專利名稱：通過定量mRNA定制給藥的方法
有關(guān)申請的交叉引用本申請要求以下優(yōu)先權(quán)美國臨時專利申請?zhí)?0/620,603，申請日為2004年10月20日；和美國臨時專利申請?zhí)?0/688,741，申請日為2005年6月8日。
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背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于定制給藥的方法。在該方法中，病人的全血被暴露到藥物。在被暴露到藥物后和僅被暴露到對照載體后，測定白細(xì)胞中與該藥物的效果有關(guān)的標(biāo)記mRNA的水平。通過比較被暴露到藥物后mRNA水平和被暴露到對照載體后的mRNA值，或與被暴露到藥物前測定的值比較，從而有可能確定藥物是否對病人有效。通過篩選針對許多可能藥物治療的病人的血液，有可能建立對所述特定病人的定制的最優(yōu)治療方案。
相關(guān)技術(shù)的描述藥典為醫(yī)生提供了用于大多數(shù)疾病的多種可能的治療劑。然而，每種藥物制劑的效力實(shí)質(zhì)上在病人之間會有所不同。通常，對特定疾病有較低效力的藥劑事實(shí)上可以對患有這種疾病的特定病人是高度有效的。因此，能夠預(yù)先確定哪種藥物或藥物組合最適合每一個病人，和預(yù)先確定什么樣的劑量將有助于發(fā)揮最大效力而不引起副作用，對于醫(yī)生和病人將具有重大意義。作出這些確定的能力通常被稱為“定制醫(yī)學(xué)”，目前還沒有普遍應(yīng)用。
通過測定血液中藥物濃度進(jìn)行治療藥物的監(jiān)測已經(jīng)被嘗試作為接近定制醫(yī)學(xué)的初步手段。然而，計算結(jié)果的值并不總是與藥物在每個病人中的實(shí)際效果相關(guān)。另一種途徑是基于利用有關(guān)藥物毒性相關(guān)基因的藥物遺傳學(xué)或單核苷酸多態(tài)性(SNP)信息進(jìn)行基因分型，以鑒別有關(guān)藥物代謝的基因的變異。然而，這種以發(fā)現(xiàn)適當(dāng)基因上的“熱點(diǎn)”及其特征為目的的研究需要花費(fèi)大量的時間和資源。而且，僅有限的與藥物代謝有關(guān)的基因已經(jīng)被識別出來。此外，已知基因突變導(dǎo)致的功能削弱是否被其它在相同或其它相關(guān)基因中至今未經(jīng)確認(rèn)的突變加重或者改善是不知道的。
選擇適當(dāng)?shù)闹委煼绞皆诎┌Y病例中是尤其迫切需要的，因?yàn)槿绻畛踹x擇了無效的方案，那么這些疾病能夠相當(dāng)迅速地發(fā)展。有許多抗癌藥物可購買獲得。由于藥物的選擇是基于癌細(xì)胞的類型，所以需要進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞學(xué)檢測來充分鑒定個體的癌細(xì)胞。病人間的差異甚至存在于相同的細(xì)胞類型中，然而，一旦病人對某些藥物沒有反應(yīng)，主動治療就會被放棄。如果有可能篩選到一大批體外有效的藥物和它們的組合，那么有效的藥物療法可被確定用于這種病人。
癌細(xì)胞可以從血液中被分離，在體外，在存在或不存在適當(dāng)?shù)目拱┧幬锏呐囵B(yǎng)基中被維持。這種伴隨高強(qiáng)度操作步驟的試驗(yàn)需花費(fèi)2～3天，然而，這些人工培養(yǎng)條件經(jīng)常沒有反映出體內(nèi)的藥物敏感性。根據(jù)這些原理的試驗(yàn)因此不適用于作為常規(guī)的臨床檢測。
許多抗癌藥物通過誘導(dǎo)病態(tài)細(xì)胞停止進(jìn)入細(xì)胞周期或進(jìn)入凋亡而發(fā)揮功能。已知與細(xì)胞周期停滯相關(guān)的一個基因是p21。此外，已知一些促進(jìn)凋亡(pro-apoptotic)的mRNA在細(xì)胞發(fā)生凋亡時被誘導(dǎo)。其中，包括所謂的Bcl-2/Bax家族基因，其由Bax、Bak、Bok和Bcl-XS組成。其中，截短形式的Bax，如所謂的僅BH3(BH3-only)Bcl-2家族成員，也是已知的促進(jìn)凋亡的mRNA，這組包括Bid、Bad、Bik、Bim、NOXA和PUMA(p53凋亡的上調(diào)調(diào)節(jié)子)。這些基因共有一個相似的結(jié)構(gòu)基元，該結(jié)構(gòu)基元結(jié)合線粒體膜，通過控制細(xì)胞色素C的釋放來調(diào)節(jié)凋亡。雖然許多促進(jìn)凋亡的基因已經(jīng)被鑒定，但我們并不知道是否所有的基因?qū)τ诘蛲龅陌l(fā)生同樣重要?；诮M織或者細(xì)胞的類型，或者基于刺激的類型或程度，特定基因可以被顯著地表達(dá)出來。做為選擇，相關(guān)的基因在個體中可以變化。凋亡在癌癥和炎癥的病程中起著決定性的作用，如果主要的和普遍的促進(jìn)凋亡的mRNA或者一套這種mRNA被鑒定出來，那么它們將非常適合于用作癌癥和炎癥公共的藥物靶。而且，它們也可用作通用的凋亡相關(guān)疾病的診斷工具。
