包括(但不限于)通過將伴侶素加入所需蛋白質(zhì)或多肽中、通過將蛋白質(zhì)溶解于離液劑(諸如鹽酸胍)中、利用蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶等?？偟恼f來，有時需要使所表達(dá)的多肽變性和還原，且隨后使所述多肽再折疊成優(yōu)選構(gòu)象。舉例而言，可將胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侶素加入所需翻譯產(chǎn)物中。還原、變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知(參看，上述參考文獻(xiàn)和Debinski,等人(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman禾nPastan(1993)Bioconiug.Chem..4:581-585:和Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。舉例而言，Debinski等人描述在胍-DTE中變性和還原包涵體蛋白。可在含有包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中再折疊蛋白質(zhì)?？勺⑷牖蛄硗庖迫朐僬郫B試劑以與所述一種或一種以上多肽或其它表達(dá)產(chǎn)物接觸，或可注入或另外移入所述一種或一種以上多肽或其它表達(dá)產(chǎn)物以與再折疊試劑接觸。在以原核生物制造hGH多肽的情況下，由此制造的hGH多肽可能折疊異常，且因此缺乏或具有降低的生物活性。所述蛋白質(zhì)的生物活性可通過"再折疊"恢復(fù)。一般說來，通過例如使用一種或一種以上離液劑(例如，尿素和/或胍)和能夠還原二硫鍵的還原劑(例如，二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇(2-ME))溶解(其中hGH多肽也不溶)、伸展和還原多肽鏈?zhǔn)拐郫B異常的hGH多肽再折疊。接著，在適度濃度的離液劑下，加入氧化劑(例如，氧、胱氨酸或胱氨)，這使得再形成二硫鍵?？墒褂么隧椉夹g(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法使hGH多肽再折疊，諸如美國專利第4,511,502號、第4，511，503號和第4,512,922號中所述的方法，所述專利是以引用的方式并入本文中。也可使hGH多肽與其它蛋白質(zhì)共折疊以形成雜二聚體或雜多聚體。再折疊或共折疊后，可進(jìn)一步純化hGH多肽。hGH的純化可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)實現(xiàn)，包括疏水相互作用色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜、親和色譜和其類似技術(shù)或其任何組合。額外純化也可包括干燥或沉淀經(jīng)純化蛋白質(zhì)的步驟。純化后，可于不同緩沖液中交換hGH和/或通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種加以濃縮，所述方法包括(但不限于)透濾和透析?？墒挂詥我唤?jīng)純化蛋白質(zhì)形式提供的hGH經(jīng)歷聚集和沉淀。經(jīng)純化hGH可為至少90%純(如通過反相高效液相色譜、RP-HPLC或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-PAGE測量)或至少95%純或至少98%純，或至少99%純或更高純度。不管hGH純度的確切數(shù)字值如何，hGH已具有足夠純度以用作醫(yī)藥產(chǎn)品或用于進(jìn)一歩加工(諸如與諸如PEG的水溶性聚合物接合)。在不存在其它活性成分或蛋白質(zhì)(除賦形劑、載劑和穩(wěn)定劑、血清白蛋白和其類似物外)的情況下可將某些hGH分子用作治療劑，或可使其與另一蛋白質(zhì)或聚合物復(fù)合?？蓪?xì)胞溶解產(chǎn)物、提取液、培養(yǎng)基、包涵體、宿主細(xì)胞周質(zhì)間隙、宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或包涵h(huán)GH多肽的其它材料或?qū)τ扇魏畏蛛x步驟產(chǎn)生的任何hGH多肽混合物執(zhí)行多種分離步驟中的任一種，所述分離步驟包括(但不限于)親和色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、凝膠過濾色譜、高效液相色譜("HPLC")、反相HPLC("RP-HPLC")、膨脹床吸附或其任何組合和/或重復(fù)且以任何適當(dāng)次序。用于執(zhí)行本文所述的技術(shù)的設(shè)備和其它必需材料為市售。泵、部分收集器、監(jiān)測器、記錄儀和全系統(tǒng)是例如從AppliedBiosystems(FosterCity,CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)禾口.AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway,NJ)得至U。色i普材料(包括但不限于交換基質(zhì)材料、媒質(zhì)和緩沖液)也是從所述公司得到?？墒褂脤Ｓ迷O(shè)備(諸如泵)更快速的實現(xiàn)本文所述的柱色譜方法中的平衡和其它步驟(諸如洗滌和洗提)。市售泵包括(但不限于)HILOADPumpP-50、PeristalticPumpP-l、PumpP-901禾口PumpP-90(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。部分收集器的實例包括RediFracFractionCollector、FRAC-100和FRAC-200FractionCollectors禾口SUPERFRACFractionCollector(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。也可用混合機(jī)以形成pH值和線性濃度梯度。市售混合機(jī)包括GradientMixerGM-1和In陽LineMixer(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)?？墒褂萌魏问惺郾O(jiān)測器監(jiān)測色譜過程?？墒褂盟霰O(jiān)測器搜集類似UV、pH值和傳導(dǎo)率等信息。監(jiān)測器的實例包括MonitorUV-l、UVICORDSII、MonitorUV-MII、MonitorUV-900、MonitorUPC-900、MonitorpH/C-900禾卩ConductivityMonitor(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。實際上，全系統(tǒng)為市售，包括AmershamBiosciences(Piscataway,NJ)的各種AKTA⑧系統(tǒng)。例如，在本發(fā)明的一個實施例中，可通過首先以尿素使所得純hGH多肽變性，隨后在適當(dāng)pH值下于含有還原劑(諸如DTT)的TRIS緩沖液中進(jìn)行稀釋來使hGH多肽還原和變性。在另一實施例中，hGH多肽是在介于約2M到約9M之間的濃度范圍內(nèi)的尿素中變性，隨后在約5.0到約8.0的范圍內(nèi)的pH值下于TRIS緩沖液中進(jìn)行稀釋。接著，可培育本實施例中的再折疊混合物。在一實施例中，在室溫下培育再折疊混合物四小時到二十四小時。接著，可進(jìn)一步分離或純化經(jīng)還原和變性的hGH多肽混合物。如本文所述，可調(diào)節(jié)第一hGH多肽混合物的pH值，隨后執(zhí)行任何隨后的分離步驟。此外，可使用此項技術(shù)中已知的技術(shù)濃縮第一hGH多肽混合物或其任何隨后的混合物。而且，可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)以適于下一分離歩驟的緩沖液交換包含第一hGH多肽混合物或其任何隨后混合物的洗提緩沖液。離子交換色譜可執(zhí)行離子交換色譜。一般參看IonExchangeChromatography:PrinciplesANDMethods(目錄編號18-1114-21,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))。市售離子交換柱包括HITRAP、HIPREP⑧和HILOADColumns(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。所述柱利用強(qiáng)陰離子交換劑，諸如QSEPHAROSEFastFlow、QSEPHAROSEHighPerformance和QSEPHAROSEXL;強(qiáng)陽離子交換劑，諸如SPSEPHAROSEHighPerformance、SPSEPHAROSEFastFlow禾卩SPSEPHAROSEXL;弱陰離子交換劑，諸如DEAESEPHAROSEFastFlow;和弱陽離子交換劑，諸如CMSEPHAROSEFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)?？稍诩兓に嚨娜魏坞A段對hGH多肽執(zhí)行陰離子或陽離子交換柱色譜以實質(zhì)分離純hGH多肽?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)年栯x子交換基質(zhì)執(zhí)行陽離子交換色譜步驟。有用的陽離子交換基質(zhì)包括(但不限于)纖維狀、多孔、非多孔、微粒狀、珠狀或交聯(lián)陽離子交換基質(zhì)材料。所述陽離子交換基質(zhì)材料包括(但不限于)纖維素、瓊脂、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何前述材料的復(fù)合物。陽離子交換基質(zhì)可為任何適當(dāng)?shù)年栯x子交換劑，包括強(qiáng)和弱陽離子交換劑。強(qiáng)陽離子交換劑可在寬pH值范圍內(nèi)保持離子化，且因此能夠在寬pH值范圍內(nèi)與hGH結(jié)合。然而，弱陽離子交換基可隨pH值的變化而失去離子化作用。舉例而言，當(dāng)pH值降到約pH4或pH5以下時，弱陽離子交換劑可失去電荷。適當(dāng)強(qiáng)陽離子交換劑包括(但不限于)帶電官能團(tuán)，諸如磺丙基(SP)、磺酸甲酯(S)或磺乙基(SE)。陽離子交換基質(zhì)nJ為具有在約2.5到約6.0內(nèi)的hGH結(jié)合pH值范圍的強(qiáng)陽離子交換劑?；蛘?，強(qiáng)陽離子交換劑可具有在約pH2.5到約pH5.5內(nèi)的hGH結(jié)合pH值范圍。陽離子交換基質(zhì)可為具有約3.0的hGH結(jié)合pH值的強(qiáng)陽離子交換劑。或者，陽離子交換基質(zhì)可為具有在約6.0到約8.0內(nèi)的hGH結(jié)合pH值范圍的強(qiáng)陽離子交換劑。陽離子交換基質(zhì)可為具有在約S.0到約12.5內(nèi)的hGH結(jié)合pH值范圍的強(qiáng)陽離子交換劑。或者，強(qiáng)陽離子交換劑可具有在約pH8.0到約pH12.0內(nèi)的hGH結(jié)合pH值范圍。裝載hGH之前，例如可使用若干柱體積稀弱酸(例如，4柱體積20mM乙酸，pH3)平衡陽離子交換基質(zhì)。平衡后，可加入hGH并且可洗滌柱1次到數(shù)次，隨后也使用弱酸溶液(諸如弱乙酸或磷酸溶液)實質(zhì)完全洗提純hGH。舉例而言，可使用約2-4柱體積20mM乙酸(pH3)洗滌柱。例如使用2-4柱體積0.05M乙酸鈉(pH5.5)或與0.1M氯化鈉混合的0.05M乙酸鈉(pH5.5)進(jìn)行的額外洗滌也可使用?；蛘?，使用此項技術(shù)中己知的方法，可使用若干柱體積稀、弱堿平衡陽離子交換基質(zhì)。另外，可通過使陽離子交換劑基質(zhì)與具有足夠低pH值或離子強(qiáng)度以從基質(zhì)中置換出hGH的緩沖液接觸來洗提實質(zhì)純的hGH。洗提緩沖液的pH值可在約pH2.5到約pH6.0的范圍內(nèi)。更具體的說，洗提緩沖液的pH值可在約pH2.5至約pH5.5，約pH2.5至約pH5.0范圍。洗提緩沖液可具有約3.0的pH值。另外，洗提緩沖液的量可廣泛變化，并且一般將在約2至約IO柱體積的范圍內(nèi)。此外，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適緩沖液可包括(但不限于)濃度在至少約5mM到至少約100mM的范圍內(nèi)的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、HEPES和MES緩沖液。將hGH吸附到陽離子交換劑基質(zhì)上后，可通過使所述基質(zhì)與具有足夠高pH值或離子強(qiáng)度以從所述基質(zhì)中置換出hGH的緩沖液接觸來洗提實質(zhì)純的hGH。洗提緩沖液的pH值可在約pH8.0到約pH12.5的范圍內(nèi)。更具體說來，洗提緩沖液的pH值可在約pH8.0到約pH12.0的范圍內(nèi)。用于高pH值洗提實質(zhì)純的hGH的適當(dāng)緩沖液包括(但不限于)濃度在至少約5mM到至少約lOOmM的范圍內(nèi)的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、HEPES和MES緩沖液。此外，可使用具有0.1M硼酸鉀、0.6M氯化鉀、0.1MEDTA的緩沖液，pH8.7。也可使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗提實質(zhì)純的hGH，諸如二甘氨酸緩沖液，其包括約50到100mM二甘氨酸、約75mM二甘氨酸；25到約100mM氯化鈉、約50mM氯化鈉；和約0.05到約0.5mMEDTA，約0.1mMEDTA(pH7.5)。反相色譜可遵循所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的適當(dāng)方案執(zhí)行RP-HPLC以純化蛋白質(zhì)。例如參看Pearson等人，ANALBiOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人，J.CHROM.(1983)268:112-119;Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359:391-402?？蓪GH多肽執(zhí)行RP-HPLC以分離出實質(zhì)純的hGH多肽。就此點看來，可使用具有具多種長度的垸基官能團(tuán)的二氧化硅衍生化樹脂，包括(但不限于)至少約C3到至少約C3o、至少約C3到至少約C2?；蛑辽偌sC3到至少約C,8樹脂?；蛘?，可使用聚合樹脂。舉例而言，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd樹脂，其為苯乙烯聚合物樹脂。也可使用具有多種垸基鏈長度的氰基或聚合樹月旨。此夕卜，可以諸如乙醇的溶劑洗滌RP-HPLC柱。SourceRP柱為RP-HPLC柱的另一實例?？墒褂煤须x子配對劑和有機(jī)改性劑(諸如甲醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈或乙醇)的適當(dāng)洗提緩沖液以從RP-HPLC柱中洗提出hGH多肽。最常用的離子配對劑包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基銨、四丁基銨和三乙基乙酸銨?？墒褂靡环N或一種以上優(yōu)選用于減少分離時間和減小峰寬的梯度或與梯度條件相當(dāng)?shù)臈l件執(zhí)行洗提。另一種方法涉及使用兩種具有不同溶劑濃度范圍的梯度。本文中使用的適當(dāng)洗提緩沖液的實例包括(但不限于)乙酸銨和乙腈溶液?？衫缡褂肧OURCERP柱以乙腈梯度分離或純化hGH。疏水相互作用色譜純化技術(shù)可對hGH多肽執(zhí)行疏水相互作用色譜(HIC)。一般參看HydrophobicInteractionChromatographyHandbook:PrinciplesandMethods(Cat.No.18-1020-90,AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)，所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。適當(dāng)HIC基質(zhì)可包括(但不限于)經(jīng)垸基或芳基取代的基質(zhì)，諸如經(jīng)丁基、己基、辛基或苯基取代的基質(zhì)，包括瓊脂、交聯(lián)瓊脂、瓊脂糖、纖維素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基質(zhì)；和混合型樹脂，包括(但不限于)聚乙二胺樹脂或經(jīng)丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)樹脂。疏水相互作用柱色譜的市售來源包括(但不限于)HITRAP、HIPREP⑧和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。簡單說來，裝載前，可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(諸如乙酸/氯化鈉溶液或含有硫酸銨的HEPES)平衡HIC柱?？蓪⒘蛩徜@用作裝載HIC柱的緩沖液。裝載hGH多肽后，可使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和條件洗滌所述柱以去除HIC柱上不合需要的物質(zhì)但剩下hGH多肽。可用約3到約10柱體積的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗提hGH多肽，所述緩沖液諸如含有EDTA和濃度比平衡緩沖液低的硫酸銨的HEPES緩沖液，或乙酸/氯化鈉緩沖液等。例如使用磷酸鉀梯度降低線性鹽梯度也可用于洗提hGH分子。接著，可例如通過過濾(諸如透濾或超濾)濃縮洗提液?？衫猛笧V去除用于洗提hGH多肽的鹽?？衫缡褂媚z過濾(GelFILTRATION:PRINCIPLESANDMethods(Cat.No.18-1022-18，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文)、羥基磷灰石色譜(適當(dāng)基質(zhì)包括(但不限于)HA-Ultrogel,HighResolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羥基磷灰石(BioRad)、Bio-GelHTP羥基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨脹床吸附、超濾、透濾、凍干和其類似方法對第一hGH多肽混合物或其任何隨后的混合物執(zhí)行分離步驟，以去除任何過量的鹽并且以用于下一分離歩驟或甚至最終藥物產(chǎn)物配方的適當(dāng)緩沖液置換所述緩沖液。可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的技術(shù)在本文所述的各歩驟處監(jiān)測hGH多肽(包括實質(zhì)純的hGH多肽)的產(chǎn)量。也可在最后的分離步驟時使用所述技術(shù)評定實質(zhì)純的hGH多肽的產(chǎn)量。舉例而言，可使用數(shù)個具有多種烷基鏈長度的反相高效液相色譜柱(諸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及陽離子交換HPLC和凝膠過濾HPLC監(jiān)測hGH多肽的產(chǎn)量。純度可使用諸如SDS-PAGE的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或通過使用蛋白印跡法(Westernblot)和ELISA檢定測量hGH多肽來予以測定。舉例而言，可產(chǎn)生對抗由陰性對照酵母發(fā)酵和陽離子交換回收分離出的蛋白質(zhì)的多克隆抗體。也可使用抗體探査污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的存在。RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)是由二氧化硅凝膠顆粒組成，其表面具有C4烷基鏈。hGH多肽與蛋白質(zhì)雜質(zhì)的分離是基于疏水相互作用強(qiáng)度的差異。洗提是以稀三氟乙酸中的乙腈梯度執(zhí)行。制備型HPLC是使用不銹鋼柱(填充有2.8到3.2升VydacC4硅膠)執(zhí)行。通過加入三氟乙酸酸化羥基磷灰石Ultrogel洗出液并將其裝載于VydacC4柱。就洗滌和洗提而言，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗提餾分并立即以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行中和。匯集IPC界限內(nèi)的hGH多肽部分。DEAE瓊脂糖(GEHealthcar)材料是由與瓊脂糖珠粒表面共價結(jié)合的二乙胺基乙基(DEAE)組成。h(H多肽與DEAE基團(tuán)的結(jié)合是通過離子相互作用介導(dǎo)。乙腈和三氟乙酸穿過柱而無保留。已洗去這些物質(zhì)后，通過用低pH值下的乙酸鹽緩沖液洗滌柱去除痕量雜質(zhì)。接著，用中性磷酸鹽緩沖液洗滌柱，并且用具有增加的離子強(qiáng)度的緩沖液洗提hGH多肽。以DEAE瓊脂糖的快速流動壓緊柱。調(diào)節(jié)柱體積以確保hGH多肽裝載量在每毫升凝膠3-10mghGH多肽的范圍內(nèi)。用水和平衡緩沖液(磷酸鈉/磷酸鉀)洗滌柱。裝載所匯集的HPLC洗出液餾分，并用平衡緩沖液洗滌柱。接著，用洗滌緩沖液(乙酸鈉緩沖液)洗滌隨后用平衡緩沖液洗滌柱。隨后，以洗提緩沖液(氯化鈉、磷酸鈉/磷酸鉀)從柱中洗提出hGH多肽，并且根據(jù)主要洗提概況收集單一洗提餾分。將DEAE瓊脂糖柱洗出液調(diào)到指定的傳導(dǎo)率。將所得藥物無菌過濾到特氟綸瓶(Teflonbottle)中并在-7(TC下儲存?？墒褂玫钠渌椒ò?但不限于)去除內(nèi)毒素的歩驟。內(nèi)毒素為一種位于革蘭氏陰性宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌)外膜上的脂多糖(LPS)。用于減少內(nèi)毒素含量的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且包括(但不限于)使用二氧化砝支撐體、玻璃粉或羥基磷灰石的純化技術(shù)、反相色譜、親和色譜、尺寸排阻色譜、陰離子交換色譜、疏水相互作用色譜、這些方法的組合和其類似方法?？赡苄枰揎椈蝾~外方法將污染物(諸如共遷移蛋白)從所需多肽中去除。用于測量內(nèi)毒素含量的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且包括(但不限于)鱟變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物(LimulusAmebocyteLysate,LAL)檢定?？墒褂枚喾N方法和程序評定包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的hGH蛋白的產(chǎn)量和純度，所述方法和程序包括(但不限于)Bradford檢定、SDS-PAGE、銀染色SDS-PAGE、考馬斯染色SDS-PAGE(coomassiestainedSDS-PAGE)、質(zhì)譜(包括但不限于MALDI-TOF)和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的表征蛋白質(zhì)的其它方法。其它方法包括(但不限于)與蛋白質(zhì)染色方法偶聯(lián)的SDS-PAGE、免疫印跡、基質(zhì)輔助激光解吸/電離-質(zhì)譜法(MALDI-MS)、液相色譜/質(zhì)譜、等電聚焦、分析型陰離子交換、色譜聚焦和圓二色譜法。也可將包括(但不限于)本文所列的有關(guān)分離和純化的程序用于配方研究中，以評定本發(fā)明hGH多肽的穩(wěn)定性、PEG化形式hGH多肽的穩(wěn)定性和PEG化反應(yīng)的進(jìn)程?！?/.贈,資頓表這己使用數(shù)種策略將非天然氨基酸引入非重組宿主細(xì)胞、經(jīng)突變誘發(fā)的宿主細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)中。這些系統(tǒng)也適用于制造包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽。以反應(yīng)側(cè)鏈?zhǔn)拱被?諸如Lys、Cys和Tyr)衍生化將導(dǎo)致賴氨酸轉(zhuǎn)化成N、乙?；?賴氨酸?；瘜W(xué)合成也提供一種用于并入非天然氨基酸的簡單方法。隨著近來對于肽片段的酶連接和天然化學(xué)連接研究的發(fā)展，可能制造出較大蛋白質(zhì)。例如參看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,A腿.Rev.Biochem.69:923(2000)。以化學(xué)方法肽連接和天然化學(xué)連接已描述于美國專利第6,184,344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO02/098902和WO03/042235中，所述專利都是以引用的方式并入本文中。已使用將經(jīng)所需非天然氨基酸化學(xué)酰基化的抑制物tRNA加入能夠支持蛋白質(zhì)生物合成的活體外提取物中的通用活體外生物合成方法將超過100個非天然氨基酸位點特異性并入具有實際任何尺寸的多種蛋白質(zhì)中。例如參看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G,Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34:621(1995);CJ.Noren,SJ.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.GSchultz,爿gewera/me,/zo<i/ors"e,eczycz'wcorpora"'owo/www幽ra/麵fwoac油fwto;rato'眠Science244:182-188(1989);禾口J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,_8/c^_ywMe"cs"e層speciez'wcor/ora"'owo/awow-wWwra/謂/wo"c/<iWoa/o/，e/"'<ie，J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已將廣泛多種官能團(tuán)引入蛋白質(zhì)中以供有關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)折疊、酶機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。己研究出一種稱為選擇性壓力并入的活體內(nèi)方法來開發(fā)混雜的野生型合成酶。例如參看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,RM.Dong,L,Moroder禾口R,Huber,FASEBJ.，13:41(1999)。使向細(xì)胞供應(yīng)特定天然氨基酸的相關(guān)代謝途徑己切斷的營養(yǎng)缺陷型菌株生長于含有有限濃度天然氨基酸的基本培養(yǎng)基中，同時阻遏目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。穩(wěn)定生長期開始時，耗盡天然氨基酸并以非天然氨基酸類似物加以置換。誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白將導(dǎo)致含有非天然氨基酸類似物的蛋白質(zhì)的積累。舉例而言，使用這一策略，已將鄰-、間-和對氟代苯丙氨酸引入蛋白質(zhì)中并且在UV光譜中展現(xiàn)出易于鑒別的兩個特征性峰肩，例如參看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000);已使用三氟甲硫胺酸置換噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸，以通過"FNMR研究其與殼低聚糖配體的相互作用，例如參看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.RHonek,Biochemistry,36:3404(1997);并且已并入三氟亮氨酸替代亮氨酸，從而使亮氨酸拉鏈蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性增加。例如參看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A,Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem,Int.Ed.Engl.,40:1494(2001)。此外，將硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各種重組蛋白中將會便利對X射線晶體學(xué)中各相的解答。例如參看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBOJ.,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda禾口M.Hatada,Nat.Struct.Biol..1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange，C.Eckerskorn,,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995);禾QN.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder禾口R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616(1997)。也已有效并入具有烯或炔官能團(tuán)的甲硫氨酸類似物，從而允許通過化學(xué)方式對蛋白質(zhì)進(jìn)行額外修飾。例如參看J.C.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett..428:68(1998);J.C..vanHest，K,L.Kiick和D.A.Tirrell,J,Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和K.L.KiickandD.