此外，當(dāng)化療藥物被應(yīng)用于抗實(shí)體腫瘤時，一個主要潛在的副作用是對白細(xì)胞的抑制。在嚴(yán)重的情況下，這種作用可以是致命的。然而，不幸的是，不能做到預(yù)知哪個病人將經(jīng)歷白細(xì)胞抑制，也不能預(yù)知治療期間什么時候可能發(fā)生這種作用。因此，對藥物反應(yīng)的個體模式的識別不僅對診斷目的有用，而且通過減少藥物-相關(guān)死亡的可能性利于改善臨床試驗(yàn)的結(jié)果和避免有害的公知狀況。在這些領(lǐng)域的改善對于制藥工業(yè)將很有價值。
因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗癌藥物是經(jīng)靜脈內(nèi)使用，每種藥物的血液水平已經(jīng)很好地被鑒定，所以另一種途徑是利用藥物的已知效果，通過細(xì)胞基礎(chǔ)的功能性試驗(yàn)來評估離體的白細(xì)胞毒性。例如，已知博來霉素(BLM)在人淋巴細(xì)胞中經(jīng)由DNA和染色體斷裂誘導(dǎo)凋亡。依托泊苷(Etoposide，VP-16)，一種有效的局部異構(gòu)酶II抑制劑，引起人淋巴細(xì)胞中DNA鏈斷裂和凋亡。雖然細(xì)胞基礎(chǔ)的功能性試驗(yàn)在研究中廣泛使用，但由于這種工作的復(fù)雜性，其中包括大的偏差和目前的定量困難，使得它們在鑒定個體藥物的應(yīng)答器和非應(yīng)答器中的應(yīng)用不能在臨床實(shí)踐中被廣泛接受。
在病人的器官和骨髓移植中也有定制藥物的需要，因?yàn)檫@些病人必須終身服用免疫抑制劑。由于環(huán)孢霉素A(“CsA”)和藤霉素(“FK”)已經(jīng)示范了在處理這些病人方面的良好記錄，所以這些藥物現(xiàn)在被用于許多其它的疾病，例如干癬、炎癥性腸病和腎綜合癥。然而，這些藥物的效力在個體病人之中有所不同，有的病人顯示出對這兩種藥物中的一種更好的反應(yīng)性。因?yàn)檫@些藥物的初步作用是抑制白細(xì)胞介素-2(IL-2)mRNA的轉(zhuǎn)錄，所以定量淋巴細(xì)胞中IL-2的水平是合理的。可是這些已經(jīng)被使用的方法并不適合用于常規(guī)臨床檢測，這主要是因?yàn)椴僮鱩RNA的難度。大規(guī)模地分析變化也不宜用于確定病人到病人的變化。
發(fā)明概要本發(fā)明公開了一種為個體病人定制藥物方案的方法，該方法是基于用候選藥物刺激病人的全血后所測定的白細(xì)胞中的標(biāo)記mRNA的水平。
發(fā)明的一個方面包括衡量病人對藥物的反應(yīng)性的方法，包括使病人的全血暴露到藥物7個小時或者更少；暴露后，測定血液細(xì)胞中與該藥物的效果相關(guān)的mRNA的數(shù)量；和根據(jù)測定的結(jié)果確定病人對該藥物的反應(yīng)性，其中mRNA數(shù)量的改變表明對該藥物的病人的反應(yīng)性。
在所述方法的一個優(yōu)選方案中，存在于血細(xì)胞中的mRNA的數(shù)量在暴露到藥物前被測定，mRNA數(shù)量的變化通過比較暴露前測定的mRNA的量與暴露后測定的mRNA的量來確定。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，使病人的全血與一對照載體暴露7個小時或者更少；暴露后，暴露到該對照載體的血細(xì)胞中的與該藥物效果相關(guān)的mRNA的數(shù)量被測定，對該藥物的反應(yīng)性至少部分地通過比較暴露到對照載體后獲得的測定結(jié)果暴露到該藥物后獲得的測定結(jié)果確定。對照載體優(yōu)選自由磷酸緩沖鹽溶液和二甲亞砜組成的組。
在所述方法的一個優(yōu)選方案中，使病人的全血暴露包括加入肝素。
在所述方法的一個優(yōu)選方案中，全血被刺激5個小時或者更少。更優(yōu)選，全血被刺激2～4個小時或者更少。
在所述方法的一個優(yōu)選方案中，所述藥物的效果是血細(xì)胞的凋亡。
在所述方法的一個優(yōu)選方案中，mRNA選自由編碼Bcl-2/Bax基因家族的基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。更優(yōu)選地，mRNA編碼Bax基因產(chǎn)物。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，mRNA選自由編碼僅BH3 Bcl-2基因家族的基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。更優(yōu)選地，mRNA選自由編碼PUMA和NOXA基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。