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);關(guān)國專利第6,586,207號；美國專利公開案2002/0042097,所述專利文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。本方法的成就將視氨酰基tRNA合成酶對非天然氨基酸類似物的識別而定，總的說來，這需要高選擇性來確保蛋白質(zhì)翻譯的保真性。一種擴(kuò)大本方法的范疇的方式為放松氨?；鵷RNA合成酶的底物特異性，這已在有限數(shù)量的情況下達(dá)成。舉例而言，在大腸桿菌苯丙胺酰基tRNA合成酶(PheRS)的情況下以Gly置換Ala29將增加底物結(jié)合口袋的尺寸，并且引起對氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)對tRNAPhe的?；饔?。參看M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。具有此突變體PheRS的大腸桿菌菌株允許并入對氯苯丙氨酸或?qū)︿灞奖彼醽硖娲奖彼?。例如參看M.Ibba和H.He腦cke,FEBSLett.,364:272(1995);禾口N.Sharma,R.Furter，P.KastandD.A.Tirrell，F(xiàn)EBSLett.,467:37(2000)。類似地，已證實鄰近大腸桿菌酪胺酰tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合位點處的點突變Phel30Ser使重氮酪氨酸能夠比酪氨酸有效地并入。參看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito畫Yano，K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.SoilandS.Nishimura,J.Biol.Chem..275:40324(2000)。在活體內(nèi)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的另一種策略為修飾具有校對機(jī)制的合成酶。這些合成酶無法區(qū)分且因此活化在結(jié)構(gòu)上與同類天然氨基酸類似的氨基酸。這一錯誤在單獨位點處經(jīng)校正，其使來自tRNA的錯誤氨基酸脫酰基化以保持蛋白質(zhì)翻譯的保真度。如果喪失合成酶的校對活性，那么錯誤活化的結(jié)構(gòu)類似物可逃離編輯功能并且被并入。近來已以纈氨?；鵷RNA合成酶(ValRS)證實這一方法。參看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel禾口P.Marliere;Science,292:501(2001)。ValRS可以Cys、Tyr或氨基丁酸(Abu)錯誤氨酰基化tRNAVal;隨后，這些非同類的氨基酸經(jīng)編輯結(jié)構(gòu)域水解。隨機(jī)突變誘發(fā)X"厲/f廣染色體后，選擇在ValRS的編輯位點中具有突變的突變體乂"應(yīng)^f慮菌株。這一編輯缺陷型ValRS錯誤地將Cys裝于tRNAVal上。由于Abu在空間上與Cys類似(Cys的-SH基團(tuán)經(jīng)Abu中的-13置換)，故當(dāng)這一突變體^"厲^:廣菌株在Abu存在下生長時，突變體ValRS也將Abu并入蛋白質(zhì)中。質(zhì)譜分析表明，在天然蛋白質(zhì)的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸經(jīng)Abu置換。固相合成和半合成方法也已允許合成大量含有新穎氨基酸的蛋白質(zhì)。舉例而言，參看本文引用的以下公開案和參考文獻(xiàn)，如下所述Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S,Watts-Tobin,R.Ge/tera/wa加reo/geWccode/orNature,192:1227-1232(1961);Hofmann,K.，Bohn,H.S加cfesow/o/ypep^fes.XOT/,o//^razo/e-f'附/(iazo/ere/7/ace附ew^yoiS-z^o/^/wflC/vw/7.wg/oZewcyo/<2iS-pepride/ragme賊J.AmChem,88(24):5914-5919(1966);Kaiser,E.T.辦滋e"'c卿謂c/es《oi>/o/og7.ca〃>"aWvepep^iesproto./wz'wc/w<iz'wgewyzmes，AccChsmRes,22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.尸ep"c/eseg膨Wco"http://z.ngc她(yze(isem&聲/"/c^n'os由〃z'szXJAmChemSoc,109:3808-3810(1987);Schnolzer,M.，Kent,SBH.Co"Wrac"wg/rato'wsdoveto'〃wg5^w^"/cpe/f油s.'6acM麵-e—講W戸&Science,256(5054):221-225(1992);Chaiken,I.M.Sew一"/A幼.cpe,We5awc_prato>w,CRCCritRevBiochem，11(3):255-301(1981);Offord,R.E.Prato'"ewg/zee"'"gc/譜z.ca/mea??？ProteinEng.,1(3):151-157(1987);禾口Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C，Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.爿Dw.gwedPe/"(ie丄/gcwe/or7bto/>Syw^e^o/W6owwc/e<xse爿>v"/[/wwWwra/Cafa(y":cScisncc,266(5183):243(1994)。已使用化學(xué)修飾在活體外將包括輔助因子、自旋標(biāo)記和寡核苷酸的多種非天然側(cè)鏈引入蛋白質(zhì)中。例如參看Corey,D.R.，Schultz,P.G.o/a/;^nWsegwewce-57eci!ycw'wg7e-Wrawdec/(ieox"'6owwc/e<xse,Science,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,LawrenceD.S.,Rokita,S.E.TTzec/，z'ca/moA//cfl//o"o/ewz_yma//c，"/z'c"乂AnnuRevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser,E.T.，Lawrence,D.S.C7e附z'ca/扁她ow。/考z附eac"'ve57.敗Scisncs,226(4674):505-511(1984);Neet,K.E.,NanciA,Koshland，D.E.尸ra戸"&yo/麵/-油"/我JBiol.Chem,243(24):6392墨6401(1968);Polgar，L.etM.L.Bender,Xwew<a57"Ae"ca〃y/omecac"ve77".o"MZ7"fe.w.J.AmChemSoc.88:3153-3154(1966);禾nPollack,SJ.，Nakayama,G.Schultz,P.G./wfracwc"'owo/"wc/eojo/n'/esadspecfmscoj^'cpraxesz.w,oaw"力o辦co附Wm'wgScience,242(4881):1038-1040(1988)。另外，已使用使用化學(xué)方法修飾氨酰基tRNA的生物合成方法將數(shù)個生物物理探針并入活體外合成的蛋白質(zhì)中。參看以下專利文獻(xiàn)中所引用的以下公開案和參考文獻(xiàn)Brunner,J.7VewP/zofo/a6e/z'wgawdtross/z'wfa'"gm"/zoc/s'Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);禾口Krieg，U.C.,Walter,P.,Hohnson，A.E.尸/zWocrcm"wWMgo/hgwa/呵wewceProc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先甜已證實，可通過將經(jīng)化學(xué)方法氨酰基化的抑制物tRNA加入經(jīng)含有所需琥珀無義突變的基因程式設(shè)計的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，在活體外將非天然氨基酸位點特異性并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，使用對特定氨基酸具營養(yǎng)缺陷的菌株，可以結(jié)構(gòu)類似的同源物取代20種常見氨基酸中的多種氨基酸，例如以氟代苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.，Schultz,P.G.gewera/me^od/ors"e,ec!ycZwcorporadow0/wwwa&m/麵/wo鎖'dsz'wtoScience,244:182-188(1989);M,W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.，Chamberlin,A.R.,Diala，E.S.5z'os，f/幼'cs"e,ec(/i'c/wcorpom"owo/awow-w她ra/謂Z"o/自apo/"ep"(ie,J.AmChemSoc，111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，F(xiàn)ASEBJ.13:41-51(1999);Ellman，J.A.，Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.，Noren，C丄，Schultz,P.G.5z'os戸Ae"'cwef/20(iybrz.w加(i固'wgw，fl^wra/a附,.woa"'(is1s"e-5peczyk^(yz'wtoprato'ws.MethodsinEnz,,第202巻，301-336(1992);禾QMendel，D.,Cornish,V.W.&Schultz,P.G.S"e-Df're"ec/Mi^agewesifsawExpa打(ie(iGene"cCode,AimuRevBiophys.BiomolStruct.24,435-62(1995)。舉例而言，制備識別終止密碼子UAG的抑制物tRNA,并且用非天然氨基酸以化學(xué)方法使其氨酰基化。使用常規(guī)定點突變誘發(fā)將終止密碼子TAG引入蛋白質(zhì)基因中的所需位點處。例如參看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'jB義o""c/eosesz."/^(wp/zorc^A/oflfe-Zmsed0"§70"<:/60"'(3^-<^>^<^6^/mi^agewsk,NucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。當(dāng)將?；种莆飔RNA和突變體基因組合于活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時，對UAG密碼子起反應(yīng)并入非天然基酸，從而提供在特定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用^H]-Phe進(jìn)行的實驗和以a羥基酸進(jìn)行的實驗證實，僅所需氨基酸被并入UAG密碼子指定的位置處，且并未將這一氨基酸并入蛋白質(zhì)中的任何其它位點。例如參看Noren等人，廚J:文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;禾卩Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz，P.G.S"e-5pecz力'cz'wcoora"'owo/wove/6ac化owez'柳/rato'叫Science,255(5041):197-200(1992)?？赏ㄟ^任何方法或技術(shù)(包括但不限于，化學(xué)或酶氨酰基化方法)以所需氨基酸使tRNA氨?；?。氨?；赏ㄟ^氨?；鵷RNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于，核糖酶)實現(xiàn)。術(shù)語"核糖酶"可與"催化型RNA"互換使用。Cech和其同事(Cech,1987,Science,236:1532-1539;McCorkle等人,1987,ConceptsBiochem.64:221-226)證實可充當(dāng)催化劑(核糖酶)的天然存在的RNA的存在。然而，盡管僅已證實這些天然RNA催化劑對用于裂解和剪切的核糖核酸底物起作用，但近期有關(guān)人工核糖酶進(jìn)展的研究已擴(kuò)大對各種化學(xué)反應(yīng)的催化作用的型式。相關(guān)研究己鑒別出可催化其自身(2')3'末端的氨?；鵕NA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)和可將氨基酸從一個RNA分子轉(zhuǎn)移到另一RNA分子的RNA分子(Lohse等人，1996，Nature381:442-444)。美國專利申請公開案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文)描述構(gòu)建核糖酶的方法和其對于用天然編碼的氨基酸和非天然編碼的氨基酸氨酰基化tRNA的用途?？墒箃RNA氨?；牡孜锕潭ㄐ问降拿阜肿?包括但不限于，核糖酶)能夠有效地親和純化氨?；a(chǎn)物。適當(dāng)基質(zhì)的實例包括瓊脂、瓊脂糖和磁珠。供氨?；饔玫牡孜锕潭ㄐ问降暮颂敲傅闹圃旌陀猛疽衙枋鲇贑hemistryandBiology2003,10:1077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，所述專利文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文?；瘜W(xué)氨?；椒ò?但不限于)由Hecht和其同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25，545;Heckler,T.G.;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang,P.;Hecht，S.M.Biochemistry1988，27，7254;Hecht,S.M.;Alford,B,L.;Kuroda,Y.;Kitano，S.J.Biol.Chem.1978,253，4517)禾口Schultz，Chamberlin,Dougherty等(Cornish,V.W.;Mendel,D,;Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A,;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz,P.G.Science1989,244,182;Bain，J.D.;Glabe，C.G.;Dix，T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013;Bain,J.D.等人Nature1992，356，537;Gallivan,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740;Turcatti等人J.Biol.Chem.1996，271,19991;Nowak,M.W.等人Science,1995,268，439;Saks,M.E.等人J.Biol.Chem.1996，271,23169;Hohsaka,T.等人J.Am.Chem.Soc.1999，121,34)提出的方法，所述參考文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中，所述方法避免使用氨?；铣擅?。所述方法或其它化學(xué)氨?；椒捎糜谑箃RNA分子氨?；?。用于產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生單獨隨機(jī)核糖酶序列池；對所述池執(zhí)行定向進(jìn)化；針對所需氨?；钚院Y選所述池；和選擇那些展現(xiàn)所需氨酰基化活性的核糖酶的序列。核糖酶可包含便利酰基化活性的基元和/或區(qū)域，諸如GGU基元和富含U的區(qū)域。舉例而言，據(jù)報導(dǎo)，富含U的區(qū)域可便利識別氨基酸底物，且GGU基元可與tRNA3'末端形成堿基配對?？偟恼f來，GGU基元和富含U的區(qū)域便利同時識別氨基酸與tRNA，且由此便利使tRNA3'端氨酰基化?？赏ㄟ^使用與tRNAAsncccc接合的部分隨機(jī)化r24mini進(jìn)行活體外選擇，隨后系統(tǒng)性工程設(shè)計見于活性克隆中的一致序列來產(chǎn)生核糖酶。由本方法獲得的示范性核糖酶稱為"Fx3核糖酶"且描述于美國公開申請案第2003/0228593號中，所述專利的內(nèi)容是以引用的方式并入本文，所述核糖酶充當(dāng)合成具有同類非天然氨基酸的各種氨?；鵷RNA的通用催化劑?？墒褂霉潭ㄓ诘孜锷弦杂行вH和純化氨?；鵷RNA。適當(dāng)?shù)孜锏膶嵗?但不限于)瓊脂、瓊脂糖和磁珠?？衫肦NA的化學(xué)結(jié)構(gòu)將核糖酶固定于樹脂上，諸如，可以高碘酸鹽氧化RNA的核糖上的3'-順式-二醇以得到相應(yīng)二醛以便利將RNA固定于樹脂上?？墒褂酶黝悩渲?，包括廉價酰肼樹脂，其中還原氨化使得樹脂與核糖酶之間以不可逆連接相互作用?？赏ㄟ^柱上氨?；夹g(shù)(on-columnaminoacylationtechnique)顯著便利氨?；鵷RNA的合成。Kourouklis等人Methods2005;36:239-4描述基于柱的氨酰基化系統(tǒng)。可以多種方式實現(xiàn)氨?；痶RNA的分離。一種適當(dāng)方法為用緩沖液從柱中洗提出氨?；鵷RNA，所述緩沖液諸如具有10mMEDTA的乙酸鈉溶液、含有50mMN-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(3-丙垸磺酸)、12.5mMKC1(pH7.0)、10mMEDTA的緩沖液或簡單地經(jīng)EDTA緩沖的水(pH7.0)?？蓪滨；痶RNA加入翻譯反應(yīng)中以便將使tRNA氨?；陌被岵⑷敕g反應(yīng)所制造的多肽中選擇的位置中。可使用本發(fā)明的氨?；痶RNA的翻譯系統(tǒng)的實例包括(但不限于)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。細(xì)胞溶解產(chǎn)物提供從輸入的mRNA活體外翻譯多肽必需的反應(yīng)組份。所述反應(yīng)組份的實例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延長因子和與翻譯有關(guān)的其它因子。此外，翻譯系統(tǒng)可為批量翻譯或區(qū)域化翻譯。批量翻譯系統(tǒng)將反應(yīng)組份組合于單一隔室中，而區(qū)域化翻譯系統(tǒng)使翻譯反應(yīng)組份與可抑制翻譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物分離。所述翻譯系統(tǒng)為市售。另外，可使用偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)允許將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)的mRNA，其接著經(jīng)反應(yīng)組份翻譯。市售偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯的實例為快速翻譯系統(tǒng)(RapidTranslationSystem)(RTS,RocheInc.)。所述系統(tǒng)包括含有提供翻譯組份(諸如核糖體和翻譯因子)的大腸桿菌溶解產(chǎn)物的混合物。此外，還包括RNA聚合酶以將輸入的DNA轉(zhuǎn)錄成供翻譯使用的mRNA模板。RTS可使用借助插入到反應(yīng)隔室(包括供應(yīng)/廢物隔室和轉(zhuǎn)錄/翻譯隔室)之間的膜區(qū)域化的反應(yīng)組份。tRNA的氨?；梢云渌噭﹫?zhí)行，所述試劑包括(但不限于)轉(zhuǎn)移酶、聚合酶、催化抗體、多功能蛋白和其類似物。Lu等人于MolCell.200110月；8(4):759-69中描述一種以化學(xué)方式使蛋白質(zhì)與含有非天然氨基酸的合成肽連接的方法(表達(dá)蛋白連接)。也巳使用微注射技術(shù)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz，D.A.DoughertyandH.A.Lester,Science,268:439(1995);禾flD.A.Dougherty,Curr.O由.Chem.Biol.,4:645(2000)。將爪蟾卵母細(xì)胞與活體外制造的兩種RNA物質(zhì)共注射在所需氨基酸位置處編碼具有UAG終止密碼子的目標(biāo)蛋白的mRNA，和經(jīng)所需非天然氨基酸氨?；溺暌种莆飔RNA。接著，將卵母細(xì)胞的翻譯機(jī)器插入由UAG指定的位置處的非天然氨基酸。本方法已允許對一般不受活體外表達(dá)系統(tǒng)作用的完整膜蛋白進(jìn)行活體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能研究。實例包括將熒光氨基酸并入速激肽神經(jīng)激肽-2受體中以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移測量距離，例如參看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth，F(xiàn).Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.ChoUet,J.Biol.Chem..271:19991(1996);并入經(jīng)生物素標(biāo)記的氨基酸以鑒別離子通道中表面暴露的殘基，例如參看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.BioL4:739(1997);使用籠鎖酪氨酸類似物以實時監(jiān)測離子通道中的構(gòu)象改變，例如參看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty禾口H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);使用a羥基氨基酸改變離子通道主鏈以探査其門控機(jī)制。例如參看RM.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,，,96:89(1999);和T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan，RG,Schultz禾口J.Yang,Nat.Neurosci..4:239(2001)。在活體內(nèi)將非天然氨基酸直接并入蛋白質(zhì)中的能力提供多種益處，包括(但不限于)高突變體蛋白產(chǎn)量、技術(shù)簡便、研究細(xì)胞或可能的活有機(jī)體中的突變體蛋白的潛力和使用這些突變體蛋白作治療性治療和診斷用。將具有各種尺寸、酸度、親核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括于蛋白質(zhì)中的能力可極大擴(kuò)大合理且系統(tǒng)性操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)探查蛋白質(zhì)功能與產(chǎn)生具有新穎特性的新穎蛋白質(zhì)或有機(jī)體的能力。在有關(guān)位點特異性并入對氟苯丙氨酸的一次嘗試中，將酵母琥珀抑制物tRNAPheCUA/苯丙氨?；鵷RNA合成酶對用于p-F-Phe抗性、Phe營養(yǎng)缺陷型義厲斧賡菌株中。例如參看R.Furter，ProteinSci.,7:419(1998)。還可能使用無細(xì)胞(活體外)翻譯系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的hGH多肽。翻譯系統(tǒng)可為細(xì)胞翻譯系統(tǒng)或無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，且可為原核細(xì)胞或真核生物。細(xì)胞翻譯系統(tǒng)包括(但不限于)所需核酸序列可轉(zhuǎn)錄成mRNA且所述mRNA可經(jīng)翻譯的全細(xì)胞制劑，諸如透性化細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可為市售，且眾所周知許多不同的類型和系統(tǒng)。無細(xì)胞系統(tǒng)的實例包括(但不限于)原核生物溶解產(chǎn)物(諸如大腸桿菌溶解產(chǎn)物)和真核生物溶解產(chǎn)物(諸如麥芽提取物)、昆蟲細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔卵母細(xì)胞溶解產(chǎn)物和人類細(xì)胞溶解產(chǎn)物。當(dāng)所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或另外經(jīng)修飾時，由于許多所述修飾僅可能在真核生物系統(tǒng)中，故可優(yōu)選真核生物提取物或溶解產(chǎn)物。這些提取物和溶解產(chǎn)物的一部分可為市售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)?？捎糜诜g分泌型蛋白的膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)也可用。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(活體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的組合)的這些系統(tǒng)中，活體外合成是通過核糖體引導(dǎo)。已將相當(dāng)多的努力致力于研究無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中。例如參看Kim,D,M.禾口J.R.Swartz,傷o化c/mo/ogyam/5z'oewg/ween'wg,74:309-316(2001);Kim，D.M.和J.R.Swartz,歷o&c/z"o/ogy丄e"en，22，1537-1542，(2000);Kim,D.M.禾卩J.R.Swartz,5!.o^c/z"o/og;;/V。g薦，16,385-3卯，(2000);Kim，D,M.禾口J.R.Swartz,iz'otec/mo/ogyawd5Zoewg7'ween'wg,66,180-188,(1999);禾口Patnaik,R.andJ.R.Swartz,5她c—腿24,862-868,(1998);美國專利第6,337,191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO00/55353;WO90/05785，所述專利文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文?？捎糜诒磉_(dá)包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的另一種方法包括mRNA-肽融合技術(shù)。例如參看R.Roberts禾卩J.Szostak,/Voc.Ato/Jcad.Sd.(X^4」94:12297-12302(1997);A,Frankel等人，CAemzWry&歷o/ogy10:1043-1050(2003)。以本方法，在核糖體上將連接到嘌呤霉素的mRNA模板翻譯成肽。如果已對一種或一種以上tRNA分子進(jìn)行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。閱讀最后一個mRNA密碼子后，嘌呤霉素將俘獲肽的C端。如果在活體外檢定中發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽接合物具有引人關(guān)注的特性，那么可輕易地從mRNA序列中揭示其身份。以此方式，可篩選包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的文庫以鑒別具有所需特性的多肽。目前，據(jù)報導(dǎo)，以純組份進(jìn)行活體外核糖體翻譯將允許合成經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，Prac.A^/v4cm/.ScZ.100:6353(2003)。也可使用已復(fù)水的翻譯系統(tǒng)。也已成功地使用純翻譯因子的混合物將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)以及溶解產(chǎn)物或補充有純翻譯因子的溶解產(chǎn)物的組合，所述純翻譯因子諸如起始因子-1(IF-l)、IF-2、IF-3(a或P)、延長因子T(EF-Tu)或終止因子。還可使無細(xì)胞系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)偶聯(lián)，其中如Cw〃ewf/Vofoco/sMo/ecw/ar所o/ogy(F.M.Ausubel等人編，WileyInterscience,1993)(其是以引用的方式清楚地并入本文)中所述，將DNA引入所述系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄成mRNA且翻譯所述mRNA。在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可為異核RNA(hnRNA)或5'端帽子(7-甲基鳥苷)和3'端聚A尾成熟mRNA的形式，此可為某些翻譯系統(tǒng)的優(yōu)勢。舉例而言，在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解系統(tǒng)中以高效率翻譯經(jīng)封端mRNA。W//.與AG好多,錄凝游乂分f曩會激對本文所述的非天然氨基酸多肽的各種修飾可使用本文所述的組合物、方法、技術(shù)和策略實現(xiàn)。這些修飾包括將其它功能性并入多肽的非天然氨基酸組份上，所述功能性包括但不限于，標(biāo)記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細(xì)胞毒性化合物、藥物、親和標(biāo)記、光親和標(biāo)記、反應(yīng)性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標(biāo)記、熒光團(tuán)、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團(tuán)、與其它分子共價或非共價相互作用的基團(tuán)、光籠鎖部分、光化輻射可激發(fā)部分、光致異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學(xué)可裂解基團(tuán)、光可裂解基團(tuán)、延長的側(cè)鏈、與碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標(biāo)記部分、生物物理學(xué)探針、發(fā)磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電子致密基團(tuán)、磁性基團(tuán)、插入基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標(biāo)記、小分子、量子點、納米傳導(dǎo)物、放射性核苷酸、無線電傳導(dǎo)物、中子俘獲劑或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì)。作為本文所述的組合物、方法、技術(shù)和策略的例示性、非限制性實例，以下實施方式將集中于將大分子聚合物加入非天然氨基酸多肽中，且應(yīng)了解本文所述的組合物、方法、技術(shù)和策略也適用于(必要時且所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可針對本文的揭示內(nèi)容作出適當(dāng)修改)加入其它功能性，包括但不限于上文所列的那些功能性。多種大分子聚合物和其它分子可與本發(fā)明的hGH多肽連接以調(diào)節(jié)所述hGH多肽的生物特性，和/或向hGH分子提供新穎的生物特性?？赏ㄟ^天然編碼的氨基酸；非天然編碼的氨基酸；或天然或非天然氨基酸的任何功能性取代基；或加入天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能團(tuán)使這些大分子聚合物與hGH多肽連接。聚合物的分子量可在包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或更高分子量之間的廣泛范圍內(nèi)。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10，000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約10,000Da與40,000Da之間。本發(fā)明提供實質(zhì)同源的聚合物:蛋白質(zhì)接合物制劑。如本文所使用的"實質(zhì)同源"意思是觀察到聚合物:蛋白質(zhì)接合物分子比總蛋白質(zhì)的一半大。聚合物:蛋白質(zhì)接合物具有生物活性，且本文所提供的本"實質(zhì)同源"的PEG化hGH多肽制劑為足夠同源以展現(xiàn)同源制劑的益處(例如使臨床應(yīng)用中各批制劑之間的藥代動力學(xué)易于預(yù)測)的制劑。也可選擇制備聚合物:蛋白質(zhì)接合物分子的混合物，且本文所提供的益處在于可選擇單聚合物:蛋白質(zhì)接合物的比例以包括于混合物中。因此，視需要可制備各種蛋白質(zhì)與所連接的各種數(shù)量的聚合物部分(意即，二-、三-、四-等)的混合物，并使所述接合物與使用本發(fā)明的方法制備的單聚合物:蛋白質(zhì)接合物組合，從而具有具預(yù)定的單聚合物:蛋白質(zhì)接合物比例的混合物。所選擇的聚合物可具水溶性，從而使其所連接的蛋白質(zhì)不會沉淀于諸如生理學(xué)環(huán)境的水性環(huán)境中。聚合物可為分枝或不分枝聚合物。對于終產(chǎn)物制劑的治療用途而言，聚合物需為醫(yī)藥學(xué)上可接受的聚合物。聚乙二醇分子比蛋白質(zhì)分子的比例將隨其在反應(yīng)混合物中的濃度而變化。一般說來，最佳比率(就反應(yīng)的效率而言為存在最少過量的未反應(yīng)蛋白質(zhì)或聚合物)可通過所選聚乙二醇的分子量和可用反應(yīng)性基團(tuán)的可用數(shù)量確定。當(dāng)涉及分子量時，通常聚合物的分子量越高，則可與蛋白質(zhì)連接的聚合物分子的數(shù)量越少。類似地，當(dāng)優(yōu)化這些參數(shù)時，應(yīng)考慮到聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或分枝越多)則聚合物:蛋白質(zhì)的比率越高。聚合物的實例包括(但不限于)聚烷基醚和其經(jīng)烷氧基封端的類似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇和其經(jīng)甲氧基或乙氧基封端的類似物，尤其聚氧乙二醇，后者也稱為聚乙二醇或PEG);聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羥基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羥基烷基丙烯酰胺(例如聚羥丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羥基烷酯；聚唾液酸和其類似物；親水性肽序列；多醣和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纖維素和其衍生物，例如羧甲基纖維素、羥烷基纖維素；甲殼素和其衍生物，例如殼聚糖、琥珀?；鶜ぞ厶恰Ⅳ燃谆讱に?、羧甲基殼聚糖；透明質(zhì)酸和其衍生物；淀粉；海藻酸鹽；硫酸軟骨素；白蛋白；普魯蘭多糖(pullulan)和羧甲基普魯蘭多糖；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；順丁烯二酸酐共聚物，諸如苯乙烯順丁烯二酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚順丁烯二酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物質(zhì)的衍生物。聚乙二醇分子比蛋白質(zhì)分子的比例將隨其在反應(yīng)混合物中的濃度而變化。一般說來，最佳比率((就反應(yīng)的效率而言為存在最少過量的未反應(yīng)蛋白質(zhì)或聚合物)可通過所選聚乙二醇的分子量和可用反應(yīng)性基團(tuán)的可用數(shù)量確定。當(dāng)涉及分子量時，通常聚合物的分子量越高，則可與蛋白質(zhì)連接的聚合物分子的數(shù)量越少。類似地，當(dāng)優(yōu)化這些參數(shù)時，應(yīng)考慮到聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或分枝越多)則聚合物:蛋白質(zhì)的比率越高。如本文所使用且當(dāng)預(yù)期PEG:hGH多肽接合物時，術(shù)語"治療有效量"是指向患者提供所需益處的量。所述量將隨個體不同而變化，并且將視包括患者的全部生理條件和待治療的病況潛在成因的多種因素而定。治療使用的hGH多肽的量提供可接受的改變速率并且在有益的水平上保持所需改變。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可易于使用公共可用材料和程序確定本發(fā)明組合物的治療有效量。水溶性聚合物可為任何結(jié)構(gòu)形式，包括(但不限于)線性、叉形或分枝形。通常，水溶性聚合物為聚(垸二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，但其它水溶性聚合物也可使用。舉例而言，將使用PEG描述本發(fā)明的某些實施例。PEG為眾所周知的水溶性聚合物，其為市售或可根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的乙二醇的開環(huán)聚合方法進(jìn)行制備(Sandler和Karo，PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3巻，第138-161頁)。術(shù)語"PEG"在廣義上用于涵蓋忽略PEG大小或PEG末端修飾的任何聚乙二醇分子，并且可以由下式所示的與hGH多肽連接的形式表示XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y，其中n為2到10,000;且X為H或末端修飾，包括(但不限于)Q-4烷基、保護(hù)基或末端官能團(tuán)。在一些情況下，用于本發(fā)明中的PEG在一端以羥基或甲氧基終止，意即，X為H或CH3("甲氧基PEG")?；蛘?，PEG可以反應(yīng)性基團(tuán)終止，由此形成雙官能聚合物。典型的反應(yīng)性基團(tuán)可包括通常用于與見于20種常見氨基酸中的官能團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)(包括但不限于，順丁烯酰亞胺基團(tuán)、活性碳酸酯(包括但不限于，對硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于，N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酯)和醛)，以及對20種常見氨基酸具惰性但與非天然編碼的氨基酸內(nèi)存在的互補官能團(tuán)特異性反應(yīng)的官能團(tuán)(包括但不限于，疊氮基、炔基)。應(yīng)注意，上式中以Y表示的PEG的另一末端將經(jīng)由天然存在或非天然編碼的氨基酸直接或間接與hGH多肽連接。舉例而言，Y可為與多肽胺基(包括但不限于，賴氨酸的e胺或N端)的酰胺、氨基甲酸酯或尿素鍵?；蛘?，Y可為與硫醇基(包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基)的順丁烯酰亞胺鍵。或者，Y可為與通常不可經(jīng)由20種常見氨基酸接取的殘基的鍵。舉例而言，PEG上的疊氮基可與hGH多肽上的炔基反應(yīng)形成Huisgen[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物?；蛘?，PEG上的炔基可與非天然編碼的氨基酸中存在的疊氮基反應(yīng)形成類似產(chǎn)物。在一些實施例中，強(qiáng)親核試劑(包括但不限于，肼、酰肼、羥胺、氨基脲)可與非天然編碼的氨基酸中存在的醛基或酮基反應(yīng)形成腙、肟或縮氨基脲，其視應(yīng)用在一些情況下可另外通過用適當(dāng)還原劑處理而經(jīng)還原?；蛘撸赏ㄟ^非天然編碼的氨基酸將所述強(qiáng)親核試劑并入hGH多肽中，并且將其用于優(yōu)先與水溶性聚合物中存在的酮或醛基反應(yīng)?？梢晫嶋H需要使用PEG的任何分子量，包括(但不限于)約100道爾頓(Dalton,Da)到100,000Da或視需要更多(包括但不限于，有日寸0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)約100Da與約100,000Da或更多之間。PEG的分子量可介于約lOODa與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、lO，OOODa、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3，000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da.在一些實施例中，PEG的分子量是介于約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子暈是介于約l，OOODa與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約IO，OOODa與40,000Da之間。也可使用支鏈PEG，包括(但不限于)各鏈的MW在1-100kDa(包括但不限于1-50kDa或5-20kDa)范圍內(nèi)的PEG分子。支鏈PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)約1,000Da與約100,000Da或更多之間。支鏈PEG的分子量可介于約1,000Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85，000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7，000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da禾B1,000Da。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約l，OOODa與50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約5,000Da與20,000Da之間。多種PEG分子已描述于包括((S不限于)theShearwaterPolymers,Inc.catalog,NektarTherapeuticscatalog(以引用的方式并入本文)中。一般地，PEG分子的至少一個末端可用于與非天然編碼的氨基酸反應(yīng)。舉例而言，可使用具有與氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的炔部分和疊氮部分的PEG衍生物使PEG與非天然編碼的氨基酸反應(yīng)。如果非天然編碼的氨基酸包含疊氮化物，那么PEG通常將含有實現(xiàn)[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物形成的炔部分或含有實現(xiàn)酰胺鍵形成的膦基的活性PEG物質(zhì)(意即，酉旨、碳酸酯)?；蛘?，如果非天然編碼的氨基酸包含炔，那么PEG通常將含有實現(xiàn)[3+2]Huisgen環(huán)加成產(chǎn)物形成的疊氮部分。如果非天然編碼的氨基酸包含羰基，那么PEG通常將包含有效的親核試劑(包括但不限于，酰肼、肼、羥胺或氨基脲官能性)以便實現(xiàn)相應(yīng)腙、肟和縮氨基脲鍵的分別形成。在其它替代選擇中，可反方向使用上述反應(yīng)性基團(tuán)，意即，非天然編碼的氨基酸中的疊氮部分可與含有炔的PEG衍生物反應(yīng)。在一些實施例中，具有PEG衍生物的hGH多肽含有與非天然編碼的氨基酸側(cè)鏈上存在的化學(xué)官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)官能性。在一些實施例中，本發(fā)明提供含疊氮化物和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量為約SOODa到約100,000Da的水溶性聚合物主鏈。水溶性聚合物的聚合物主鏈可為聚(乙二醇)。然而，應(yīng)了解，包括但不限于聚(乙二醇)和其它相關(guān)聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多種水溶性聚合物也適用于本發(fā)明的實踐中，且預(yù)期術(shù)語PEG或聚(乙二醇)的使用涵蓋并包括所有所述分子。術(shù)語PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括雙功能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉形PEG、分枝PEG、側(cè)接PEG(意即，具有一個或一個以上與聚合物主鏈側(cè)接的官能團(tuán)的PEG或相關(guān)聚合物)或具有可降解鍵的PEG。PEG通常澄清、.無色、無臭、溶于水、對熱穩(wěn)定、對許多化學(xué)試劑具惰性，不會水解或退化且一般無毒。普遍認(rèn)為聚(乙二醇)具生物可相容性，也就是說，PEG能夠在不引起危害的情況下與活組織或有機(jī)體共存。更具體說來，PEG實質(zhì)具非免疫原性，也就是說，PEG在體內(nèi)不傾向于產(chǎn)生免疫反應(yīng)。當(dāng)與體內(nèi)具有一些所需功能的分子(諸如生物活性劑)連接時，PEG傾向于遮蔽所述試劑，并且可能減小或消除任何免疫反應(yīng)從而使有機(jī)體可耐受所述試劑的存在。PEG接合物傾向于不產(chǎn)生實質(zhì)的免疫反應(yīng)或引起凝血或其它不合需要的作用。具有式-(^20120-(0120120)。-(:1^(:112-(其中n為約3到約4000，通常為約20到約2000)的PEG適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一些實施例中，分子量為約800Da到約100,000Da的PEG尤其可用作聚合物主鏈。PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)約100Da與約100,000Da或更多之間。PEG的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15，000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約10,000Da與40,000Da之間。聚合物主鏈可為線性或分枝狀。分枝狀聚合物主鏈一般已為此項技術(shù)中所知。通常，分枝聚合物具有一個中心分枝核心部分和多個與所述中心分枝核心連接的線性聚合物鏈。通常使用分枝形式的PEG，其可通過使氧化乙烯與各種多元醇(諸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成而制得。中心分枝部分也可源自若干個氨基酸(諸如賴氨酸)。分枝狀聚(乙二醇)可以通用形式R(-PEG-OH)m表示，其中R是從核心部分衍生，諸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇；且m表示側(cè)臂數(shù)。也可將多臂PEG分子(諸如美國專利第5,932,462號、第5,643,575號、第5,229,490號、第4，289,872號；美國專利申請案2003/0143596;WO96/21469;和WO93/21259，所述專利各自以其全文引用的方式并入本文)用作聚合物主鏈。分枝狀PEG也可為以PEG(-YCHZ2)n表示的分叉狀PEG形式，其中Y為連接基團(tuán)，且Z為通過指定長度的原子鏈與CH連接的活性端基。另一種分枝形式，即側(cè)接PEG沿PEG主鏈而不是在PEG鏈末端具有反應(yīng)性基團(tuán)，諸如羧基。除這些形式的PEG外，也可制備在主鏈中具有弱或不可降解的鍵的聚合物。舉例而言，可制備在聚合物主鏈中具有經(jīng)歷水解的酯鍵的PEG。如下所示，這一水解將使聚合物裂解成具有較低分子量的片段-PEG-C02-PEG-+H20^PEG-C02H+HO-PEG-。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語聚(乙二醇)或PEG表示或包括此項技術(shù)中已知的所有形式，包括(但不限于)本文所揭示的形式。許多其它聚合物也適用于本發(fā)明中。在一些實施例中，具水溶性、具有2到約300個末端的聚合物主鏈尤其可用于本發(fā)明中。適當(dāng)聚合物的實例包括(但不限于)其它聚(烷二醇)，諸如聚(丙二醇)("PPG")、其共聚物(包括但不限于，乙二醇與丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物和其類似物。盡管聚合物主鏈各鏈的分子量可變化，但其通常在約800Da到約100,000Da、通常在約6,000Da到約80,000Da的范圍內(nèi)。聚合物主鏈各鏈的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、卯,OOODa、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約IO，OOODa與40,000Da之間。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，前述有關(guān)實質(zhì)水溶性主鏈的列表并不詳盡而僅出于說明的目的，并且預(yù)期具有上述品質(zhì)的所有聚合材料都適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一些實施例中，聚合物衍生物為"多官能的"，意思是聚合物主鏈具有至少兩個經(jīng)官能團(tuán)功能化或活化的末端，且可能多達(dá)約300個末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有兩個末端的線性聚合物，每一末端都與相同或不同的官能團(tuán)鍵接。在一實施例中，聚合物衍生物具有結(jié)構(gòu)X—A—POLY—B—-N=N=N,其中-N=N=N為疊氮部分；B為連接部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原性聚合物；A為連接部分，其可存在或不存在且其可與B相同或不同；且x為第二官能團(tuán)。A與B的連接部分的實例包括(但不限于)含有多達(dá)18個(包括但不限于，介于1-10個之間)碳原子的多重官能化烷基。烷基鏈中可包括雜原子，諸如氮、氧或硫。烷基鏈也可在雜原子處具有支鏈。A與B的連接部分的其它實例包括(但不限于)含有多達(dá)10個(包括但不限于，介于5-6個之間)碳原子的多重官能化芳基。芳基可經(jīng)一個或一個以上碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。適當(dāng)連接基團(tuán)的其它實例包括美國專利第5,932,462號、第5，643，575號和美國專利申請公開案2003/0143596中所述的那些連接基團(tuán)，所述專利各自以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，前述有關(guān)連接部分的列表并不詳盡而僅出于說明的目的，并且預(yù)期具有上述品質(zhì)的所有連接部分都適用于本發(fā)明中。用作X的適當(dāng)官能團(tuán)的實例包括(但不限于)羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、烷氧基、活性酯(諸如N-羥基琥珀酰亞胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(諸如碳酸N-羥基琥珀酰亞胺基酯和碳酸l-苯并三唑酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、經(jīng)保護(hù)胺、酰肼、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、異氰酸酯、異硫代氰酸酯、順丁烯二酰亞胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烴、酮和疊氮化物。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，所選擇的X部分應(yīng)與疊氮基相容，從而不會與疊氮基發(fā)生反應(yīng)。含有疊氮基的聚合物衍生物可具同型雙功能性，意思是第二個官能團(tuán)(意即，X)也為疊氮部分；或具異型雙功能性，意思是第二官能團(tuán)為不同的官能團(tuán)。術(shù)語"經(jīng)保護(hù)"是指存在防止化學(xué)反應(yīng)官能團(tuán)在某些反應(yīng)條件下反應(yīng)的保護(hù)基團(tuán)或部分。保護(hù)基將視所保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的類型而變化。舉例而言，如果化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)為胺或酰肼，那么保護(hù)基可選自由叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)組成的群組。如果化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)為硫醇，那么保護(hù)基可為正吡啶基二硫化物。如果化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護(hù)基可為苯甲基或烷基(諸如甲基、乙基或叔丁基)。此項技術(shù)中已知的其它保護(hù)基也可用于本發(fā)明中。通?？赏ㄟ^此項技術(shù)中已知的方法(包括但不限于，沉淀產(chǎn)物隨后視需要進(jìn)行色譜分析)實現(xiàn)對于粗產(chǎn)物的純化。可將水溶性聚合物與本發(fā)明的hGH多肽連接。水溶性聚合物可通過并入hGH多肽中的非天然編碼的氨基酸，或非天然編碼或天然編碼的氨基酸的任何官能團(tuán)或取代基，或加入到非天然編碼或天然編碼的氨基酸中的任何官能團(tuán)或取代基連接?；蛘撸ㄟ^天然存在的氨基酸(包括但不限于，半胱氨酸、賴氨酸或N端殘基的胺基)使水溶性聚合物與并入非天然編碼的氨基酸的hGH多肽連接。在一些情況下，本發(fā)明的hGH多肽包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個非天然氨基酸，其中一個或一個以上非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物(包括但不限于，PEG和/或寡醣)連接。在一些情況中，本發(fā)明的hGH多肽另外包含l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或IO個以上與水溶性聚合物連接的天然編碼的氨基酸。在一些情況中，本發(fā)明的hGH多肽包含一個或一個以上與水溶性聚合物連接的非天然編碼的氨基酸和一個或一個以上與水溶性聚合物連接的天然存在的氨基酸。在一些實施例中，相對于未接合形式的hGH多肽，用于本發(fā)明中的水溶性聚合物將增強(qiáng)所述hGH多肽的血清半衰期?？烧{(diào)節(jié)與本發(fā)明的hGH多肽連接的水溶性聚合物的數(shù)量(意即，PEG化或糖基化程度)使藥理學(xué)、藥代動力學(xué)或藥效特性(諸如活體內(nèi)半衰期)改變(包括但不限于，增加或降低)。在一些實施例中，hGH半衰期比未經(jīng)修飾的多肽的半衰期增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少約100倍。含有強(qiáng)親核基團(tuán)(意即，酰肼、肼、羥胺或氨基脲)的PEG衍生物在本發(fā)明的一個實施例中，用含有與PEG主鏈直接連接的末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基非天然編碼的氨基酸的hGH多肽。在一些實施例中，以羥胺為末端的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(意即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在一些實施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X-NH-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些實施例中，含氨基脲的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000。在本發(fā)明的另一實施例中，用含有利用酰胺鍵連接到PEG主鏈的末端羥胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基氨基酸的hGH多肽。在一些實施例中，以羥胺為末端的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(意即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在一些實施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2VX-NH-NH2，其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為IOO-I，OOO，且X視情況為可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些實施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000。在本發(fā)明的另一實施例中，用含有末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的分枝狀PEG衍生物修飾包含含羰基氨基酸的hGH多肽，其中所述分枝狀PEG的各鏈具有在10-40kDa范圍內(nèi)的MW。所述分枝狀PEG各鏈的MW可在5-20kDa的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一實施例中，以具有分枝結(jié)構(gòu)的PEG衍生物修飾包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽。舉例而言，在一些實施例中，以肼或酰肼為末端的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)2CH(CH2)m-X-NH-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(C-O)。在一些實施例中，含氨基脲基團(tuán)的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。在一些實施例中，含羥胺基團(tuán)的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)2CH-X-(CH2)m-0-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。水溶性聚合物與hGH多肽連接的程度和位點可調(diào)節(jié)hGH多肽與hGH多肽受體在位點1的結(jié)合。在一些實施例中，如通過平衡結(jié)合檢定所測量(諸如Spencer等人，《/.Ao/.CAe肌，263:7862-7867(1988)中關(guān)于hGH所述的檢定)，安排鍵從而使hGH多肽在位點1處以約400nM或更低的Kd、150nM或更低的Kd且在一些情況下以100nM或更低的Kd與hGH多肽受體結(jié)合?；罨酆衔镆约半慕雍系姆椒ê突瘜W(xué)己描述于文獻(xiàn)中且為此項技術(shù)中所知。用于活化聚合物的常用方法包括(但不限于)以溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、二環(huán)氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳二酰亞胺、磺?；u化物、三氯均三嗪等活化官能團(tuán)(參看，R.F.Taylor,(1991),PROTEINIMMOBILISATION.FundamentalandApplications,MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking,CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson(1993)，ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,N.Y.;Dunn,R丄.等人，編輯POLYMERICDRUGSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,ACSSymposiumSeries第469巻，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991)。有關(guān)PEG功能化和接合的多項綜述和專論都適用。例如參看，Harris,Macramo/.C/z亂C25:325-373(1985);Scouten，'."五wzy附o/ogy135:30-65(1987);Wong等人，￡>7，eMz.cra6.rec/mo/.14:866-874(1992);Delgado等人，CW"ca/z.wT^era^et^'cC《rz.er5ywems9:249-304(1992);Zalipsky,5z'ocow)"ga^eC7zem.6:150-165(1995)?；罨酆衔锏姆椒ㄒ部梢娪赪O94/17039、美國專利第5,324,844號、WO94/18247、WO94/04193、美國專利第5,219,564號、美國專利第5,122,614號、WO90/13540、美國專利第5,281,698號和WO93/15189中，且有關(guān)活性聚合物與酶之間接合的方法見于以下專利文獻(xiàn)所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO94/15625)、血色素(WO94/09027)、載氧分子(美國專利第4,412,989號)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，Aoc/^m.祝o"c/.11:141-52(1985))。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。含有非天然編碼的氨基酸(諸如，對疊氮基-L-苯丙氨酸)的hGH多肽的PEG化(意即，加入任何水溶性聚合物)是通過任何常規(guī)方法進(jìn)行。舉例而言，hGH多肽是經(jīng)以炔封端的mPEG衍生物PEG化。簡單說來，室溫下，于攪拌下將過量的固態(tài)mPEG(5000)-O-CH2-CECH加入含對疊氮基-L-Phe的hGH多肽的水溶液中。通常，水溶液經(jīng)pKa值接近進(jìn)行反應(yīng)的pH值(一般為約pH4-10)的緩沖液緩沖。舉例而言，用于在pH7.5下PEG化的適當(dāng)緩沖液的實例包括(但不限于)HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HC1、EPPS禾BTES。持續(xù)監(jiān)測pH值且視需要加以調(diào)節(jié)。通常使反應(yīng)持續(xù)約1-48小時。隨后，使反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)歷疏水相互作用色譜分析以使PEG化的hGH多肽變異體與游離mPEG(5000)-0-CH2-OCH和PEG化hGH多肽的任何高分子量復(fù)合物分離，所述復(fù)合物可在活化未阻斷PEG分子的兩端從而交聯(lián)hGH多肽變異體分子時形成。疏水相互作用色譜分析期間的條件為使游離mPEG(5000)-O-CH2-CeCH流過柱，而任何交聯(lián)PEG化hGH多肽變異體復(fù)合物在含有一個與一個或一個以上PEG基團(tuán)接合的hGH多肽變異體分子的所需形式后洗提的條件。適當(dāng)?shù)臈l件將視交聯(lián)復(fù)合物比所需接合物的相對尺寸而變化，且易于為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員確定。通過超濾濃縮含有所需接合物的洗提液并通過透濾使其脫鹽。視需要，由疏水色譜分析獲得的PEG化hGH多肽可經(jīng)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或一種以上程序進(jìn)一步純化，所述程序包括(但不限于)親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(包括但不限于使用DEAESEPHAROSE);二氧化硅色譜；反相HPLC(RP-HPLC);凝膠過濾(包括但不限于使用SEPHADEXG-75);疏水相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜焦聚；置換色譜；電泳程序(包括但不限于，制備型等電聚焦)；差別溶解性(包括但不限于硫酸銨沉淀)；或萃取。表觀分子量可用GPC通過與球狀蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品比較估算(Preneta，AZinPROTEINPURIFICATIONMETHODS,APRACTICALAPPROACH(Harris&Angal編輯)IRLPress1989，293-306)。hGH-PEG接合物的純度可通過蛋白水解降解(包括但不限于，胰蛋白酶裂解)隨后質(zhì)譜分析來評定。PepinskyRB等人，J.尸/m，co/.cfe77^.297(3):1059-66(2001)。與本發(fā)明hGH多肽的氨基酸連接的水溶性聚合物可另外(但不限于)經(jīng)衍生化或取代。其它PEG衍生物和通用PEG化技術(shù)含疊氮基、含炔基和含膦PEG衍生物描述于標(biāo)題為"ModifedHumanGrowthHormonePolyp印tidesandTheirUses"的美國專利申請案第11/046,432號中。可與hGH多肽連接的其它示范性PEG分子以及PEG化方法包括以下專利中所述者例如，美國專利公開案第2004/0001838號；第2002/0052009號；第2003/0162949號；第2004/0013637號；第2003/0228274號；第2003/0220447號；第2003/0158333號；第2003/0143596號；第2003/0114647號；第2003/0105275號；第2003/0105224號；2003/0023023號；第2002/0156047號；第2002/0099133號2002/0082345號；第2002/0072573號；第2002/0052430號2002/0037949號；第2002/0002250號；第2001/0056171號第2002/0086939號第2002/0040076號第2001/0044526號2001/0021763號；美國專利第6,646,110號；第5,824,778號；第5,476,653號；第5,219,564號號號號號第5,629,384號第5,473,034號第6,515,100號第5,900,461號第5,612,460號第6,451,346號第5,736,625號；第4,902,502號；第5,281,698號第5,516,673號；第5,382,657號；第6,552,167號第6,461,603號；第6,436,386號；第6,214,966號第5,739,208號；第5,672,662號；第5,446,090號第5,324,844號；第5，252，714號；第6,420,339號第6,306,821號；第5,559,213號；第5,747,646號第5,122,614第6,610,281第5,卿,237第5,808,096第6,201,072第5,834,594號；第5,849,860號；第5,980,948號；第6,004,573號；第6,129,912號;WO97/32607;EP229,108;EP402,378;WO92/16555;WO94/04193;WO94/14758;WO94/17039;WO94/18247;WO94/28024;WO95/00162;WO95/11924;WO95/13090;WO95/33490;WO96/00080;WO97/18832;WO98/41562;WO98/48837;WO99/32134;WO99/32139;WO99/32140;WO96/40791;WO98/32466;WO95/06058;EP439508;WO97/03106;W096/21469;W095/13312;EP921131;WO98/05363;EP809996;W096/41813;WO96/07670;EP605963;EP510356;EP400472;EP183503和EP154316，所述專利都是以引用的方式并入本文中。本文所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，包括(但不限于)單鏈、支鏈、多臂鏈、單官能、雙官能、多官能或其任何組合。標(biāo)題為"ModifiedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美國專禾U申請案第11/046,432號(其是以引用的方式并入本文)中提供其它有關(guān)PEG和其形式的討論。/x,關(guān)資力、勸凝絲^銀片^襲二街^7秀/e動力學(xué)^^游,/蘆本發(fā)明的一個重要方面在于通過構(gòu)筑與水溶性聚合物部分接合或不接合的hGH多肽獲得的延長的生物半衰期。迅速降低hGH多肽的血清濃度使得評價對以接合和未接合hGH多肽和其變異體進(jìn)行治療的生物反應(yīng)極其重要。本發(fā)明的接合和未接合hGH多肽和其變異體可在皮下或靜脈內(nèi)投藥后也具有延長的血清半衰期，使得可能例如通過ELISA方法或初級篩選檢定進(jìn)行測量?？墒褂脕碜訠ioSourceInternational(Camarillo,CA)或DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,TX)的ELISA或RIA試劑盒。如本文所述進(jìn)行活體內(nèi)生物半衰期的測量。可根據(jù)Clark,R.等人'腸/.C/泄271(36):21969-21977(1996)中所述的方案測定包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的效力和功能性活體內(nèi)半衰期?？梢哉prague-Dawley雄性大鼠(每一治療組N=5只動物)估算包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的藥代動力學(xué)參數(shù)。動物將經(jīng)靜脈內(nèi)接收每只大鼠25的單一劑量或經(jīng)皮下接收每只大鼠50嗎的單一劑量，并且根據(jù)預(yù)定時間段取得約5-7個血液樣本，所述預(yù)定時間段一般對于包含未與水溶性聚合物接合的非天然編碼的氨基酸的hGH多肽而言包含約6小時，而對于包含非天然編碼的氨基酸且與水溶性聚合物接合的hGH多肽而言為約4天。在數(shù)種物種中已對hGH多肽的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行良好研究，并且可直接將其與所獲得的有關(guān)包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的數(shù)據(jù)相比較。參看以引用方式并入本文中的MordentiJ.等人，P/zwm.8(ll):1351-59(1991)中有關(guān)hGH的研究。也可以靈長類動物(例如，獼猴)估算藥代動力學(xué)參數(shù)。單次注射可經(jīng)皮下或靜脈內(nèi)投與，并且隨時監(jiān)測血清hGH含量?？赏ㄟ^此項技術(shù)中已知的各種檢定測定根據(jù)本發(fā)明的hGH多肽的特異性活性。根據(jù)本發(fā)明獲得并純化的hGH多肽突變蛋白質(zhì)或其片段的生物活性可通過本文所述或所參考的方法或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行測試。X沒^"浙度^"資合激本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)(包括但不限于，包含一個或一個以上非天然氨基酸的hGH、合成酶、蛋白質(zhì)等)視情況與包括(但不限于)適當(dāng)醫(yī)藥載劑組合用于治療用途。所述組合物例如包含治療有效量的化合物和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包括(但不限于)生理鹽水、經(jīng)緩沖生理鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。使所述配方與投藥模式相適應(yīng)。一般說來，投與蛋白質(zhì)的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且可適用于投與本發(fā)明的多肽。根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，視情況在一個或一個以上適當(dāng)?shù)幕铙w外和/或活體內(nèi)動物疾病模型中測試包含一種或一種以上本發(fā)明多肽的治療組合物，以確定功效、組織代謝并估計劑量。具體說來，最初可通過本文中非天然氨基酸與天然氨基酸同源物的活性、穩(wěn)定性或其它適當(dāng)測量(包括但不限于，將經(jīng)修飾以包括一個或一個以上非天然氨基酸的hGH多肽與天然氨基酸hGH多肽比較)(意即，在相關(guān)檢定中)測定劑量。投藥是通過通常用于引入分子最終使其與血液或組織細(xì)胞接觸的任何途徑進(jìn)行。本發(fā)明的非天然氨基酸多肽是以任何適當(dāng)?shù)姆绞揭暻闆r與一種或一種以上醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑一起投與。向患者投與本發(fā)明上下文中所述的這些多肽的適當(dāng)方法都可使用，且盡管可使用一種以上途徑投與特定組合物，但特定途徑通?？商峁┍攘硪煌緩娇旖莺陀行У淖饔没蚍磻?yīng)。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑部分是通過所投與的特定組合物以及用于投與組合物的特定方法確定。因此，存在多種適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明醫(yī)藥組合物的配方?？赏ㄟ^適于蛋白質(zhì)或肽的任何常規(guī)途徑投與本發(fā)明的hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)，所述途徑包括(但不限于)不經(jīng)腸方式，例如注射，包括(但不限于)皮下注射或靜脈內(nèi)注射或任何其它注射或輸注形式。多肽組合物可以多種途徑投與，包括(但不限于)經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、透皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。也可經(jīng)由脂質(zhì)體投與包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽的組合物。所述投藥途徑和適當(dāng)配方一般己為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知。包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)可單獨使用或與其它適當(dāng)?shù)慕M份(諸如醫(yī)藥載劑)組合使用。也可將單獨或與其它適當(dāng)組份組合的包含非天然氨基酸的hGH多肽制成氣霧劑配方(意即，其可經(jīng)"霧化")以通過吸入投與。可將氣霧劑配方放到加壓可接受的推進(jìn)劑(諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和其類似物)中。適于不經(jīng)腸投與(諸如，通過關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑投與)的配方包括水性與非水性、等滲無菌注射溶液(其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使配方與預(yù)定接受者的血液等滲的溶質(zhì))和水性與非水性無菌懸浮液(其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)。hGH配方可存在于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中。不經(jīng)腸投藥和靜脈內(nèi)投藥是優(yōu)選的投藥方法。具體說來，已使用的用于天然氨基酸同源物治療的投藥途徑(包括但不限于，通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白細(xì)胞介素、抗體和/或任何其它以醫(yī)藥學(xué)方式傳遞的蛋白質(zhì)的那些途徑)連同當(dāng)前使用的配方提供優(yōu)選的投藥途徑和本發(fā)明多肽的配方。多肽組合物的粘度和調(diào)配概況可允許用小規(guī)格針通過使用比常規(guī)配方小的活塞壓力進(jìn)行投藥。可使用較小規(guī)格針(包括但不限于，27號、28號、29號、30號或31號針)向受檢者投與本發(fā)明的多肽組合物。美國專利第6,875,432號(其是以引用的方式并入本文中)討論蛋白質(zhì)配方的粘度和與用于皮下投與的蛋白質(zhì)配方的粘度有關(guān)的問題。小規(guī)格針因減小注射疼痛從而改良患者對給藥方案的順應(yīng)性而有益。注射所需的較小活塞壓力使hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)更易于以較短注射持續(xù)時間投與。針的類型包括(但不限于)錐形針、薄壁型針、正常壁厚針和羅氏針(luerneedle)。粘度可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量。"粘度"可為"運動粘度"或"絕對粘度"。"運動粘度"是對于在重力影響下流體流動抗性的量度。當(dāng)將兩種具有相同體積的流體放在相同的毛細(xì)管粘度計中并且使其在重力下流動時，粘性流體將比粘性較低的流體花費更長的時間流過毛細(xì)管。如果一種流體花費200秒完成其流動，而另一種流體花費400秒，那么就運動粘度的比例而言，第二種流體的粘性為第一種流體的兩倍。"絕對粘度"有時稱為動態(tài)粘度或簡單粘度，其為運動粘度與流體密度的乘積絕對粘度=運動粘度乂密度。運動粘度的大小為L2/T，其中L為長度且T為時間。通常，運動粘度是以厘斯(centistoke,cSt)表示。運動粘度的SI單位為mm2/s，其為1cSt。絕對粘度是以厘泊(centipoise,cP)表示。絕對粘度的SI單位為毫帕斯卡-秒(milliPascal-second，mPa-s)，其中1cP=lmPa-s。在本發(fā)明的上下文中，向患者投藥的劑量視應(yīng)用而在患者體內(nèi)隨時間變化足以具有有益的治療反應(yīng)或其它適當(dāng)活性。所述劑量是通過特定載體或配方的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的病況以及待治療的患者的體重或表面積測定。也可通過在特定患者體內(nèi)投與特定載體、配方或其類似物伴隨的任何不利副作用的存在、性質(zhì)和程度測定劑量大小。在測定治療或預(yù)防疾病(包括但不限于，癌癥、遺傳疾病、糖尿病、AIDS或其類似疾病)將投與的載體或配方的有效量時，醫(yī)師將評價循環(huán)血漿含量、配方毒性、疾病進(jìn)程和/或(相關(guān)時)抗非天然氨基酸多肽抗體的制造。例如向70公斤重的患者投與的劑量通常在相當(dāng)于目甜所使用的治療蛋白質(zhì)的劑量的范圍內(nèi)，其經(jīng)調(diào)整以改變相關(guān)組合物的活性或血清半衰期。本發(fā)明的載體或醫(yī)藥配方可通過任何已知的常規(guī)療法，包括抗體投藥、疫苗投藥、細(xì)胞毒素劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應(yīng)修飾劑的投藥，諸如此類來補充治療條件。為投藥，本發(fā)明的配方是以由相關(guān)配方的LD-50或ED-50和成在各種濃度下，(包括(但不限于))當(dāng)適用于患者的質(zhì)量和總體健康時，非天然氨基酸多肽的任何副作用的觀察所確定的施用率投與。投藥可通過單一劑量或分次劑量完成。如果經(jīng)歷配方輸注的患者感染發(fā)燒、受寒或肌肉疼痛，那么他/她可接受適當(dāng)劑量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、乙酰胺苯酚或其他控制疼痛/發(fā)燒的藥物。經(jīng)歷諸如發(fā)燒、肌肉疼痛和受寒的對輸注的反應(yīng)的患者，在未來輸注之前，用阿斯匹林、乙酰胺苯酚或(包括(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)前驅(qū)用藥30分鐘。派替啶(Meperidine)是用于不能對退熱劑和抗組胺快速作出反應(yīng)的更嚴(yán)重的受寒和肌肉疼痛。視反應(yīng)的嚴(yán)重性而減慢或中斷細(xì)胞輸注。本發(fā)明的人類hGH多肽可直接投與哺乳動物受檢者。投藥是通過通常用于將hGH多肽引入受檢者的任何途徑進(jìn)行。盡管在任何給定情況下，最適合的途徑將視所治療的病況的性質(zhì)和嚴(yán)重性而定，但是根據(jù)本發(fā)明實施例的hGH多肽組合物包括適于以下投藥的所述組合物經(jīng)口、直腸、局部、吸入(包括(但不限于)通過氣霧劑)、頰內(nèi)(包括(但不限于)舌下)、陰道、不經(jīng)腸(包括(但不限于)皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(意即，皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和透皮投藥。投藥可為局部或全身投藥。化合物配方可存在于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中。本發(fā)明的hGH多肽可制備于呈單位劑量可注射形式(包括(但不限于).溶液、懸浮液或乳液)的與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑的混合物中。本發(fā)明的hGH多肽也可通過連續(xù)輸注((包括但不限于，使用諸如滲透泵的小型真空泵)、單次團(tuán)注或緩慢釋放儲槽式配方來投與。適于投藥的配方包括可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使配方等滲的溶質(zhì)的水性與非水性溶液、等滲無菌溶液，和可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性與非水性無菌懸浮液。溶液和懸浮液可從前文描述的種類的無菌粉末、顆粒和片劑制備。冷凍干燥是用于呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的常用技術(shù)，其用來從所關(guān)注的蛋白質(zhì)制劑中去除水。冷凍干燥或凍干法是一種首先將待干燥的材料冷凍且隨后通過在真空環(huán)境中升華去除冰或冷凍溶劑的方法。賦形劑可包括在預(yù)先凍干的配方中，以增強(qiáng)其在冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性和/或改良存儲時凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性。Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。醫(yī)藥品的噴霧干燥也已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。舉例而言，參看Broadhead，J.等人，"TheSprayDryingofPharmaceuticals,"inDrugDev.Ind.Pharm，18(11&12),1169-1206(1992)。除小分子醫(yī)藥品之外，也已將各種生物材料噴霧干燥并且所述生物材料包括酶、血清、血漿、微生物和酵母。噴霧干燥是一項有用的技術(shù)，這是因為其可在單步驟方法中將液體醫(yī)藥制劑轉(zhuǎn)化成精細(xì)、無塵的或成團(tuán)的粉末?；炯夹g(shù)包含以下四個步驟a)將進(jìn)料溶液霧化成噴霧；b)噴霧-空氣接觸；C)干燥噴霧；和d)使干燥產(chǎn)物與干燥空氣分離。以引用的方式并入本文的美國專利第6,235,710號和第6,001,800號描述通過噴霧干燥制備重組促紅細(xì)胞生成素。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和配方可包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑部分是通過所投與的特定組合物以及用于投與組合物的特定方法確定。因此，存在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物(包括可選的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑)的多種適合的配方(例如參見iemz'"^o"'s/^a畫ce祐ca/第17版,1985))。適合的載劑包括(但不限于)，含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、擰檬酸鹽、組氨酸或組氨酸衍生物、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其他有機(jī)酸的緩沖液；抗氧化劑，包括(但不限于)抗壞血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于約10個殘基的所述多肽；蛋白質(zhì)，包括(但不限于)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷胺酰胺、組氨酸或組氨酸衍生物、甲硫氨酸、天冬酰胺、精氨酸、谷氨酸或賴氨酸；單醣、二醣和其它碳水化合物類，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包括(但不限于)EDTA;二價金屬離子，包括(但不限于)鋅、鈷或銅；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽反離子，包括(但不限于)鈉；禾n/或非離子型表面活性劑，包括(但不限于)TweenTM(包括但不限于Tween80(聚山梨酸酯80)和Tween20(聚山梨酸酯20;PS20))、PluronicsTM和其他普流尼克酸(pluronicacid)，包括(但不限于)普流尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188))或PEG。適合的表面活性劑(例如)包括(但不限于)基于聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙垸)，意即，(PEO-PPO-PEO)的聚醚；或基于聚(環(huán)氧丙垸)-聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)，意即，(PPO-PEO-PPO)的聚醚；或其組合。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO是以商標(biāo)名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM禾卩R-TetronicsTM(BASFWyandotteCorp.,Wyandotte,Mich)市售，并且另外描述于以引用的方式全部并入本文的美國專利第4，820，352號中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可為適合的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用于使PEG化的hGH抗包括(但不限于)由攪動產(chǎn)生的應(yīng)力的一種或一種以上應(yīng)力穩(wěn)定。一些上述表面活性劑可稱為"膨脹劑"。一些也可以稱為"張力改性劑"。額外載劑包括(但不限于)硫酸銨((NH4)S04)。硫酸銨((NH4)S04)可以在約0.1mM到約200mM范圍內(nèi)的量用于本發(fā)明的配方中，所述量包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、95mM、卯mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。組氨酸可以在約0.1mM到約200mM范圍內(nèi)的量用于本發(fā)明的配方中，所述量包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。在一些實施例中，組氨酸在配方中為約5mM與約30mM之間的量。本發(fā)明配方中的緩沖劑可在約0.1mM到約200mM范圍內(nèi)，包括(但不限于)200mM、l卯mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、95mM、卯mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、9mM、18mM、17mM、16mM、15mM、14mM、13mM、12mM、11mM、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0,6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約0.1mM到約200mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約1mM到約75mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約1mM到約20mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約5mM到約30mM。本發(fā)明配方的緩沖劑可提供在約pH4.0到約pH8.5的pH值范圍，包括(但不限于)pH8.5、pH8.0、pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5和pH4.0。pH值為上文所列舉的那些pH值內(nèi)的任何十等分的pH值；例如pH8.5、pH8.4、pH8,3、pH8.2、pH8.1、pH8.0、pH7.9、pH7.8、pH7.7、pH7.6、pH7.5、pH7.4、pH7.3、pH7.2、pH7.1、pH7.0、pH6.9、pH6.8、pH6.7、pH6.6、pH6.5、pH6.4、pH6.3、pH6.2、pH6.1、pH6.0、pH5.9、pH5.8、pH5.7、pH5.6、pH5.5、pH5.4、pH5.3、pH5.2、pH5,1、pH5.0、pH4.9、pH4.8、pH4.7、pH4.6、pH4.5、pH4.4、pH4.3、pH4.2、pH4.1和pH4.0。在一些實施例中，pH值是介于約pH6.0與約pH7,3之間。在一些實施例中，pH值是介于約pH5.5與約pH8.0之間。在一些實施例中，pH值是介于約pH4.0與約pH8.5之間。在一些實施例中，pH值是介于約pH4.0與約pH7.5之間。在一些實施例中，pH值是介于約pH6.0與約pH7.5之間。本發(fā)明配方中的氨基酸可在約O.lg/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0,5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L禾卩0.1g/L。在一些實施例中，氨基酸是介于約0.1g/L與60g/L之間。在一些實施例中，氨基酸是介于約0.1g/L與100g/L之間。在一些實施例中，氨基酸是介于約1g/L與50g/L之間。在一些實施例中，氨基酸是介于約5g/L與25g/L之間。本發(fā)明配方中的糖醇可在約0.1g/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.1g/L。在一些實施例中，糖醇是介于約O.lg/L與約60g/L之間。在一些實施例中，糖醇是介于約0.1g/L與約100g/L之間。在一些實施例中，糖醇是介于約1g/L與約50g/L之間。在一些實施例中，糖醇是介于約2g/L與約25g/L之間。本發(fā)明配方中的碳水化合物可在約0.1g/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、Sg/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.1g/L。在一些實施例中，碳水化合物是介于約0.1g/L與約100g/L之間。在一些實施例中，碳水化合物是介于約1g/L與約50g/L之間。在一些實施例中，碳水化合物是介于約2g/L與約25g/L之間。在一些實施例中，碳水化合物是介于約0.1g/L與約50g/L之間。本發(fā)明配方中的二醣可在約0.1g/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.1g/L。在一些實施例中，二醣是介于約O.lg/L與約50g/L之間。本發(fā)明配方中的單醣可在約0.1g/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、卯g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L禾C10.1g/L。本發(fā)明配方中的非離子表面活性劑可在約o.oiy。到約10%的范圍內(nèi)，包括(但不限于)10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、20/0、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.0085%、0.008%、0.0075%、0.007%、0.0065%、0.006%、0.0055%、0.005%、0.0045%、0.004%、0.0035%、0.003%、0.00250/0、0.002%、0.0015%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0,0005%、0,0004%、0.0003%、0.0002%和0.0001%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.0001%到約10%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.01%到約10%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.1%到約5%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.1%到約1%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.0001°/。到約1%。本發(fā)明配方中hGH的醫(yī)藥量可在約0.1mg到約50mg的范圍內(nèi)，包括(但不限于)50mg、49mg、48mg、47mg、46mg、45mg、44mg、43mg、42mg、41mg、40mg、39mg、38mg、37mg、36mg、35mg、34mg、33mg、32mg、31mg、30mg、29.5mg、29mg、28.5mg、28mg、27.5mg、27mg、26.5mg、26mg、25.5mg、25mg、24.5mg、24mg、23.5mg、23mg、22.5mg、22mg、21.5mg、21mg、20.5mg、20mg、19.5mg、19mg、18.5mg、18mg、17.5mg、17mg、16,5mg、16mg、15.5mg、15mg、14.5mg、14mg、13.5mg、13mg、12.5mg、12mg、11.5mg、11mg、10.5mg、10mg、9,5mg、9mg、8.5mg、8mg、7.5mg、7.0mg、6.5mg、6.0mg、5.5mg、5.0mg、4.5mg、4.0mg、3,5mg、3.0mg、2.5mg、2.0mg、1.5mg、1.0mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg禾n0.1mg。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約2mg與約30mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約2mg與約25mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.1mg與約30mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.1mg與約8mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.5mg與約8mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.5mg與約6mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約1mg與約5mg之間。也可通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或作為持續(xù)釋放系統(tǒng)的一部分投與本發(fā)明的hGH多肽，包括與諸如PEG的水溶性聚合物連接的多肽。持續(xù)釋放組合物包括(包括(但不限于))呈包括(但不限于)膜或微膠囊的成形物品形式的半滲透聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)包括生物相容材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(Langer等人，《/.Ao膨AMWer.15:267-277(1981);Langer,Oze附.7fecA.，12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羥丁酸(EP133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美國專利第3,773,919號；EP58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，5z^ofymm,22,547-556(1983))、聚(原酸)酉旨、多肽、透明質(zhì)酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚氨基酸、氨基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持續(xù)釋放組合物也包括脂質(zhì)體誘捕化合物。含脂質(zhì)體的化合物是通過本身已知的方法制備DE3,218,121;Eppstein等人，A^/.」cad,WS.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，ZVoc.iVa".爿co^.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;關(guān)國專利第4,619,794號；EP143,949;美國專利第5,021,234號；日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；和EP102,324。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。經(jīng)脂質(zhì)體誘捕的hGH多肽可通過描述于(例如)DE3,218,121;E卯stein等人，ZVoc.AW/.Jc^/.Sc/.82:3688-3692(1985);Hwang等人，尸toc.7Va,/.爿cad.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美國專利第4,619,794號；EP143,949;美國專利第5,021,234號；日本專利申請案S3-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；和EP102,324中的方法制備。眾所周知脂質(zhì)體的組合物和尺寸或能夠容易地由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定。脂質(zhì)體的一些實例如(例如)ParkJW等人，ZVoc.A^//.乂caJ.,92:1327-1331(1995);LasicD禾口PapahadjopoulosD(編輯)MEDICALAPPLICATIONSOFLIPOSOMES(1998);DmmmondDC等人，Liposomaldrugdeliverysystemsforcancertherapy,inTeicherB(編輯)CANCERDRUGDISCOVERYANDDEVELOPMENT(2002);ParkJW等人，C/z".Omceri仏8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，5z.oc&附.說op/y;j.爿"a1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，O"c"63:3154-3161(2003)中所述。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。在本發(fā)明的上下文中，投與患者的劑量應(yīng)足以在受檢者體內(nèi)引起隨時間的有益反應(yīng)。一般地，每劑不經(jīng)腸投與的本發(fā)明hGH多肽的總醫(yī)藥學(xué)有效量是在每公斤患者體重每天約0.01嗎到約100叫或約0.05mg到約1mg的范圍內(nèi)，盡管所述有效量應(yīng)服從治療判斷。給藥的頻率也應(yīng)服從治療判斷，并且可比批準(zhǔn)用于人類的市售hGH多肽產(chǎn)品的頻率頻繁或稀少。一般地，本發(fā)明的PEG化hGH多肽可通過上述任何投藥途徑投與。X/.本發(fā)敏/i(好多扁辦艦本發(fā)明的hGH多肽可用于治療多種病癥。舉例而言，本發(fā)明的hGH激動劑多肽可用于治療生長缺陷、免疫病癥和刺激心臟功能?；加猩L缺陷的個體包括(例如)患有特納氏綜合癥的個體；缺乏GH的個體(包括兒童)；在生長板閉合前約2-3年內(nèi)正常生長曲線經(jīng)歷延緩或延遲的兒童(有時稱為"矮小兒童")；和類胰島素生長因子I(IGF-1)對GH的反應(yīng)已經(jīng)化學(xué)阻斷(意即，通過糖皮質(zhì)激素治療)或通過先天條件(諸如IGF-I對GH的反應(yīng)先天減小的成年患者)阻斷的個體。本發(fā)明的hGH多肽可用于治療患有以下病況的個體兒科生長激素缺乏、特發(fā)性身材矮小、兒童期起始的成人生長激素缺乏、成人期起始的成人生長激素缺乏或繼發(fā)性生長激素缺乏。在成人期診斷為生長激素缺乏的成人可能已具有垂體腫瘤或照射。包括(但不限于)代謝綜合癥、腦損傷、肥胖癥、骨質(zhì)疏松癥或抑郁的病況可在成人體內(nèi)導(dǎo)致類似于生長激素缺乏的癥狀。激動劑hGH變異體可通過增加其免疫功能而起到刺激哺乳動物免疫系統(tǒng)的作用，無論增加是由抗體介導(dǎo)還是細(xì)胞介導(dǎo)引起，且無論所述免疫系統(tǒng)對于經(jīng)hGH多肽治療的主體而言為內(nèi)源性還是從供體移植到接受hGH多肽的主體接受者(如骨髓移植物)都是如此。"免疫病癥"包括個體免疫系統(tǒng)相比正常系統(tǒng)對抗原具有降低的抗體或細(xì)胞反應(yīng)的任何病況，所述個體包括(但不限于)因藥物(例如化療)治療而具有降低的免疫性的小脾臟的個體?；加忻庖卟“Y的實例個體包括(例如)，老年患者；經(jīng)歷化學(xué)療法或輻射療法的個體；從重大疾病恢復(fù)或?qū)⒁M(jìn)行手術(shù)的個體；患AIDS的個體；患有諸如低丙種球蛋白血癥、普遍變化的無丙種球蛋白血癥和選擇性免疫球蛋白不足(例如，IgA不足)的先天和后天B細(xì)胞不足的患者；感染諸如狂犬病的病毒，而潛伏時間比患者的免疫反應(yīng)短的患者；和患有諸如迪格奧爾格綜合癥(diGeorgesyndrome)的遺傳病癥的個體。hGH拮抗劑多肽可用于治療巨人癥和肢端肥大癥、糖尿病和由糖尿病引起的并發(fā)癥(糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病變)、眼睛血管疾病(例如，涉及增生性新血管形成)、腎病和GH反應(yīng)性惡性腫瘤。眼睛血管疾病包括(例如)視網(wǎng)膜病(例如由早產(chǎn)兒貧血病或鐮刀形紅細(xì)胞貧血病引起)和黃斑變性。GH反應(yīng)性惡性腫瘤包括(例如)，威爾姆氏腫瘤(Wilm'stumor)、肉瘤(例如，骨源性肉瘤)、乳癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌和表達(dá)GH受體mRNA的組織的癌癥(意即，胎盤、胸腺、腦、唾液腺、前列腺、骨髓、骨骼肌、氣管、脊髓、視網(wǎng)膜、淋巴結(jié)的癌癥和來自伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma),結(jié)腸直腸癌瘤、肺癌瘤、成淋巴細(xì)胞的白血病和黑素瘤的癌癥)。本發(fā)明的GH(例如hGH)激動劑多肽可用于(例如)治療慢性腎衰竭、與慢性腎功能不全(CRI)有關(guān)的生長不良、與特納氏綜合癥(TurnerSyndrome)有關(guān)的身材矮小、兒科帕德維利綜合癥(Prader-WilliSyndrome,PWS)、具有消瘦或惡病體質(zhì)的HIV患者、小于孕齡出生的兒童(SGA)、肥胖和骨質(zhì)疏松癥。hGH的平均量可變化且尤其應(yīng)基于有資質(zhì)的醫(yī)師的推薦和處方。hGH的確切量優(yōu)先對以下所述因素進(jìn)行考慮所治療的病況的確切類型、所治療的患者的病況以及組合物中的其它成分。待給予的量可容易地由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員基于使用hGH的療法加以確定。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以常規(guī)方式來制造。在本發(fā)明的另一實施例中，提供含有本發(fā)明配方的制造物品，并且提供有關(guān)其使用的說明。制造物品包含容器。制造物品可含有本發(fā)明的配方，包括(但不限于)其凍干、液體、噴霧干燥或其它形式的配方，且視需要含有有關(guān)其制備或復(fù)水的說明。適當(dāng)容器包括(但不限于)例如瓶、小瓶、注射器、自動注射裝置和測試管。所述容器可由多種材料(諸如玻璃或塑料)形成。所述容器保存配方，且所述容器上或與其關(guān)聯(lián)的標(biāo)記可(視需要)指示有關(guān)凍干配方復(fù)水和/或使用的指導(dǎo)。舉例而言，標(biāo)記可指示將所述配方復(fù)水至特定蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)記可另外指示，所述配方可用于或希望用于皮下投與。保存配方的容器可為一次性或多次使用的小瓶。在一實施例中，保存配方的容器為一次性小瓶。制造物品可另外包含第二容器，其包含適當(dāng)稀釋劑。在一實施例中，適當(dāng)稀釋劑為注射用(USP)無菌水或抑菌水。將稀釋劑與凍干配方混合時，視需要，所述配方中最終蛋白質(zhì)的濃度一般可在約2mg/ml與約50mg/ml之間。將稀釋劑與凍干配方混合時，視需要，所述配方中最終蛋白質(zhì)的濃度一般可在約2mg/ml與約25mg/ml之間。配方中最終蛋白質(zhì)濃度一般可在約2mg/ml與約25mg/mL之間。在一實施例中，最終蛋白質(zhì)濃度為約8mg/ml。制造物品可另外包括從商業(yè)和使用者立場看合乎需要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和有關(guān)使用說明的包裝插頁。實例提供以下實例進(jìn)行說明，但并非限制本發(fā)明。實例1用于調(diào)配Met-Y35pAFhGH的材料和方法本實例描述一項配方研究，其鑒別并評定在與PEG接合之前于儲存期間保持Met-Y35pAFhGH的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的適當(dāng)條件和賦形劑。hGH的液體配方為冷凍配方，其含有(1)2.5g/L碳酸氫鈉、20g/L甘氨酸、2g/L甘露糖醇、2g/L乳糖，pH7.3;或2)檸檬酸鈉、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇，pH6.0。加入估計劑量的0.5-4mg/mlPEG-hGH作為活性成分。當(dāng)前在-2(TC下儲存這些配方。需要研發(fā)包含非天然編碼的氨基酸的單劑量PEG化hGH凍干配方，或包含非天然編碼的氨基酸的PEG化hGH液體配方。方法實施多種方法以表征Met-Y35pAFhGH的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。這些方法可用于有關(guān)PEG化hGH的配方研究中。以還原性凝膠進(jìn)行的SDS-PAGE(SDS-PAGE-R)專門基于分子量使hGH分離，從而使任何潛在的降解產(chǎn)物顯現(xiàn)，這是因為這項技術(shù)導(dǎo)致所有二硫鍵完全裂解，且引起多肽完全伸展。以非還原性凝膠進(jìn)行的SDS-PAGE(SDS-PAGE-NR)是基于分子量使分子分離，從而能夠鑒別潛在的hGH二聚體，這是由于蛋白質(zhì)在無還原劑的情況下伸展，因此存留完整的二硫鍵。差示掃描量熱法(DSC)用于測量因熱變性而伸展的肽的AH(焓)。這一技術(shù)通過蛋白質(zhì)全部熔解溫度(Tm)的增加或降低反映評定不同溶液條件和賦形劑對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。所使用的另一技術(shù)為基于相對疏水性分離分子的反相HPLC(RP-HPLC)。具體說來，本方法是基于疏水性與和結(jié)構(gòu)修飾(諸如脫酰胺化和氧化)有關(guān)的保持行為的微小差異分離hGH?；|(zhì)和溶液以U.S.P(美國藥典)級或高分析級賦形劑設(shè)計具有四十八種基質(zhì)的組合配方。所使用的基質(zhì)、樣本制劑和程序如下(表l):<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>所有賦形劑的儲備液都經(jīng)無菌過濾、載明日期并在4'C下儲存。將糖制成100mM儲備液，(NH4)S04為1M儲備液且氨基酸為以下儲備液濃度1M甘氨酸、666mM精氨酸或1M谷氨酸。實驗當(dāng)天將特定緩沖液制備為250mM到1M儲備液(經(jīng)無菌過濾并載明日期)，并且加入賦形劑直至最終濃度，無菌過濾并在4。C下儲存。樣本制備以4.425mg/ml將WHO緩沖液中具有在第35位經(jīng)取代的非天然氨基酸對乙?；?苯丙氨酸的甲硫氨酰基hGH(MetY35pAFcBl)樣本分裝于6個不同的小瓶中，并且在-80。C下冷凍直至研究當(dāng)日。實驗當(dāng)天，在4。C下，通過在0.1-0.5mLSlide-a-lyzer中進(jìn)行透析將MetY35pAF緩沖液更換成特定緩沖液。將約800|il425mg/mlMet-Y35pAFhGH透析到250mL緩沖液中歷時至少4小時，并且改變透析緩沖液(250mL)供整夜透析用。使用500mL提供對WHO緩沖液賦形劑10,000，000倍的稀釋。將樣本從透析中移出并測量濃度。將各樣本稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?。對于DSC而言，所需最終濃度為0.75mg/ml(450|^1體積)。對于RP-HPLC而言，最終濃度為2mg/ml(30^體積)。在RP-HPLC上分析各個別基質(zhì)組的十個樣本。在4'C下將允許4個時間點(3天、l周、2周和1個月)的充足樣本儲存于管中。在-8(TC下，將用于5個冷凍/解凍循環(huán)的充足樣本儲存于小瓶中。在作為此項研究的一部分完成的一定數(shù)量的冷凍/解凍循環(huán)(l個、2個、3個、4個和5個循環(huán))之前，可能存在一個或兩個額外的冷凍/解凍循環(huán)。將4'C下0時間點時的樣本迅速放于HPLC小瓶中。對于SDS-PAGE-R而言，將30pg(2mg/mL下0.015mL)材料用于分析。如RP-HPLC所示，將樣本等分于三個小瓶中。對于SDS-PAGE-NR而言，將30嗎(2mg/mL下0.015mL)材料用于分析。如RP-HPLC所示，將樣本等分于三個小瓶中。在所有情況下，將任何剩余樣本在-80'C下迅速冷凍。實例2有關(guān)Met-Y35pAFhGH配方研究的結(jié)果緩沖液pH值4'C下6周后分析所有配方緩沖液的pH值。如圖1所示，己發(fā)現(xiàn)，所選擇的所有緩沖液的pH值在經(jīng)歷6周的時間后仍穩(wěn)定，但碳酸氫鈉緩沖液(第E組)除外。第E組的pH值隨時間變化而增加。SDS-PAGE-R和SDS國PAGE陽NR以SDS-PAGE還原性凝膠和非還原性凝膠進(jìn)行的樣本分析表明，在4t:下4周(1個月)后或在5個冷凍/解凍循環(huán)期間未發(fā)生變化。本方法并未發(fā)現(xiàn)二聚體形成或降解產(chǎn)物。第A組的還原性凝膠(4'C下，t=0、t=4周)展示于圖2C和2D中，且第B組的非還原性凝膠(4'C下，t=0、t-4周)展示于圖2A和2B中。差示掃描量熱法(DSC)緩沖液和賦形劑對MetY35pAFhGH熱穩(wěn)定性的影響展示于圖3-8中。圖3A-F繪示重疊的配方組A-F的熱概況。圖5提供概括全部基質(zhì)的DSC熔解溫度和Tm改變的表格。B7和F2的基質(zhì)熱概況展示于圖4A-B中。如圖5和圖6所示，緩沖液A具有最低T,如圖5和圖6中B7和C7基質(zhì)所示，在第B組和第C組中精氨酸的Tm升高。在較高pH值(意即，pH〉7.0)下，MetY35pAFhGH展現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性；然而，如圖3和圖4所示，已發(fā)現(xiàn)，其它亞群具有高得多的熔解溫度和更寬的曲線。這些亞群可展現(xiàn)更高的穩(wěn)定性或聚集傾向。氨基酸、尤其Arg和Glu以及(NH4)2S04在較高pH值下Tm降低。糖對全部Tm無影響。如圖7所示，分析所有組的AHV/AH比率。已知重組hGH展現(xiàn)出AHV/AH>4。觀察這一比率的變化；這些值表明MetY35pAF的伸展是不可逆的。隨著pH值的增加，其它亞群也得以鑒別(也將pH7.5下第F組第2亞群的比率繪制于圖7上)。各樣本焓的改變(AUC)與圖8所示類似，但在較高pH值下例外。在較高pH值下AH的差異可歸因于引起較低AUC的錯誤寬轉(zhuǎn)換。繪制每一組的AH(擬合AUC)圖以確保每一組內(nèi)獲得類似值。反相HPLC(RP-HPLC)使用RP-HPLC分析在4'C下儲存4周時MetY35pAFhGH的純度和化學(xué)降解情況。圖9A-D中展示第B組、第C組、第D組和第F組的數(shù)據(jù)集，其中各自將MetY35pAFhGH與WHOhGH標(biāo)準(zhǔn)品相比較。圖10A描述使用AgilentChemstation軟件分析第E5組中存在的不同峰(主峰、初級脫酰胺化/氧化峰和次級脫酰胺化峰)。如圖IOB和圖11所示，第E組的初級脫酰胺化/氧化峰隨時間變化而增高；同時，在較高pH值下還展現(xiàn)出比較低pH值下高的脫酰胺化/氧化量。圖12繪示次級脫酰胺化/氧化峰，表明所有配方組隨時間變化具有較小可變性。如圖13所示，對于所有配方組而言，主要GH峰隨時間變化而減小，但第B組和第C組相比其它組展現(xiàn)出較少改變。第A組展現(xiàn)出極少的脫酰胺化作用，但主要GH峰確實隨時間變化而減小，且除己知的脫酰胺化/氧化峰外的其它峰隨時間變化逐漸顯現(xiàn)。然而，第A組的數(shù)據(jù)表明，MetY35pAF在此pH值下于第0天到第3天時非常穩(wěn)定，由于PEG化反應(yīng)在pH4.0下經(jīng)1天到2天發(fā)生，故此顯得至關(guān)重要。也使用RP-HPLC分析已經(jīng)歷冷凍/解凍循環(huán)的樣本。如圖14(初級脫酰胺化/氧化峰)和圖15(次級脫酰胺化峰)所示，第B組和第C組內(nèi)的個別組看起來類似。如圖16所示，兩個冷凍/解凍循環(huán)后，主要GH峰減小，表明冷凍/解凍起作用。然而，在起始這項配方研究前這一樣本中已發(fā)生一個或兩個冷凍/解凍循環(huán)。研究結(jié)果概述已明確確定，hGH在較低pH值下展現(xiàn)出高度靈活的結(jié)構(gòu)，且hGH在較高pH值下形成極其剛硬的結(jié)構(gòu)(Kasimova等人J.Mol.Biol.2002318:679-695)。在所測試的緩沖液中，發(fā)現(xiàn)緩沖液B(20mM檸檬酸鈉)在pH6.0下執(zhí)行對于MetY35pAFhGH的化學(xué)和熱動力學(xué)穩(wěn)定性最佳。在pH6.0下加入精氨酸會增加MetY35pAFhGH的熱穩(wěn)定性。此時，糖對于MetY35pAFhGH不具有任何正面或負(fù)面影響；然而，糖可能對于PEG化事件前和PEG化事件后pH值轉(zhuǎn)變極為重要。隨時間變化，肟鍵在pH6.0下也可能比在較高pH值(諸如pH7.5)下更穩(wěn)定。實例3PEG-hGH的穩(wěn)定性概況是在加速穩(wěn)定性條件下以關(guān)鍵配方參數(shù)檢驗，主要的降解產(chǎn)物已得以鑒別且穩(wěn)定性指示檢定也已得以確定。單劑量配方研究的主要目標(biāo)在于，優(yōu)化配方以使其最低限度在冷藏溫度下具有足夠的儲存穩(wěn)定性，且從而當(dāng)在環(huán)境溫度下儲存時可具有足夠的儲存穩(wěn)定性。除凍干配方的研究外，其它研究還調(diào)査對光曝露和攪動的敏感性、對使PEG化hGH與未PEG化形式的hGH相區(qū)分的RP-HPLC方法進(jìn)行研究、結(jié)構(gòu)分析和其它研究。成功的凍干配方通常展示出以下特征在調(diào)配和填充完成(fill-finish)過程中在溶液中對于處理具有穩(wěn)定性；在冷凍-干燥期間具有良好穩(wěn)定性；良好的儲存穩(wěn)定性；在干燥狀態(tài)下(相關(guān)時)具有自然的結(jié)構(gòu)；無明顯的樣本破裂或回熔；最佳的含水量；高的玻璃轉(zhuǎn)變溫度；粗糙的塊狀結(jié)構(gòu)；有效的干燥循環(huán)；最小的注射疼痛；和當(dāng)復(fù)水時于1分鐘內(nèi)溶解于充水式可注射物中。在一些實施例中，凍干配方的最佳含水量<3%水。在優(yōu)選實施例中，凍干配方的最佳含水量<1%水。測定配方變量。在4(TC、環(huán)境溫度和冷藏溫度下，檢驗每周時間點時凍干配方候選物的穩(wěn)定性歷時長達(dá)4周、6周和2個月。同樣，在環(huán)境溫度和冷藏溫度下歷經(jīng)長達(dá)3、4和6個月的增量檢驗凍干配方候選物的穩(wěn)定性。也對在2-8t:下儲存1周的復(fù)水形式的各配方的穩(wěn)定性進(jìn)行測試。分析方法包括上述SDS-PAGE方法、SEC-HPLC、離子交換HPLC、RP-HPLC和其它結(jié)構(gòu)分析。測定可用于優(yōu)化凍干循環(huán)以使配方最穩(wěn)定的基本參數(shù)。舉例而言，測定冷凍配方的坍塌溫度(或玻璃轉(zhuǎn)變溫度)、退火溫度和其它重要的物理特性。執(zhí)行測試凍千方法以確定可以最佳循環(huán)獲得理想的團(tuán)塊。實例4反相高效液相色譜(RP-HPLC)反相高效液相色譜(RP-HPLC)是一種基于相對疏水性分離分子的技術(shù)。使樣本越過與烴鏈共價鍵接的二氧化硅固定相。所需分子經(jīng)固定相延遲并用同溶劑(isocraticsolvent)洗提。色譜洗提時間為特定分子的特征。本方法基于疏水性與和結(jié)構(gòu)修飾(諸如脫酰胺化)有關(guān)的保持行為的微小差異分離hGH。使用C4RP-HPLC評定重組人生長激素(hGH)的相對純度和潛在化學(xué)降解(脫酰胺化和氧化)。本方法用于支持對于hGH的鑒別和純度評定。使用本技術(shù)觀察hGH的一些部分降解產(chǎn)物。有關(guān)本技術(shù)的參考文獻(xiàn)包括歐洲藥典2002，第193頁；英國藥典2001，第1938-1939頁；禾卩R,M.Riggin等人AnalyticalBiochemistry167,199-209(1987)的"AReversed-PhaseHighPerformanceLiquidChromatographicMethodforCharacterizationofBiosyntheticHumanGrowthHormone"。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備UV/Vis分光光度計(Agilent8453或其相當(dāng)物)；50pl石英皿；PD-IO、Nap-10或Nap5脫鹽柱(視樣本體積而定；AmershamBiosciencesNap5柱17-0853-02或其相當(dāng)物)；0.5mLVivaspin濃縮器(視需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相當(dāng)物)；HPLC小瓶和蓋(Alltech100^1螺紋蓋聚丙烯小瓶#12962、TFE線性蓋弁73048、開孔螺紋蓋#73044或其相當(dāng)物)；1L和2L清潔玻璃瓶；柱，諸如VydacC4214TP54、尺寸為4.6x250mm、粒度為5|^且孔徑為300A的C4-二氧化硅反相HPLC柱；和能夠執(zhí)行線性梯度的高效液相色譜儀(諸如，裝備有真空除氣器、四級泵、恒溫自動取樣器、恒溫柱隔室、二極管陣列檢測器(DAD)和Chemstation色譜分析軟件的Agilent1100HPLC)。除非另作說明，否則用于本程序中的試劑包括分析級或更好級別的固體化學(xué)品和HPLC級或更好級別的溶劑。所述化學(xué)品的實例包括TRIS-氨基丁三醇，U.S.P.級，SpectrumTR149,或其相當(dāng)物；N-丙醇，HPLC級，99.9%,SigmaAldrich34871，或其相當(dāng)物；和碳酸氫銨，超純>99.5%,Fluka弁09830,或其相當(dāng)物。額外溶液包括脫酰胺化對照的緩沖液(30mM碳酸氫銨，pH9.0)和流動相溶液。就脫酰胺化對照的緩沖液而言，將2.37g碳酸氫銨溶解于0.95LMilli-QH20中，用NaOH將pH值調(diào)到9.0，并且用Milli-QH20使體積達(dá)到1L。使用0.22PES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾所得緩沖液。就流動相溶液(50mMTris-HCl，pH7.5和29%正丙醇)而言，將6.05g氨基丁三醇(USP級，spectrum#TR149或其相當(dāng)物)溶解于0.95LMilli-QH20中。用HCl使溶液達(dá)到pH7.5，并用Milli-QH20使體積達(dá)到1L?；旌蟽煞N溶劑(TRIS和丙醇)，并且使用0.22PES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾混合物。'在RP-HPLC中用作標(biāo)準(zhǔn)品的樣本包括以1.0ml水復(fù)水至1.9-2.1mg/ml的世界健康組織(WHO)hGH(目錄號98/574)。其它hGH參考標(biāo)準(zhǔn)品可以1.9-2.1mg/ml的濃度使用。就分離溶液而言，使用PD-IO、Nap-10或Nap-5脫鹽柱(視樣本體積而定)將hGH標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液更換成30mM碳酸氫銨(pH9.0)緩沖液。使用0.5mLVivaspin濃縮器將標(biāo)準(zhǔn)品濃縮到1.9-2.1mg/ml，在37'C下培育24小時，且接著在-8(TC下儲存待用。將測試材料稀釋到2.0mg/ml的蛋白質(zhì)濃度以供分析。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量樣本濃度。程序?qū)x器設(shè)置為以下條件1)柱VydacC4214TP54柱；2)泵設(shè)置一梯度等梯度；流速0.5ml/min;持續(xù)時間卯min;最大壓力200巴；3)自動取樣器溫度4°C;4)注射器設(shè)置一注射標(biāo)準(zhǔn)注射；注射體積20^1;拉伸速度100nl/min;針的洗滌:用100^1水洗滌；注射速度100^1/min;停止時間與泵相同；5)DAD信號一表2;峰寬〉0.1min;狹縫4nm;停止時間75min;表2<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>6)柱恒溫器一溫度45°C;儲存溫度；7)初步積分事件一斜率0.1;峰寬0.5;最小峰面積(AreaReject):1.0;最小峰高1.0;積分開始10min。以IO柱體積(41.5ml=以0.5ml/min為83min)流動相平衡柱。使用自動取樣器注入20|il標(biāo)準(zhǔn)品并運行HPLC程序。如果WHO標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間不在33-35分鐘之間，或其它標(biāo)準(zhǔn)品不在37-40分鐘之間，那么調(diào)節(jié)流動相組合物，再次平衡柱并且再運行標(biāo)準(zhǔn)品。所建議的調(diào)節(jié)包括如果保留時間小于33分鐘，那么每升流動相加入不到5mL50mMTris-HCl(pH7.5);且如果保留時間大于35分鐘，那么加入不到2ml正丙醇。由于正丙醇可能出現(xiàn)蒸發(fā)，故每天測試樣本時都需運行標(biāo)準(zhǔn)品，并且對緩沖液作相應(yīng)調(diào)節(jié)。注入20^分離溶液并運行HPLC程序。在約0.85的保留時間時，脫酰胺基-hGH相對于主峰表現(xiàn)為較小峰。除非和hGH對應(yīng)的峰與和脫酰胺基hGH對應(yīng)的峰的分離度為至少l.O，且hGH峰的對稱因子為0.8到1.8，否則測試無效。注入20pl測試物品并運行HPLC程序。運行樣本三次。報導(dǎo)平均保留時間?？赡苄枰獙Χ鄠€條件和/或參數(shù)進(jìn)行修改以分析PEG化和其它形式的hGH。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知對于RP-HPLC進(jìn)行的修改。數(shù)據(jù)分析將測試物品的平均保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品的平均保留時間相比較。計算測試物品的平均純度(主峰的積分面積/所有峰的積分面積)xlOO%。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。表3和圖17中提供由關(guān)于MetY35pAFhGH與WHOhGH標(biāo)準(zhǔn)品的RP-HPLC產(chǎn)生的結(jié)果。諸如測試物品與參考標(biāo)準(zhǔn)品之間保留時間的差異和純度的明細(xì)可隨不同分子或分子形式(意即，將Y35pAFhGH與metY35pAFhGH相比較)而變化。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>實例5尺寸排阻色譜尺寸排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)是一項使用固定相作為透過流動相分子的多孔基質(zhì)的技術(shù)。小到足以進(jìn)入孔狀結(jié)構(gòu)的樣本分子被延遲，而較大分子受排阻且因此被迅速載過柱。因此，.尺寸排阻色譜通過尺寸使分子分離，并且色譜洗提時間為特定分子的特征。SEC-HPLC用于評定重組人生長激素(hGH)的效力。SEC-HPLC是一種用于測定單體(PEG化和未PEG化)hGH的百分含量的方法。使用本技術(shù)也可觀察二聚體和其它高分子量蛋白質(zhì)。因此，本技術(shù)使樣本中的單體與二聚體和其它較高分子量物質(zhì)分離，且也使PEG化形式與未PEG化形式的單體分離。有關(guān)本技術(shù)的參考文獻(xiàn)包括歐洲藥典2002，第193頁；英國藥典2001，第1941頁；和R.M.Riggin等人JournalofChromatography435(1988)，第307-318頁的"High-PerformanceSize-ExclusionChromatographicDeterminationofthePotencyofBiosyntheticHumanGrowthHormoneProducts"。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或與其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備UV/Vis分光光度計(Agilent8453或其相當(dāng)物)；50^1石英皿；0.5mLVivaspin濃縮器(視需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相當(dāng)物)；HPLC小瓶和蓋(Alltech100^螺紋蓋聚丙烯小瓶#12962、TFE線性蓋弁73048、開孔螺紋蓋#73044或其相當(dāng)物)；1L和2L清潔玻璃瓶；柱，諸如TosohaasTSKSuperSW300018675和SuperSWGuardColumn18762、尺寸為4.6x300mm、粒度為4pm且孔徑為300A的基于二氧化硅的尺寸排阻HPLC柱，以及尺寸為4.6x35mm且粒度為4pm的保護(hù)柱；和能夠執(zhí)行線性梯度的高效液相色譜儀(諸如，裝備有真空除氣器、四級泵、恒溫自動取樣器、恒溫柱隔室、二極管陣列檢測器(DAD)、差示折光檢測器(RID)和Chemstation色譜分析軟件的Agilent1100HPLC)。除非另作說明，否則用于本程序中的試劑包括分析級或更好級別的固體化學(xué)品和HPLC級或更好級別的溶劑。所述化學(xué)品的實例包括磷酸二氫鈉，SpectmmU.S.P.級S0130，或其相當(dāng)物；磷酸氫二鈉，SpectrumU.S.P.級S0140,或其相當(dāng)物；2-丙醇，F(xiàn)isherHPLC級A451-4或其相當(dāng)物。額外溶液包括流動相溶液(97%63mM磷酸鈉，pH7.0;3%2-丙醇)和溶液A。為制得流動相溶液，將26.8g磷酸氫二鈉溶解于1LMilli-QH20中，并且將13.79g磷酸二氫鈉溶解于1LMilli-QH20中?；旌蟽煞N溶液得到pH值為7.0的磷酸鈉緩沖液,用Milli-Q1120將lOOmM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液稀釋到63mM。將970mL63mM磷酸鈉(pH7.0)與30mL2-丙醇(或獲得97%63mM磷酸鈉(pH7.0)、3%2-丙醇的其它適當(dāng)體積)混合。使用0.22nmPES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾所得緩沖液。溶液A為25mM磷酸鈉，pH7.0。用750mLMilli-QH20稀釋250mL100mM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液。使用0.22pmPES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾所得緩沖液。在SEC-HPLC中用作標(biāo)準(zhǔn)品的樣本包括經(jīng)1.0ml水復(fù)水并稀釋到0.9-1.1mg/ml的世界健康組織(WHO)hGH(目錄號98/574)。其它hGH參考標(biāo)準(zhǔn)品可以0.9-1.1mg/ml的濃度使用。就分離溶液而言，在50'C下培育hGH標(biāo)準(zhǔn)品12-24小時，將其溶解于溶液A中，接著用溶液A將其稀釋到1mg/ml并在-8(TC下儲存待用。用溶液A將測試材料稀釋到1.0mg/ml。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量樣本濃度。程序?qū)x器設(shè)置為以下條件1)柱TSKSuperSW300018675和保護(hù)柱18762自動取樣器；2)溫度室溫；3)泵設(shè)置一梯度等梯度；流速0.3ml/min;持續(xù)時間25min;最大壓力120巴；4)注射器設(shè)置一注射標(biāo)準(zhǔn)注射；注射體積20拉伸速度100(al/min;注射速度100nl/min;針的洗滌100nlH2O;停止時間與泵相同；4)DAD信號一表4;峰寬〉0.05min;狹縫2nm;停止時間與泵相同；表4<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>5)RID信號一溫度35°C;反應(yīng)時間>0.2min4s，標(biāo)準(zhǔn)；6)柱恒溫器溫度23°C;儲存溫度。'用IO柱體積(50ml-以0.3毫升/分鐘為166分鐘)流動相平衡柱，并且在注入樣本之前凈化RID20分鐘。注入20pl分離溶液。在所獲得的色譜圖中，1)主要未PEG化峰在約13-13.5分鐘的保留時間時洗提；2)與hGH二聚體對應(yīng)的峰在約12.2-12.6分鐘的保留時間時洗提；和3)較高分子量蛋白質(zhì)(未PEG化)在7.4-8.0分鐘的保留時間時洗提。主要PEG化峰在約8.3-8.8分鐘的保留時間時洗提。注入20pl標(biāo)準(zhǔn)品并運行HPLC程序。注入20nl測試物品并運行HPLC程序。運行樣本三次。記錄平均保留時間?？赡苄枰獙Χ鄠€條件和/或參數(shù)進(jìn)行修改以進(jìn)一歩表征PEG化或其它形式的hGH。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知對于SEC-HPLC進(jìn)行的修改。數(shù)據(jù)分析將hGH測試物品的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相比較。就未PEG化hGH的純度測定而言，比較hGH測試物品和標(biāo)準(zhǔn)品的主峰積分面積，并以下式計算hGH測試物品中單體的百分含量(hGH樣本的峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積)xi00%。也對hGH測試物品中二聚體和/或較大聚集體的百分含量進(jìn)行計算。就PEG化hGH的純度測定而言，比較PEG化hGH測試物品和標(biāo)準(zhǔn)品的主峰積分面積，并通過下式計算PEG化hGH樣本中PEG化單體的百分含量(PEG化hGH樣本的峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積)xiOO%。也對hGH測試物品中PEG化二聚體、較大聚集體和未PEG化單體的百分含量進(jìn)行計算。或者，通過下式測定未PEG化hGH或PEG化hGH的純度(hGH樣本的主峰的積分面積/hGH樣本所有峰的積分面積)x100%。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。也使用絕對質(zhì)量或直接峰面積而非參考標(biāo)準(zhǔn)品的百分比來計算純度測定值。詳細(xì)說明hGH測試物品與標(biāo)準(zhǔn)品之間保留時間的差異為約〈士30秒。就二聚體和較高分子量蛋白質(zhì)而言，在以測試物品獲得色譜圖中，保留時間小于主峰保留時間的任何峰面積的總和分別不大于峰總面積的4.0%或6.0%。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。圖18繪示30KPEG-metY35pAF和metY35pAF的SEC-HPLC數(shù)據(jù)。實例6陽離子交換高效液相色譜(cIEX-HPLC)陽離子交換高效液相色譜(cIEX-HPLC)是一項依賴于固定于樹脂上的蛋白質(zhì)與電荷之間的電荷-電荷相互作用的技術(shù)。陽離子交換色譜利用與帶負(fù)電樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)中帶正電的離子。hGH的常用結(jié)構(gòu)修飾為天冬酰胺(Asn)殘基脫酰胺化，且此cIEX-HPLC方法允許PEG化和未PEG化hGH的已脫酰胺化和脫酰胺中間體分離。使用以下方法評定重組人生長激素(hGH)的相對純度和潛在化學(xué)降解(意即，脫酰胺化)。本方法用于支持對于PEG化和未PEG化hGH的鑒別和純度評定。使用本技術(shù)可觀察hGH的一些部分降解產(chǎn)物。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備UV/Vis分光光度計(Agilent8453或其相當(dāng)物)；50pl石英皿；0.5mLVivaspin濃縮器(視需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相當(dāng)物)；HPLC小瓶和蓋(Alltech100螺紋蓋聚丙烯小瓶#12%2、TFE線性蓋弁73048、開孔螺紋蓋#73044或其相當(dāng)物)；1L和2L清潔玻璃瓶;柱，諸如PolyCATA(4.6x200mm、5p、1000A)(204CT0510)禾口PolyCATA保護(hù)柱(4.6x10mm、5p、1000A)(JGCCT0510);和能夠執(zhí)行線性梯度的高效液相色譜儀(諸如，裝備有真空除氣器、四級泵、恒溫自動取樣器、恒溫柱隔室、二極管陣列檢測器(DAD)、差示折光檢測器(RID)和Chemstation色譜分析軟件的Agilent1100HPLC)。除非另作說明，否則用于本程序中的試劑包括分析級或更好級別的固體化學(xué)品和HPLC級或更好級別的溶劑。所述化學(xué)品的實例包括乙酸銨，SpectrumHPLC級A2149,或其相當(dāng)物；乙腈，F(xiàn)isherHPLC級A998，或其相當(dāng)物；碳酸氫銨。額外溶液包括流動相A(40%乙腈，H20);流動相B(40%乙腈、500mM乙酸銨，pH4.5)和脫酰胺化對照的緩沖液(30mM碳酸氫銨，pH9.0)。就流動相A緩沖液而言，將400mLHPLC級乙腈與600mL經(jīng)無菌過濾的Milli-QH20混合，并且使用0.22PES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾所得混合物。就流動相B緩沖液而言，將38.54g乙酸銨溶解于970mLMilli-QH20中。用冰乙酸使溶液達(dá)到pH4.5，且接著用Milli-QH20使體積達(dá)到1000mL。使用0.22PES過濾器(Corning#431098)無菌過濾緩沖液。將100mLMilli-QH20、400mLHPLC級乙腈禾口500mL500mM乙酸銨(pH4.5)混合。就脫酰胺化對照的緩沖液而言，將2.37g碳酸氫銨溶解于0.95LMilli-QH20中，并且用NaOH使pH值達(dá)到9.0。接著用Milli-QH20使體積達(dá)到1L。使用0.22PES過濾器(Corning弁431098或其相當(dāng)物)無菌過濾所得緩沖液。在cIEX-HPLC中用作標(biāo)準(zhǔn)品的樣本包括經(jīng)1.0ml水復(fù)水并稀釋到0.9-1.1mg/ml的世界健康組織(WHO)hGH(目錄號98/574)。其它hGH參考標(biāo)準(zhǔn)品可以0.9-1.1mg/ml的濃度使用。就分離溶液而言，使用PD-IO、N叩-IO或Nap-5脫鹽柱(視樣本體積而定)將hGH標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液更換成30mM碳酸氫銨(pH9.0)緩沖液。使用0.5mLVivaspin濃縮器將標(biāo)準(zhǔn)品濃縮到0.9-1.1mg/ml，在37"C下培育24小時，且接著在-8(TC下儲存待用。將測試物品稀釋到1.0mg/ml。包括經(jīng)脫酰胺化的分離標(biāo)準(zhǔn)品?；蛘?，將測試物品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成多種濃度。樣本濃度是使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量。程序?qū)x器設(shè)置成以下條件1)柱PolyCATA204CT0510和JGCCT0510;2)自動取樣器溫度4°C;3)泵設(shè)置一梯度5050-250mM乙酸鈸，pH4.5;表5<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>6)柱恒溫器溫度2(TC;儲存溫度。用10柱體積90%流動相A和10%流動相B平衡柱。注入15分離溶液。就所獲得的色譜圖而言，主要未PEG化峰在約64-67分鐘的保留時間時洗提；未PEG化脫酰胺化峰在約62-65分鐘的保留時間時洗提；主要PEG化峰在約43-46分鐘的保留時間時洗提；且PEG化脫酰胺化峰在約41-44分鐘的保留時間時洗提。注入15pl標(biāo)準(zhǔn)品并運行HPLC程序。注入15pl測試物品并運行HPLC程序。運行樣本三次。報導(dǎo)平均保留時間?？赡苄枰獙Χ鄠€條件和/或參數(shù)進(jìn)行修改以分析PEG化和其它形式的hGH。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知對于cIEX-HPLC進(jìn)行的修改。其它參考標(biāo)準(zhǔn)品包括(但不限于)用于加工(in-process)釋放主體pY35pAF的加工中的pY35pAF;用于量化PEG化pY35pAF中的殘余游離pY35pAF的純pY35pAF;和純PEG-pY35pAF。數(shù)據(jù)分析將hGH測試物品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相比較，并且計算未PEG化hGH與PEG化hGH的純度測定值?？赏ㄟ^諸如下式的計算式測定純度(hGH樣本的主峰積分面積/hGH樣本所有峰的積分面積)xl00%。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。表6和圖19繪示對30KPEGmY35pAFhGH和mY35pAFhGH的cIEX-HPLC分析。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>實例7本實例描述對乙?；?D,L-苯丙氨酸(pAF)和間PEG-羥胺衍生物的合成。使用先前于Zhang,Z.，Smith,B.A.C.,Wang,L.，Brock,A.,Cho,C.&Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)6735-6746中所述的程序合成外消旋pAF。為合成間PEG-羥胺衍生物，完成以下程序。向在室溫(RT)下攪拌1小時的(N-t-Boc-氨基氧基)乙酸(0.382g,2,0mmol)和1,3-二異丙基碳化二酰亞胺(0.16mL,1.0mmol)于二氯甲烷(DCM,70mL)中的溶液中加入甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2,7.5g,0.25mmol，Mt.30K，來自BioVectra)和二異丙基乙胺(0.1mL,0.5mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)48小時，且隨后將其濃縮到約100mL。將混合物逐滴加入冷乙醚(800mL)中。經(jīng)t-Boc保護(hù)的產(chǎn)物沉淀析出并通過過濾收集，用乙醚3X00mL加以洗滌。通過將其再溶解于DCM(lOOmL)中并在乙醚(800mL)中沉淀兩次進(jìn)一步加以純化。真空干燥產(chǎn)物得到7.2g(96°/。)，以NMR和Nihydrin測試加以確定。(TC下于50%TFA/DCM(40mL)中進(jìn)行以上獲得的經(jīng)保護(hù)產(chǎn)物(7.0g)的脫Boc反應(yīng)歷時l小時，且接著在室溫下進(jìn)行1.5小時。在真空中去除大部分TFA后，通過將二噁烷(1mL)中的4NHC1加入殘余物中來將羥胺衍生物的TFA鹽轉(zhuǎn)換成HC1鹽。將沉淀物溶解于DCM(50mL)中并在乙醚(800mL)中再沉淀。過濾收集終產(chǎn)物(6.8g，97%),用乙醚3x100mL洗滌，真空干燥，在氮氣下儲存。使用相同程序合成其它PEG(5K，20K)羥胺衍生物。實例8本實例描述用于包含非天然氨基酸的hGH多肽的表達(dá)和純化方法。宿主細(xì)胞已經(jīng)正交tRNA、正交氨?；鵷RNA合成酶和hGH構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化。37"下，首先使來自經(jīng)轉(zhuǎn)化DH10B(fis3)細(xì)胞的冷凍甘油儲備液的小刺生長于具有100嗎/ml氨比西林(ampicillin)的2ml指定培養(yǎng)基(補充有亮氨酸、異亮氨酸、痕量金屬和維生素的葡萄糖基本培養(yǎng)基)中。當(dāng)OD6oo達(dá)到2-5時，將60)d轉(zhuǎn)移到60ml具有100pg/ml氨比西林的新制指定培養(yǎng)基中，且使其再在37'C下生長直至OD,達(dá)到2-5。在5升的發(fā)酵槽(SartoriusBBI)中，將50mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到具有100嗎/ml氨比西林的2升指定培養(yǎng)基中。用碳酸鉀將發(fā)酵槽的pH值控制在pH6.9，溫度為37'C，氣體流速為5lpm且以聚烯烴消泡劑KF0F119(Lubrizol)消泡。自動調(diào)節(jié)攪拌器的速度以使溶氧含量保持在>30%，且如果攪拌器速度達(dá)到其最高值時使用純氧補充空氣噴射。37"C下8小時后，以成比例增加的速率向培養(yǎng)物中饋入50X指定培養(yǎng)基的濃縮物，以保持0.15h"的比生長速率。當(dāng)OD,達(dá)到約100時，加入對乙?；?苯丙氨酸的外消旋混合物直至3.3mM的最終濃度，并且將溫度降到28°C。0.75小時后，加入異丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷直至0.25mM的最終濃度。使細(xì)胞在28'C下再生長S小時，壓成球狀并在-8(TC下冷凍直至進(jìn)一步處理。通過Invitrogen使用手冊所提供的標(biāo)準(zhǔn)His標(biāo)記蛋白質(zhì)純化程序使用ProBond鎳螯合樹脂(Invitrogen,.Carlsbad,CA)隨后陰離子交換柱純化經(jīng)His標(biāo)記的突變體hGH蛋白。將經(jīng)純化的hGH濃縮到8mg/ml并將其緩沖液更換成反應(yīng)緩沖液(20mM乙酸鈉、150mMNaCl、1mMEDTA，pH4.0)。以20:1的PEG:hGH摩爾比率將MPEG-氧基胺粉末加入hGH溶液中。輕柔振蕩下，于28'C下進(jìn)行反應(yīng)2天。通過陰離子交換柱從未經(jīng)反應(yīng)的PEG禾nhGH中純化出PEG-hGH。實例9以SDS-PAGE進(jìn)行的純度分析使用以下方法評價PEG-重組hGH接合物的純度SDS-PAGE，隨后總蛋白質(zhì)染色。當(dāng)放于電場中時，任何帶電分子(諸如蛋白質(zhì))都將遷移。蛋白質(zhì)在電場中遷移的速度將視電場強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的凈電荷和摩擦阻力而定。摩擦阻力是蛋白質(zhì)大小和形狀的函數(shù)。當(dāng)在過量SDS存在下變性時，大部分蛋白質(zhì)以恒定重量比與SDS結(jié)合，從而使其具有基本相同的電荷密度并且根據(jù)蛋白質(zhì)大小在聚丙烯酰胺凝膠中遷移。由凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)可通過考馬斯亮藍(lán)染色(CoomassieBrilliantBluestaining)進(jìn)行檢測。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備XCellSurelockMini-Cell(Invitrogen)、微量恒溫儀設(shè)置為+70-80。C、電源(至多200V)、微型離心機(jī)(諸如BeckmanCoulterMicrofuge18或22R)和往復(fù)式振蕩器。試劑包括NuPAGEMOPSSDS執(zhí)行緩沖液(20X,InvitrogenPNNP0001);NuPAGEMESSDS執(zhí)行緩沖液(20X,InvitrogenPNNP0002);NuPAGELDS樣本緩沖液(4X，InvitrogenPNNP0007);NuPAGE樣本還原劑(10X,InvitrogenPNNP0009);12%Bis-TrisNuPAGE預(yù)制凝膠，1.0mmx10孔(InvitrogenPNNP0341BOX);4-12%Bis-TrisNuPAGE預(yù)制凝膠，1.0mmxio孔(InvitrogenPNNP0321BOX);預(yù)染分子量標(biāo)記(SeeBluePlus2，InvitrogenPNLC5925);MilliQ級H20或其相當(dāng)物；SimplyBlueSafeStain(InvitrogenPNLC6065)或其相當(dāng)物；參考標(biāo)準(zhǔn)品(WHOrhGH標(biāo)準(zhǔn)品)；rhGH的校正溶液(Y35pAF-pB2/pB3,2mg/ml);pEG-rhGH接合物的校正溶液(PEG30-pY35pAF-01，2mg/mL)。使用此項技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量標(biāo)準(zhǔn)品和測試物品的蛋白質(zhì)濃度。PEG化rhGH產(chǎn)物的分析在非還原和還原條件下制備10嗎參考標(biāo)準(zhǔn)品(RS，例如校正溶液PEG30-pY35pAF-01)。將10嗎PEG30-pY35pAF-01(2mg/ml)加入4XLDS和MilliQH20中以獲得IXLDS中的28pl樣本。就還原條件而言，將10pg參考標(biāo)準(zhǔn)品加入4XLDS、IOX還原劑和MilliQH20中以獲得IXLDS和IX還原劑中的28nl樣本。類似地，也在非還原和還原條件下制備10PEG化rhGH測試物品。PEG-rhGH測試物品和PEG-rhGH參考標(biāo)準(zhǔn)品未經(jīng)加熱，但經(jīng)歷點動離心(snapcentrifuged)，隨后將其裝載于根據(jù)制造商的說明書以IXMESSDS執(zhí)行緩沖液(runningbuffer)制備的4-12%Bis-TrisNuPAGE預(yù)制凝膠上。以預(yù)染分子量標(biāo)記、10嗎參考標(biāo)準(zhǔn)品、空白道(推薦使用以使?jié)撛诘霓D(zhuǎn)移作用減到最小)隨后測試物品的順序裝載凝膠且最大設(shè)置為200V歷時35分鐘。將凝膠培育于di-H20中，在振蕩下使用SimplyBlue或其相當(dāng)物染色，且用水脫染色。PEG-rhGH測試物品的電泳圖譜應(yīng)與以PEG-rhGH參考標(biāo)準(zhǔn)品獲得的電泳圖譜相符。與參考標(biāo)準(zhǔn)品不匹配的任何譜帶可能為降解產(chǎn)物或聚集體。較高分子量譜帶可表示聚集體，且較低分子量譜帶可表示不再與PEG接合的多肽。實例10以CEX-HPLC/IEX-HPLC進(jìn)行的rhGH的純度和化學(xué)降解分析使用以下方法通過陽離子交換高效液相色譜(CEX-HPLC)評定PEG化重組人生長激素(rhGH)的相對純度和潛在化學(xué)降解(意即，脫酰胺化)。CEX-HPLC是一項依賴于固定于樹脂上的蛋白質(zhì)與電荷之間的電荷-電荷相互作用的技術(shù)。陽離子交換色譜利用與帶負(fù)電樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)中帶正電的離子。rhGH的常用結(jié)構(gòu)修飾為天冬酰胺(Asn)殘基脫酰胺化，且此CEX-HPLC方法允許PEG化和未PEG化rhGH的己脫酰胺化和脫酰胺中間體分離。本方法用于支持對于PEG化rhGH的鑒別和純度評定。使用本技術(shù)可觀察rhGH的一些部分降解產(chǎn)物。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備UV/Vis分光光度計(Agilent8453或其相當(dāng)物);50pl石英皿;0.5mLVivaspin濃縮器(視需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相當(dāng)物);PD-IO、NAP-10或NAP-5柱(GEHealthcare,目錄號#17-0851-01、17-0853-01、17-0854-01);HPLC小瓶和蓋(Alltech100jil螺紋蓋聚丙烯小瓶#12962、TFE線性蓋弁73048、開孔螺紋蓋#73044或其相當(dāng)物)；1L和2L清潔玻璃瓶；柱一PolyCATA(4.6x200mm、5|x、1000A)(PolyLC,204CT0510)和PolyCATA保護(hù)柱(4.6xl0mm、5n、1000A)(PolyLC,JGCCT0510);和能夠執(zhí)行線性梯度的高效液相色譜儀(諸如，裝備有真空除氣器、四級泵、恒溫自動取樣器、恒溫柱隔室、二極管陣列檢測器(DAD)和Chemstation色譜分析軟件的Agilent1100HPLC)。除非另作說明，否則用于本程序中的試劑包括水(Milli-Q級或其相當(dāng)物)，且固體化學(xué)品為分析級或更好級別，同時溶劑為HPLC級或更好級別。除非另作說明，否則試劑的儲存和程序步驟是在室溫下發(fā)生。所述化學(xué)品的實例包括乙酸銨，SpectrumA2149,HPLC級，或其相當(dāng)物；乙腈，F(xiàn)isherA998，HPLC級，或其相當(dāng)物；碳酸氫銨，F(xiàn)luka#09830，超純>99.5%，或其相當(dāng)物；冰乙酸，F(xiàn)isher#64-19-7，HPLC級，或其相當(dāng)物；二水合檸檬酸鈉，SpectrumSOI65，USP級，或其相當(dāng)物；甘氨酸，SpectrumAM125或其相當(dāng)物；甘露糖醇，SpectrumMA165或其相當(dāng)物；6NHC1，Mallinckrodt2662-46或其相當(dāng)物。流動相A緩沖液為50mM乙酸銨(pH4.25)、40%乙腈(AcCN)，且流動相B緩沖液為500mM乙酸銨(pH4.25)、40%AcCN。所制備的其它試劑為10%乙酸；脫酰胺緩沖液30mM碳酸氫銨，pH9.0;和樣本稀釋緩沖液20mM檸檬酸鈉、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇(pH6.0)，各自使用0.22pmPES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾。將世界健康組織(WHO)rhGH(目錄號98/574)用作未PEG化的hGH標(biāo)準(zhǔn)品。使其在1.0ml水中復(fù)水并使用稀釋緩沖液將其稀釋到1.1mg/ml。加入10%(v/v)10%乙酸以使pH值介于pH3.8-4.3之間和1.0mg/ml(可接受的范圍為0.9-1.1mg/ml)的最終濃度。以類似方式制備另一未PEG化的hGH標(biāo)準(zhǔn)品，校正溶液Y35pAF-pB2/pB3。也以類似方式制備PEG化hGH標(biāo)準(zhǔn)品，校正溶液PEG30-pY35pAF-01。就PEG化分離溶液而言，使用PD-10、Nap-10或Nap-5脫鹽柱將PEG30-pY35pAF-01校正溶液緩沖液更換成30mM碳酸氫銨(pH9.0)緩沖液。使用0.5mLVivaspin濃縮器將標(biāo)準(zhǔn)品濃縮到約2mg/ml(可接受的范圍為1.9-2.1mg/ml)，并且在37'C下培育樣本24小時。使用稀釋緩沖液將樣本或所需的部分樣本稀釋到1.1mg/ml，并且加入10%(v/v)10%乙酸以使pH值介于pH3.8-4.3之間和1.0mg/ml(可接受的范圍為0.9-1.1mg/ml)的最終濃度。使用稀釋緩沖液將測試物品稀釋到1.1mg/ml，并且加入10%(v/v)10°/。乙酸以使pH值介于pH3.8-4.3之間和1.0mg/ml(可接受的范圍為0.9-1.0mg/ml)的最終濃度。使用此項技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量標(biāo)準(zhǔn)品和測試物品的蛋白質(zhì)濃度。程序?qū)x器設(shè)置為以下條件1)柱PolyCATA204CT0510和JGCCT0510;2)自動取樣器溫度室溫；3)泵設(shè)置步驟梯度81.5-108.5mM乙酸銨pH4.25(7-13%B)，隨后108.5-500mM乙酸銨pH4.25(13-100%B);4)表7;表7<table>complextableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>5)注射器設(shè)置一注射標(biāo)準(zhǔn)注射；注射體積25pi;拉伸速度50pl/min;注射速度50^1/min;針的洗滌15^1H20;停止時間與泵相同；6)DAD信號表8;表8<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>峰寬>0.1min;狹縫4nm;停止時間與泵相同；7)柱恒溫器溫度30°C;記錄溫度。用10-15柱體積100%流動相A平衡柱。注入25-50|ilPEG化的校正溶液PEG30-pY35pAF-01。主要PEG化峰在56.97min(±0.5min)的保留時間時洗提。接下來，注入25-50piWHO或校正溶液Y35pAF-pB2/pB3并運行HPLC程序。主要未PEG化的峰是在98.54min(±0.5min)的保留時間時洗提，與主要PEG化峰的相對保留時間為1.73±0.01。接著注入25-50^PEG化分離溶液。在所獲得的色譜圖中，主要PEG化峰是在56.97min(±0.5min)的保留時間時洗提，且PEG化脫酰胺峰相對于主峰(45.23±0.3min;(當(dāng)前條件引起2.3±0.02的分離度))在0.79±0.02的保留時間時洗提。隨后注入25-50^1PEG化測試物品并運行HPLC程序。運行樣本三次，并記錄平均保留時間。以吸光度(280nm)產(chǎn)生色譜圖。數(shù)據(jù)分析將PEG化rhGH測試物品的保留時間與校正溶液PEG30-pY35pAF-01的保留時間相比較。使用下式計算測試物品的平均純度(主峰的積分面積/所有峰的積分面積)x100%。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。實例11以SEC-HPLC對rhGH進(jìn)行純度測定使用本程序通過尺寸排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)評定重組人生長激素(rhGH)和PEG化rhGH的純度。這項測試使樣本中的單體與二聚體和具有較高分子量其它相關(guān)物質(zhì)分離，且也使PEG化樣本與未PEG化樣本分離。SEC-HPLC是一項使用固定相作為透過流動相分子的多孔基質(zhì)的技術(shù)。小到足以進(jìn)入孔狀結(jié)構(gòu)的樣本分子經(jīng)延遲，而較大分子受排阻且因此被迅速載過柱。因此，尺寸排阻色譜意味著通過尺寸分離分子，并且色譜洗提時間為特定分子的特征。本程序用于測定單體(PEG化和未PEG化)AGH的百分含量。使用本技術(shù)也可觀察二聚體和其它高分子量蛋白質(zhì)。SEC-HPLC積分的實例如圖20所示，其中y軸為吸光度(214nm)且x軸為時間(分鐘)。有關(guān)本技術(shù)的參考文獻(xiàn)包括歐洲藥典2002，第193頁；英國藥典2001，第1941頁；和R.M.Riggin等人JournalofChromatography435(1988)，第307-318頁的"High-PerformanceSize-ExclusionChromatographicDeterminationofthePotencyofBiosyntheticHumanGrowthHormoneProducts"。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備UV/Vis分光光度計(Agilent8453或其相當(dāng)物)；50pl石英皿；0.5mLVivaspin濃縮器(視需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相當(dāng)物)；HPLC小瓶和蓋(Alltech100^螺紋蓋聚丙烯小瓶#12962、TFE線性蓋存73048、開孔螺紋蓋#73044或其相當(dāng)物)；1L和2L清潔玻璃瓶；柱一TosohaasTSKSuperSW300018675和SuperSW保護(hù)柱18762、尺寸為4.6x300mm、粒度為4pm且孔徑為250A的基于二氧化硅的尺寸排阻HPLC柱，以及尺寸為4.6x35mm且粒度為4p的保護(hù)柱；和能夠執(zhí)行線性梯度的高效液相色譜儀(諸如，裝備有真空除氣器、四級泵、恒溫自動取樣器、恒溫柱隔室、二極管陣列檢測器(DAD)、差示折光檢測器(RID)和Chemstation色譜分析軟件的Agilent1100HPLC)。除非另作說明，否則用于本程序中的試劑包括水(Mmi-Q級或其相當(dāng)物)，且固體化學(xué)品為分析級或更好級別，同時溶劑為HPLC級或更好級別。除非另作說明，否則試劑的儲存和程序步驟是在室溫下發(fā)生。所述化學(xué)品的實例包括磷酸二氫鈉，SpectrumU.S.P.級S0130,或其相當(dāng)物；七水合磷酸氫二鈉，SpectrumU.S.P.級S0140或其相當(dāng)物；2-丙醇，F(xiàn)isherHPLC級A451-4，或其相當(dāng)物。流動相緩沖液為97%63mM磷酸鈉(pH7.0)、3%2-丙醇。溶液A為25mM磷酸鈉，pH7.0。使用0.22PES過濾器(Corning#431098或其相當(dāng)物)無菌過濾兩種溶液。將世界健康組織(WHO)rhGH(目錄號98/574)用作未PEG化的hGH標(biāo)準(zhǔn)品。用l.Oml水使其復(fù)水并且用WHO緩沖液將其稀釋到1mg/ml濃度(可接受的范圍為0.9-1.1mg/ml)。以類似方式制備另一未PEG化的hGH標(biāo)準(zhǔn)品，校正溶液Y35pAF-pB2/pB3，并且用20mM檸檬酸鈉、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀釋。也以類似方式制備PEG化hGH標(biāo)準(zhǔn)品，校正溶液PEG30-pY35pAF-01，并且用20mM檸檬酸鈉、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀釋。就分離溶液而言，使PEG30-pY35pAF-02更高分子量標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到1mg/ml的濃度(可接受的范圍為0.9-1.1mg/ml)。本溶液含有約33%PEG-PEG-GH、66.5%PEG-GH。用溶液A將測試材料稀釋到約1.0mg/ml(可接受的范圍為0.9-1.1mg/ml)。使用此項技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量所有樣本的濃度。可以任何適當(dāng)緩沖液執(zhí)行對樣本的稀釋。程序?qū)x器設(shè)置為以下條件1)柱TSKS叩erSW300018675和保護(hù)柱18762;2)泵設(shè)置一梯度等梯度；流速0.3ml/min;持續(xù)時間25min;最大壓力120巴；3)注射器設(shè)置一注射標(biāo)準(zhǔn)注射；注射體積10pi;拉伸速度100nl/min;注射速度100pl/min;針的洗滌100|llH2O;停止時間與泵相同；4)DAD信號表9;表9<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>峰寬>0.05min;狹縫:2nm;停止時間與泵相同；5)RID信號一溫度35°C;反應(yīng)時間〉0.2min4s，標(biāo)準(zhǔn)；6)柱恒溫器溫度23°C;記錄溫度。用10柱體積(50m卜以0.3毫升/分鐘為166分鐘)流動相平衡柱，并且在注射樣本之前凈化RID至少20分鐘。運行樣本前自動平衡DAD和RI檢測器。注入20nl校正溶液Y35pAF-pB2/pB3(或WHO標(biāo)準(zhǔn)品)并運行HPLC程序。在所獲得的色譜圖中，主要未PEG化的峰在約12.96(±0.05)min的保留時間時洗提。具有較高分子量的未PEG化rhGH二聚體相對于主峰在0.94±0.02的保留時間時洗提。具有較高分子量的聚集體在7.3-8.0min的保留時間時洗提。注入20pl校正溶液PEG30-pY35pAF-01。主要PEG化峰是在約8.33(±0.08)min(與未PEG化的AGH的相對保留時間為0.64)的保留時間時洗提。具有較高分子量的PEG化rhGH聚集體在大于8.0min的時間時洗提。注入20|xl分離溶液并運行HPLC程序。主要PEG化的峰是在8.28min的保留時間時洗提，且具有較高分子量的物質(zhì)在7.54min時洗提，相對于主要PEG化峰的相對保留時間為0.9(±0.05)。注入20Ml測試物品并運行HPLC程序。運行樣本三次，并記錄平均保留時間。將rhGH測試物品的保留時間與rhGH標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相比較。將來自測試物品的SEC-HPLC數(shù)據(jù)與從參考標(biāo)準(zhǔn)品獲得的數(shù)據(jù)相比較。為測定PEG化rhGH的純度，將PEG化rhGH樣本的主峰積分面積與峰總面積相比較，并且通過下式計算PEG-rhGH樣本中PEG化單體的百分含量(PEG-rhGH樣本的主峰面積/全部峰面積)xi00%。也對PEG化hGH測試物品中PEG化二聚體、較大聚集體和/或未PEG化單體的百分含量進(jìn)行計算。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。在主要PEG化hGH峰之前于色譜圖中洗提的峰表示具有較高分子量的物質(zhì)。所述具有較高分子量的物質(zhì)可包括(但不限于)二聚體(諸如PEG-PEG-hGH和其它可能的二聚體)或可溶聚集體。在主要PEG化hGH峰后洗提的峰表示具有較低分子量的物質(zhì)。所述具有較低分子量的物質(zhì)可包括(但不限于)未PEG化的單體和剪短形式的PEG化hGH。實例12以RP-HPLC進(jìn)行的PEG-hGH的純度和化學(xué)降解分析使用以下方法通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)評定PEG化重組人生長激素(PEG-hGH)的相對純度和潛在化學(xué)降解(意即，氧化)。RP-HPLC是一種基于相對疏水性分離分子的技術(shù)。使樣本越過與烴鏈共價鍵接的二氧化硅固定相。所需分子經(jīng)固定相延遲并用同溶劑洗提。色譜洗提時間為特定分子的特征。本方法基于疏水性與和結(jié)構(gòu)修飾(諸如氧化)有關(guān)的保持行為的微小差異使PEG-hGH與未PEG化hGH以及同功異型物分離。本方法用于支持對于PEG-hGH的鑒別和純度評定。使用本技術(shù)可觀察rhGH的一些部分降解產(chǎn)物。RP-HPLC積分的實例如圖21所示，其中y軸為吸光度(214nm)且x軸為時間(分鐘)。用于本程序中的設(shè)備包括以下設(shè)備或其相當(dāng)?shù)脑O(shè)備UV/Vis分光光度計(Agilent8453或其相當(dāng)物);50nl石英皿;0.5mLVivaspin濃縮器(視需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相當(dāng)物)；HPLC小瓶和蓋(Alltech100pl螺紋蓋聚丙烯小瓶#12962、TFE線性蓋弁73048、開孔螺紋蓋#73044或其相當(dāng)物)；1L和2L清潔玻璃瓶;柱一J.T.BakerWidePoreButyl，250x4.6mm(目錄號7H6-00);和能夠執(zhí)行線性梯度的高效液相色譜儀(諸如，裝備有真空除氣器、四級泵、恒溫自動取樣器、恒溫柱隔室、二極管陣列檢測器(DAD)Chemstation色譜分析軟件的Agilent1100HPLC)。除非另作說明，否則用于本程序中的試劑包括水(Milli-Q級或其相當(dāng)物)，且固體化學(xué)品為分析級或更好級別，同時溶劑為HPLC級或更好級別。除非另作說明，否則試劑的儲存和程序步驟是在室溫下發(fā)生。所述化學(xué)品的實例包括乙腈，F(xiàn)isherA998,HPLC級，或其相當(dāng)物；三氟乙酸，HalocarbonUN2699，Biograde，或其相當(dāng)物，'磷酸鈉，SpectrumMA1654，USP級，或其相當(dāng)物；甘氨酸，SpectrumAMI25，或其相當(dāng)物；甘露糖醇，SpectrumMA165，或其相當(dāng)物；海藻糖，F(xiàn)luka90208，或其相當(dāng)物；10N氫氧化鈉，或其相當(dāng)物。流動相A為0.1%TFA水溶液，且流動相B為乙腈中的0.1%TFA。一種未PEG化標(biāo)準(zhǔn)品為世界健康組織(WHO)rhGH(目錄號98/574)。用1.0ml水使其復(fù)水并且用WHO緩沖液將其稀釋到1.0mg/ml(可接受的范圍為0.9-1.1mg/ml)。以類似方式制備另一未PEG化的標(biāo)準(zhǔn)品，校正溶液Y35pAF-pB2/pB3，并且用20mM檸檬酸鈉、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀釋。也以類似方式制備校正溶液PEG30-pY35pAF-01，PEG化hGH標(biāo)準(zhǔn)品，并且用20mM檸檬酸鈉、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀釋。就PEG化的分離溶液而言，在4'C下以0.1%11202培育PEG30-pY35pAF-0124小時以氧化PEG30-pY35pAF-01。為獲得氧化程度在5%與20%之間的PEG30-pY35pAF-01，所述用H202進(jìn)行培育的時間可在4-24小時之間變化?？梢曅枰尤氪呋?20mg/ml儲備液)以終止氧化反應(yīng)。使用稀釋緩沖液將測試物品稀釋到1.0mg/ml(可接受的范圍為0.9-1.0mg/ml)。樣本稀釋緩沖液可為任何適當(dāng)?shù)木彌_液。使用此項技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量標(biāo)準(zhǔn)品和測試物品的蛋白質(zhì)濃度。程序?qū)x器設(shè)置為以下條件1)柱J.T.BakerWidePoreButyl，250x4.6mm(目錄號7116-00);2)自動取樣器一溫度4°C;3)泵設(shè)置表10;表10<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>4)注射器設(shè)置一注射標(biāo)準(zhǔn)注射；注射體積10^1;拉伸速度100pl/min;注射速度lOO^l/min;針的洗滌20^llH20;停止時間與泵相同；5)DAD信號表ll;表11<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>峰寬〉0.1min;狹縫4nm;停止時間與泵相同；6)柱恒溫器溫度RT;記錄溫度。用10CVHPLC級蒸餾水沖洗新柱以去除運載溶劑。用MillQH20中的60%異丙醇中的10-15柱體積(CV)0.1。/。TFA和10-15CVH20清洗柱。視需要，可接著以5CV50:50的DMSO:H20清洗柱；另外，用流動相A平衡柱。用10-15柱體積100%流動相A平衡柱。注入10|ilPEG化校正溶液PEG30-pY35pAF-01。主要PEG化峰在17.05min(±0.5min)的保留時間時洗提。注入10nlWHO或校正溶液Y35pAF-pB2/pB3并運行HPLC程序。主要未PEG化的峰是在19.04min(±0.5min)的保留時間時洗提，與主要PEG化峰的相對保留時間為1.1±0.05。接著注入IO^PEG化分離溶液。在所獲得的色譜圖中，主要PEG化峰是在17.12min(±0.5min)的保留時間時洗提，且PEG化經(jīng)氧化峰相對于主峰(15.94±0.3min和2.97±0.05的分辨度))在0.93±0.02的保留時間時洗提。注入10(xlPEG化測試物品并運行HPLC程序。運行樣本三次，并記錄平均保留時間。將PEG化rhGH測試物品的保留時間(使用A214)與校正溶液PEG30-pY35pAF-01的保留時間相比較。使用下式計算測試物品(使用A214)的平均純度(主峰的積分面積/所有峰的積分面積)xi00%。忽略由溶劑產(chǎn)生的任何峰。實例13有關(guān)配方研究中所使用的方法的概述展示于表12中。長期儲存、堿性或酸性條件可導(dǎo)致以下與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)脫酰胺化hGH—Asn149、Asnl52;經(jīng)氧化hGH—Met14、Metl25;異構(gòu)化hGH—Aspl30;脫水hGH—Aspl30;脫Phe/脫Phe-Pro-Phel、Pro2(非酶裂解)；二聚體(共價和非共價物質(zhì))；剪短hGH(Thrl42與Tyrl43之間裂解)。.使用額外方法(諸如水分分析、pH值和包括但不限于增殖檢定的生物檢定)評估包含非天然編碼的氨基酸的PEG化hGH配方。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>結(jié)果含水量、pH值和濃度結(jié)果展示于表14-32中。表14:復(fù)水后水分、濃度、pH值，T=0<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表16:復(fù)水后濃度、pH值，了=1周，4°C<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表28:復(fù)水后濃度、pH。LT=l周，40°C配<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表30:復(fù)水后濃度、pH值，T:4周，40°C<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>本研究的SDS凝膠展示于圖22-58中。在圖22第3道和第4道中可見模糊的21.5kDa譜市。SEC-HPLC:圖20為SEC-HPLC積分的實例。表33-50展示由本研究獲得的結(jié)果。剪短峰是在主要PEG化hGH峰與未PEG化峰之間洗提。表33:SEC-HPLC(峰面積概要)；T=0<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表34:SEC-HPLC(峰面積概要)；1=1周，4°C<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表35:SEC-HPLC(峰面積概要)；T-2周，4°C<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表44:SEC-HPLC(峰面積概要)；T-2個月，25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表55:RP-HPLC(峰面積概要)；T-6周4。C<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>表58:RP-HPLC(峰面積概要)；T-l周；25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>表62:RP-HPLC(峰面積概要)；T-2個月；25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>表63:RP-HPLC(峰面積概要)；1=3個月；25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage135</image>表66:RP-HPLC(峰面積概要)；T-4周；40°C<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table>醇、2%海藻糖、0.01%聚山梨醇酯20(pH6.0)(配方E^P6MT緩沖液)中8、10、12和14mg/mLPEG-hGH的注射可行性。在8lbs力下將樣本推過30號針并定時持續(xù)時間。當(dāng)在8lbs力下將1mL各濃度推過30號針時，將8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL禾口14mg/mL濃度分別以7.4s(秒)、9.9s、9.9s禾P10.7s注入。由于普通人可在注射器上施加至多8lbs力，故一般將在8lbs力下于IO秒內(nèi)注入1cc接受為注射標(biāo)準(zhǔn)。實例16一周復(fù)水研究就本研究而言，在4'C下儲存經(jīng)復(fù)水樣本1周。本研究中所使用的配方基質(zhì)與表13相同。儲存1周后，測量濃度和pH值。如表72-74和圖59-60所示，也通過SEC-HPLC、RP-HPLC和SDS-PAGE分析樣本。<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table>在4'C下儲存復(fù)水樣本1周會導(dǎo)致P6MT、P6MTMet、P7GT和P6GT-P的峰前1略有增加(約1%)。具有較低pH值的樣本比pH6和7的樣本展現(xiàn)出更多脫PEG化作用。實例17攪動/UV研究使樣本經(jīng)歷可模擬長期儲存條件的壓力，并觀察降解或聚集產(chǎn)物的誘導(dǎo)。曝露至UV光后，分子中或尤其在肟或PEG處可出現(xiàn)降解。執(zhí)行兩項攪動研究。在4小時的攪動研究中，在環(huán)境溫度下用力渦旋表13的復(fù)水樣本4小時，隨后測量濃度和pH值，并且通過SEC-HPLC、RP-HPLC禾QSDS-PAGE執(zhí)行分析。在4'C下儲存后一周后通過SEC-HPLC分析一小組這些樣本，以調(diào)查聚集體是否可能解離成單體。對照樣本為在環(huán)境室溫下儲存4小時的復(fù)水樣本。在2小時的攪動研究中，在環(huán)境溫度下輕柔渦旋無聚山梨醇酯的樣本、其含聚山梨醇酯的相應(yīng)物和P6MA，以確定攪動后聚山梨醇酯對PEG化hGH穩(wěn)定性的影響。參看表85。就UV曝露研究而言，對照為在環(huán)境室溫下儲存4小時的復(fù)水樣本。在環(huán)境溫度下將凍干樣本曝露至UV光歷時4小時，并使其在水中復(fù)水，隨后通過SDS-PAGE、RP-HPLC和SEC-HPLC加以分析。參看表75-85。'這些樣本的SDS-PAGE分析展示于圖61-66中。SEC-HPLC數(shù)據(jù)表明0.01%含有聚山梨醇酯20的配方在攪動期間誘導(dǎo)聚集(30-80%)。Bam,NB等人描述在攪動重組hGH(rhGH)過程中使用Tween20(聚山梨醇酯20)抑制不溶聚集體(JPharmSci.1998Dec;87(12):1554-9)。此外，Maa，YF等人指出，聚山梨醇酯20將在制造經(jīng)噴霧干燥的rhGH粉末時使不溶蛋白質(zhì)聚集體減少(JPharmSci1998Feb;87(2):152-9)。已發(fā)現(xiàn)攪動誘導(dǎo)的聚集體將為不可逆非共價聚集體。主要的光誘導(dǎo)降解路徑為脫PEG化和形成共價峰前2。表75:濃度，pH，攪動/UV對照<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>表88:SEC-HPLC(峰面積概要)；攪動T二0<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table>在攪動下痕量的聚山梨醇酯誘發(fā)聚集。當(dāng)攪動時，組氨酸配方的執(zhí)行情況可與含甘氨酸配方相比。實例19有關(guān)加速聚集的研究執(zhí)行加速壓力研究以模擬長期儲存的條件并且鑒別可能降解或聚集的產(chǎn)物。有關(guān)加速聚集的研究是使用約8mg/ml和14mg/ml的2種配方(配方IDH7MT-P和H7MGT-P)執(zhí)行。配方組份描述于表91中。"-P"標(biāo)記表示無聚山梨醇酯20。壓力研究為冷凍-解凍條件、攪動、UV曝露和溫度。上述方法是用于評定PEG化hGH。樣本是通過分別在實例9和11中描述的SDS-PAGE和SEC-HPLC方法評定。供分析的額外時間點包括1個月、2個月等。用于樣本分析的額外技術(shù)包括動態(tài)光散射(DLS)和分析型超速離心。表91:基質(zhì)配方(加速聚集的研究)<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table>表95:SEC-HPLC(峰面積概要)配方ID:H7MGT-P;濃度14mg/mL<table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table>樣本的冷凍/解凍使較高M(jìn)W的聚集體增加0.2-0.3%，且在第一個冷凍-解凍周期后8mg/mL樣本中具有較高M(jìn)W的聚集體可能解離。渦旋/UV曝露就本研究而言，使用表91中所示的配方基質(zhì)。對于攪動(渦旋)和UV曝露研究中的對照樣本而言，使配方在室溫下保持6小時。在攪動研究中，在室溫下以高速渦旋液體樣本6小時。在UV曝露的研究中，在室溫下將凍干樣本曝露到UV光歷時4小時，并且使其復(fù)水隨后進(jìn)行分析。移出樣本供SEC-HPLC和SDS-PAGE分析。表96-98展示對照樣本、渦旋樣本和UV曝露樣本的SEC-HPLC數(shù)據(jù)。這些樣本的SDS-PAGE分析如圖71和圖72所示。表96:SEC-HPLC(峰面積概要)；渦旋/UV對照<table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>表101:SEC-HPLC(峰面積概要)；1=1周；40°C<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>在4。C下1周后，H7MT-P產(chǎn)生比H7MGT-P少的較高分子量聚集體。在4(TC下，H7MT-P導(dǎo)致比H7MGT-P略多的二聚體形成但比H7MGT-P少的脫PEG化hGH。兩周后，在4(TC下觀察到二聚作用的量增加。在4(TC下觀察到顯著脫PEG化。在4(TC下H7MT-P形成比H7MGT-P少的脫PEG化hGH。額外的時間點包括在4周時進(jìn)行的測量。此外，將PEG化hGH的樣本暴露至熱伸展條件。在85。C下培育熱伸展樣本10分鐘，所述溫度高于82'C的熔解溫度(Tm)。熱伸展誘導(dǎo)聚集。表103展示對于暴露至熱伸展條件的樣本的SEC-HPLC分析。SDS-PAGE分析展示于圖73-74中。表103:SEC-HPLC(峰面積概要)；熱伸展<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>實例20FT7IR(傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(FourierTransformInfraredSpectroscopy))掃描以FT/IR執(zhí)行對PEG化hGH的分析。FT/IR掃描是在Jasco型FT/IR600Plus上執(zhí)行。以4cm"的解析度掃描各樣本320次，并用JascoSpectraManagervl.53.00進(jìn)行分析。在運行每天的樣本之前，取得空氣背景值和水空白值。通過在1700cm"下不存在吸光度來確定源自水的信號的消除。將適當(dāng)背景值和空白對照從各樣本光譜中減去后，在酰胺I區(qū)(1600-1700cm—"中執(zhí)行對剩余蛋白質(zhì)和賦形劑峰的二階導(dǎo)數(shù)分析。將6mg/mL的PEG-hGH整體用作液體對照。PEG-hGH的酰胺I信號甚至在凍干后仍較之其它蛋白質(zhì)相對較弱。然而，大部分樣本在1651cm—'處都展示出a螺旋的信號，因此，可實現(xiàn)配方候選物之間的定性比較。甘氨酸在酰胺I區(qū)處展示出強(qiáng)信號，因此，所述信號可能在將甘氨酸信號從原始數(shù)據(jù)中減去的過程中已失真。與液體對照進(jìn)行比較的P6MT、S4MT、S5MT、H6MT、P6GT、P6MS、P6MTmet、P7MT和P6MT-P配方的二階FTIR光譜[信號強(qiáng)度(y軸)對波數(shù)(以cm"為單位)(x軸)]表明1)不管緩沖劑或pH值如何，大部分甘露糖醇配方都保持良好的a螺旋信號；2)—種配方，即含有甘氨酸的P6GT展現(xiàn)出頻帶信號的顯著轉(zhuǎn)移；3)在1620、1630、1725和1750處觀察到其它峰。S5GT、P6MA、P7GT、P6MGT、P6MGT-P禾QP6GT-P配方的二階FTIR光譜具有弱a螺旋^號。而且，所有甘氨酸配方都展示出與液體樣本的自然信號的顯著偏差。含有精氨酸的配方在凍干過程中展現(xiàn)出主要的結(jié)構(gòu)改變。在4。C下儲存凍干材料兩個月后，執(zhí)行FT/IR。PEG-hGH的酰胺I信號甚至在凍干后仍較之其它蛋白質(zhì)相對較弱。然而，大部分樣本在1651cm—i處都展示出a螺旋的信號，因此，可實現(xiàn)配方候選物之間的定性比較。甘氨酸在酰胺I區(qū)處展示出強(qiáng)信號。兩個月時，所有甘氨酸配方都展示出與液體樣本的自然信號的顯著偏差。不管緩沖劑或pH值如何，大部分甘露糖醇配方都保持良好的a螺旋信號。實例21攪動(表面活性劑測試)用H7MT-P將20mM檸檬酸鈉、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)中的PEG-hGH稀釋到2mg/mL。將0.01%聚山梨醇酯20(PS)加入一個樣本中，0.01%普流尼克F68(PluronicF68)(F68)加入另一樣本中，且第三個樣本中未加入任何表面活性劑。用500^L填充玻璃瓶執(zhí)行攪動。在室溫下攪動樣本1小時。對樣本的SEC-HPLC分析展示于表104中；經(jīng)攪動的樣本標(biāo)注有"Vtx"。表104:SEC-HPLC(峰面積概要)；攪動及表面活性劑配方ID峰前1+2%主峰％Un-PEG%總面積H7MT-P,t=02.8498.1605.81E+04H7MT,0.01%PS,t=01.4998.5105.59E+04H7MT,0.01%F68,t=01.5898.4205.75E+04H7MT-P,1hrVtx12.5487.4605.79E+04H7MT,0.01%PS,1hrVtx57.2142.7906.13E+04H7MT，0.01%F68,1hrVtx4.4395.5705.58E+04如表104所示，相對于所測試的其它樣本，普流尼克F68對于防止攪動誘發(fā)的聚集最有效。其它實驗可包括透析所述樣本而非將其稀釋以去除殘余賦形劑，和/或測試其它表面活性劑，包括(但不限于)聚山梨醇酯80。表面活性劑可單獨使用或與一種或一種以上其它表面活性劑組合使用。其它研究包括測試以下表面活性劑對H7MT配方中PEG-hGH對抗攪動誘發(fā)的聚集的穩(wěn)定性的影響1)無表面活性劑(陰性對照)；2)各種量(包括但不限于0.01%)的聚山梨醇酯20;3)各種量(包括但不限于，0.005%、0.01%、0.05%和0.1%)的普流尼克F68(或泊洛沙姆188(Poloxamer188));4)各種量(包括但不限于0.01%)的聚山梨醇酯80;禾G5)普流尼克F68與聚山梨醇酯20或普流尼克F68與其它表面活性劑的組合。將制備含有最佳表面活性劑或表面活性劑組合的其它凍干配方(H7MT)，并且將其在4(TC下的穩(wěn)定性與H7MT配方相比較。PEG-hGH的濃度將為2mg/ml，且分析時間點將在O、1、2、3和4周或更長時間時。將使用本文所述的技術(shù)進(jìn)行分析。實例22長期研究額外的長期穩(wěn)定性研究包括評估在各種溫度下儲存后的配方，包括(但不限于)在4。C和29。C下儲存0、3、6、9、12、18和24個月?？稍谟?-8。C儲存各種時間長度(諸如0、l天、3天和1周)的過程中調(diào)査凍干后復(fù)水的樣本的穩(wěn)定性。實例23有關(guān)凍干配方的研究額外數(shù)據(jù)是由實例14中所討論的有關(guān)凍干配方的研究產(chǎn)生。歷時四個月的時間點產(chǎn)生的數(shù)據(jù)包括SDS凝膠(在4"C和25'C下儲存4個月的樣本；圖77-80);復(fù)水后的濃度和pH值(表105-106);對于在4'C和25。C下儲存4個月的樣本的SEC-HPLC分析(表107-108);和對于在4。C和25°。下儲存4個月的樣本的RP-HPLC分析(表109-110)。四個月后，持續(xù)研究含有組氨酸的配方以通過對于所測試的配方的SDS-PAGE展示共價聚集體的最少量。最后兩個月后，H6MT和P7MT在25'C下已展示出最小改變。<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>實例24對于組氨酸與PEG-HGH的相互作用的研究這項研究的目的是調(diào)查當(dāng)加入至少8mg/mL濃度的PEG-HGH時己于10mM組氨酸緩沖劑、4%甘露糖醇、2%海藻糖(pH7.0)中觀察到的pH值降低。本研究還調(diào)査組氨酸配方的濃度依賴性pH值改變是否歸因于組氨酸與PEG-hGH的結(jié)合?？蓪⒂糜跍y定游離/結(jié)合組氨酸的RP-HPLC和/或IEX-HPLC方法用于所述研究中。對于5mg/mL和25mg/mLPEG-hGH的透析將一種或一種以上濃度的PEG-hGH對以下緩沖劑透析10mMNa2HPO4，pH7.1;10mM組氨酸(pH7.0);10mM組氨酸(游離堿)，pH7.7;30mM組氨酸(游離堿)，pH7.7。透析后測量蛋白質(zhì)的pH值。通過執(zhí)行SEC-HPLC并測量在蛋白質(zhì)峰后洗提的組氨酸峰來測定組氨酸的量。比較214nm:280nm以確定組氨酸是否與PEG-hGH結(jié)合。對于lOmM組氨酸(游離堿)(pH7.7)而言，4.5mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為7.18;且14.0mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為6.89。在兩種蛋白質(zhì)濃度下214nm:280nm的比率相同(19.2)。對于30mM組氨酸(游離堿)(pH7.7)而言，13.3mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為7.19。214nm:280nm的比率為19.2。對于10mMHis(pH7.0)而言，4.6mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為6.94;且13.2mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為6.76。在兩種蛋白質(zhì)濃度下214nm:280nm的比率相同(19.1)。對于10mMNa2HP04(pH7.1)而言，4.6mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為7.10;且13.2mg/ml蛋白質(zhì)樣本的pH值為7.09。對于較低蛋白質(zhì)濃度而言，214nm:280nm的比率為19.2，且對于較高蛋白質(zhì)濃度而言為19.1。濃縮期間pH值的改變測量濃縮期間蛋白質(zhì)的pH值改變。測試10mM組氨酸(游離堿)和30mMHis(游離堿)；蛋白質(zhì)濃度以1mg/ml起始。就10mMHis(游離堿)(pH7.7)而言，發(fā)現(xiàn)以下結(jié)果1.0mg/ml蛋白質(zhì)的pH值為7..41;11.7mg/ml蛋白質(zhì)的pH值為6.82;且15.0mg/ml蛋白質(zhì)的pH值為6.71。就30mMHis(游離堿)(pH7.7)而言，發(fā)現(xiàn)以下結(jié)果1.0mg/ml蛋白質(zhì)的pH值為7.58;11.4mg/ml蛋白質(zhì)的pH值為7.22;且17.1mg/ml蛋白質(zhì)的pH值為7.05。加入組氨酸將PEG-hGH濃縮為14mg/ml并對水進(jìn)行透析。通過將小體積濃組氨酸加入蛋白質(zhì)中來增加組氨酸的濃度。測量每次組氨酸增加時的pH值。以下pH測量值是以組氨酸濃度(mM)測定OmM組氨酸下pH值為5.57;0.25mM組氨酸下pH值為5.68;0.5mM組氨酸下pH值為5.74;1mM組氨酸下pH值為5.86;2.5mM組氨酸下pH值為6.13;5mM組氨酸下pH值為6.36;10mM組氨酸下pH值為6.63;且30mM組氨酸下pH值為7.05。在這些研究中，發(fā)現(xiàn)組氨酸不與PEG-hGH結(jié)合。組氨酸的緩沖能力無法克服蛋白質(zhì)的緩沖能力。測試磷酸二氫鹽以測定其是否能夠提供用以維持pH值的足夠緩沖能力。緩沖能力介于約pH5.5與約pH8.0之間的任何緩沖劑(包括但不限于，磷酸二氫鹽)都可適用。具有組氨酸的配方具有較少量的共價聚集體和因攪動而產(chǎn)生的聚集體。在以下檢定中測試磷酸二氫鹽。將PEG-hGH濃縮到14mg/ml并對水進(jìn)行透析。通過將小體積濃磷酸鹽加入蛋白質(zhì)中來增加磷酸鹽的濃度。在每次磷酸鹽增加時測量pH值，且以pH對磷酸鹽濃度(mM)繪制圖表。實例25其它數(shù)據(jù)是由實例19中所討論的經(jīng)加速的聚集研究產(chǎn)生。歷時四周時間點產(chǎn)生的數(shù)據(jù)包括SDS凝膠(在4。C和4CTC下儲存4周的樣本；圖81-82);pH值(表lll);和對于在4'C和40。C下儲存4周的樣本的SEC-HPLC分析(表112-113)。表lll:所測量的pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>為期四周的時間段后，H7MT-P在4'C與40°C下都形成比H7MGT-P少的去PEG化hGH，并且在4(TC下具有少量共價聚集體。總的說來，在40'C下，主要降解產(chǎn)物為去PEG化hGH，且二聚化的量比4'C下有所增加且比4"C下存在更多的共價聚集體。實例26攪動研究(表面活性劑)接下來執(zhí)行實例21中所述的研究。以H7MT透析PEG-hGH，并且以H7MT將所透析的蛋白質(zhì)稀釋到2mg/ml。將各種量的表面活性劑普流尼克F68加入樣本中無普流尼克F68、0.01%普流尼克F68、0.05%普流尼克F68、0.1%普流尼克F68、0.25%普流尼克F68或0.5%普流尼克F68。兩個對照樣本含有具有0.01%普流尼克酸的H7MT緩沖劑而無蛋白質(zhì)。使一個樣本渦旋，而另一個樣本未渦旋(t=0)。用500^1填充玻璃瓶執(zhí)行攪動，且在室溫下攪動樣本2小時。對各種樣本執(zhí)行SEC-HPLC分析，且將結(jié)果展示于表114中。表114:SEC-HPLC<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>在調(diào)查聚集體可逆性的研究中，將0.1%普流尼克F68加入到經(jīng)渦旋的對照(無表面活性劑)樣本中以檢驗是否可通過普流尼克F68解離攪動誘發(fā)的聚集。通過SEC-HPLC分析樣本。這項研究的結(jié)果表明，普流尼克F68可減小攪動誘發(fā)的聚集，但并未將其解離。具有0.1%普流尼克F68的H7MT產(chǎn)生的聚集體的量比具有較少量普流尼克F68的配方產(chǎn)生的聚集體的量少。實例27沉降速度分析'執(zhí)行這一分析以測量以下三種樣本的聚集39.9mg/ml、24.3mg/ml和1.0mg/mlPEG-hGH多肽。將這些儲備液迅速稀釋到0.6mg/ml，隨后以杜貝卡氏經(jīng)磷酸鹽緩沖的生理鹽水(Dulbecco'sphosphatebufferedsaline)(Gibco料號144190-144)進(jìn)行測量。以提供濃度的垂直軸和基于沉降系數(shù)展示分離的水平軸產(chǎn)生這些樣本的高精度沉降系數(shù)分布。使各分布標(biāo)準(zhǔn)化以說明樣本間的濃度差異。39.9mg/mlPEG-hGH在1.27S時具有其主峰，且這一峰占總吸光度的98.7%。24.3mg/mlPEG-hGH在1.29S時具有其主峰，且這一峰占總吸光度的97.5%。還發(fā)現(xiàn)比主峰(單體)沉降快的少量峰。實例28AUC/SEC研究'通過SEC-HPLC、SDS-PAGE和AUC已發(fā)現(xiàn)具有不同濃度PEG化hGH多肽(39.9mg/ml、24.3mg/ml和1.1mg/ml)的樣本和表115中所示的配方展示出類似的聚集量。表116展示由裝載于柱上的20叫材料得到的SEC-HPLC結(jié)果。SDS-PAGE分析(每道裝載10嗎)如圖83所示。1表115<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table>表116<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table>實例29中間體穩(wěn)定性研究表117詳細(xì)描述中間體穩(wěn)定性研究。配方IDH7.3MT為30mM組氨酸、4%甘露糖醇、2%海藻糖，pH7.3。配方IDH7.3MT+F為30mM組氨酸、4%甘露糖醇、2%海藻糖(pH7.3)與0.1%普流尼克F68。配方IDHP7MT為10mM組氨酸、10mM磷酸鹽、4%甘露糖醇、2%海藻糖，pH7.0。配方IDHP7MT+F為10mM組氨酸、10mM磷酸鹽、4%甘露糖醇、2%海藻糖(-pH7.0)與0.1%普流尼克F68。使用三種不同濃度的具有在第35位經(jīng)取代的對乙酰基苯丙氨酸的PEG化WFN:8mg/ml、12mg/ml和16mg/ml。所述研究涉及在t^0、l周、8周和24周時和4。C、25。C和4CTC溫度下進(jìn)行的分析。這項研究中所涉及的方法如先前所述SDS-PAGE(還原性和非還原性)、SEC-HPLC、RP-HPLC、IEX、FTIR、含水量等。生物活性是使用涉及BrdU標(biāo)記的增殖檢定測量。簡單說來，這一檢定是以表達(dá)BAF3細(xì)胞系2E2-2B12-F4的血清饑餓大鼠GHR(L43R)執(zhí)行。以指定的每孔細(xì)胞數(shù)的密度將細(xì)胞涂于96孔培養(yǎng)盤中。用多點劑量范圍的PEG化hGH多肽活化細(xì)胞，且在相同時間時以50uMBrdU(Sigma,St.Louis,MO)進(jìn)行標(biāo)記。培養(yǎng)48小時后，在室溫下以100plBDcytofix/cytoperm溶液(BDBiosciences)固定/滲透細(xì)胞歷時30min。為暴露BrdU表位，在37'C下用每孔30叫DNase(Sigma)處理己固定/滲透的細(xì)胞1小時。以APC接合的抗BrdU抗體(BDBiosciences)進(jìn)行免疫熒光染色使得能夠于FACS陣列上進(jìn)行樣本分析。對于這一方法的改變將為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。表117<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>注射可行性研究以8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml和25mg/mlPEG化hGH多肽(配方IDH7.3MT)測試注射可行性。還以約16mg/ml和25mg/ml分析未接合的PEG(配方IDH7.3MT)以及無多肽或PEG時的緩沖劑對照。使用Instron機(jī)，并且以27號和29號針使用4lbs的力。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知對本文所述的各種技術(shù)條件和/或參數(shù)進(jìn)行修改。可將諸如上文所述的方法或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法的方法用于配方研究中?？梢运鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的檢定執(zhí)行對于樣本的效力研究。適當(dāng)配方包括(但不限于)H7MT-P與普流尼克酸(PluronicAcid);H7MGT-P與普流尼克酸；H7MT-P;H7MGT-P;H6MT-P與普流尼克酸；H6MGT-P與普流尼克酸；H6MT-P;H6MGT-P;HP7MT;HP7MT與普流尼克酸；H7.3MT;H7.3MT與普流尼克酸。適當(dāng)配方可具有在約6到約7.3的pH值范圍。適當(dāng)配方可具有在約5.5到約8的pH值范圍。適當(dāng)配方可包括約5到約30mM組氨酸。適當(dāng)配方可視情況包括多達(dá)約60g/L甘露糖醇。適當(dāng)配方可視情況包括多達(dá)約50g/L海藻糖。適當(dāng)配方可視情況包括多達(dá)約60g/L甘氨酸。應(yīng)了解，本文所述的實例和實施例僅出于說明的目的，并且將建議所屬領(lǐng)域技術(shù)人員據(jù)此進(jìn)行各種修改或改變，且所述修改或改變將包括于本申請案的精神和范圍和隨附權(quán)利要求的范疇內(nèi)。本文所引用的所有公開案、專利和專利申請案都是以其全文引用的方式并入本文中。.表119:所引用的序列<table>complextableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>權(quán)利要求1.一種hGH多肽的醫(yī)藥配方，其包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸，其中所述配方包含a)緩沖劑；b)至少一種載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑；c)和醫(yī)藥學(xué)有效量的人生長激素(hGH)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hGH多肽，其中所述多肽與連接子、聚合物或生物活性分子相連。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的hGH多肽，其中所述多肽與水溶性聚合物相連。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hGH多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方，其中所述緩沖劑包含選自由磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組氨酸、組氨酸衍生物、咪唑、乙酸鹽和碳酸氫鹽組成的群組的組份。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方，其中所述緩沖劑的pH值是介于約pH4.0與約pH8.5之間。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的配方，其中所述緩沖劑的pH值是介于約pH4.0與約pH7.5之間。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的配方，其中所述緩沖劑的pH值是介于約pH6.0與約pH7.5之間。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的配方，其中所述緩沖劑的pH值是介于約pH6.0與約pH7.3之間。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的配方，其中所述緩沖劑的pH值是介于約pH5.5與約pHS.0之間。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約0.1mg與約30mg之間。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約2mg與約30mg之間。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約0.1mg與約8mg之間。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約0.5mg與約8mg之間。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約0.5mg與約6mg之間。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約1mg與約5mg之間。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的配方，其中所述hGH的醫(yī)藥學(xué)有效量是介于約2mg與約25mg之間。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方，其中所述緩沖劑的濃度為約0.1mM到約200mM。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的配方，其中所述緩沖劑的濃度為約1mM到約75mM。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的配方，其中所述緩沖劑的濃度為約1mM到約20mM。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的配方，其中所述緩沖劑的濃度為約5mM到約30mM。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方，其中所述至少一種載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑是選自由抗氧化劑、氨基酸、碳水化合物、螯合劑、糖醇、成鹽反離子和非離子表面活性劑組成的群組。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的配方，其中所述載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑為抗氧化劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的配方，其中所述抗氧化劑為抗壞血酸。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的配方，其中所述載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑為氨基酸。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的配方，其中所述氨基酸是選自由甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、組氨酸衍生物、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸組成的群組。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的配方，其中所述氨基酸為約0.1g/L到約100g/L。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的配方，其中所述氨基酸為約1g/L到約50g/L。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的配方，其中所述氨基酸為約5g/L到約25g/L。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的配方，其中所述氨基酸為約0.1g/L到約60g/L。31.根據(jù)權(quán)利要求22所述的配方，其中所述載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑為碳水化合物。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的配方，其中所述碳水化合物是選自由單醣、二醣和其它碳水化合物組成的群組。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的配方，其中所述碳水化合物是選自由海藻糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖和葡聚糖組成的群組。34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的配方，其中所述碳水化合物為約0.1g/L到約100g/L。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的配方，其中所述碳水化合物為約lg/L到50g/L。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的配方，其中所述碳水化合物為約2g/L到約25g/L。37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的配方，其中所述碳水化合物為約0.1g/L到約50g/L。38.根據(jù)權(quán)利要求22所述的配方，其中所述載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑為糖醇。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的配方，其中所述糖醇為甘露糖醇。40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的配方，其中所述糖醇為約0.1g/L到約100g/L。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的配方，其中所述糖醇為約1g/L到約50g/L。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的配方，其中所述糖醇為約2g/L到約25g/L。43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的配方，其中所述糖醇為約'0.1g/L到約60g/L。44.根據(jù)權(quán)利要求22所述的配方，其中所述載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑為非離子表面活性劑。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的配方，其中所述非離子表面活性劑是選自由聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188(poloxamer188)(普流尼克F68(PluronicF68))組成的群組。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的配方，其中所述非離子表面活性劑為約0.0001%到約跳。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的配方，其中所述非離子表面活性劑為約0.01%到約10%。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的配方，其中所述非離子表面活性劑為約0.1%到約5%。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的配方，其中所述非離子表面活性劑為約0.1%到約1%。50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的配方，其中所述非離子表面活性劑為約0.0001%到約1%。51.根據(jù)權(quán)利要求44所述的配方，其中所述配方包含兩種非離子表面活性劑。52.根據(jù)權(quán)利要求22所述的配方，其中所述載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑為螯合劑。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的配方，其中所述螯合劑為EDTA。54.—種以有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方治療患有由hGH調(diào)節(jié)的病況的患者的方法。55.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方，其中所述緩沖劑包含緩沖能力介于約pH5.5與約pH8.8之間的組份。全文摘要本發(fā)明提供經(jīng)修飾的人生長激素多肽的配方。文檔編號C12Q1/68GK101374536SQ200580044435公開日2009年2月25日申請日期2005年12月21日優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日發(fā)明者安娜-瑪麗亞·A·海斯·普特南,戴維·C·利青格,英·布徹勒申請人:Ambrx公司