在所述方法的一個優(yōu)選方案中，所述藥物的效果是血細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯，所述mRNA編碼p21基因產(chǎn)物。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，血液細(xì)胞中與藥物的第二種效果相關(guān)的第二種mRNA的數(shù)量也被測定，所述藥物的第一種效果是血細(xì)胞的凋亡，第一種mRNA編碼FUMA基因產(chǎn)物；所述藥物的第二種效果是血液中細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，第二種mRNA編碼p21基因產(chǎn)物。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，所述藥物選自包含依托泊苷(etoposide)、阿得里亞霉素(doxorubicin)、氟達(dá)拉賓(fludarabine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、利妥昔單抗(rituximab)、長春地辛(vindesine)、吡柔比星(pirarubicin)、卡鉑(carboplatin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、博來霉素(bleomycin)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、培來霉素(peplomycin)、阿克拉霉素(aclarubicin)、紅必霉素(daunorubicin)、阿得里亞霉素(doxorubicin)、順氯氨鉑(cisplatin)、氨甲喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、氮烯唑胺(dacarbazine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和紫杉醇(paclitaxel)的組。在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，所述病人患有白血病或者白血病淋巴瘤。
在所述方法的另一個個優(yōu)選方案中，使病人的全血暴露時包括用植物凝血素刺激。更優(yōu)選地，所述植物凝血素選自由植物血細(xì)胞凝集素-P和商陸絲裂素(tacrolimus)組成的組。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，所述藥物的效果是IL-2轉(zhuǎn)錄的抑制，mRNA編碼IL-2基因產(chǎn)物。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，所述藥物是一免疫抑制劑。更優(yōu)選地，所述藥物選自由環(huán)孢霉素(cyclosporine)A和藤霉素(tacrolimus)組成的組。
在所述方法的另一個優(yōu)選方案中，mRNA選自由編碼來自ATP結(jié)合盒的亞家族A、B、C、D、E、F和G的基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。
本發(fā)明的另一個方面包括一種測定病人對藥物的反應(yīng)性的方法，其中所述藥物選自由以下藥物組成的組依托泊苷、阿得里亞霉素、氟達(dá)拉賓、米托蒽醌、利妥昔單抗、長春地辛、吡柔比星、卡鉑、環(huán)磷酰胺、博來霉素、長春花堿、長春新堿、培來霉素、阿克拉霉素、紅必霉素、阿得里亞霉素、順氯氨鉑、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氮烯唑胺、環(huán)磷酰胺和紫杉醇，所述方法包括使病人的全血暴露到所述藥物4個小時和更少；使該病人的全血暴露到對照載體4個小時或者更少；在所述暴露之后，測定血液細(xì)胞中一種mRNA的量，所述mRNA選自由編碼p21、BAX和PUMA基因產(chǎn)物的mRNA組成的組；比較暴露到所述對照載體后獲得的測定結(jié)果與暴露到所述藥物后獲得的測定結(jié)果；基于比較的結(jié)果確定對藥物的反應(yīng)性，其中mRNA數(shù)量的變化表明該病人對所述藥物的反應(yīng)性。
本發(fā)明的另一個方面包括衡量病人對藥物的反應(yīng)性的方法，所述藥物選自由環(huán)孢霉素A和藤霉素組成的組，包括使病人的全血暴露到所述藥物和植物凝血素4個小時或者更少；使病人的全血暴露到對照載體和植物凝血素4個小時或者更少；暴露后，測定血液細(xì)胞中編碼IL-2基因產(chǎn)物的mRNA的數(shù)量；比較暴露到對照載體后獲得的測定結(jié)果與暴露到藥物后獲得的測定結(jié)果；根據(jù)比較的結(jié)果確定對所述藥物的反應(yīng)性，其中所述mRNA數(shù)量的改變表明該病人對所述藥物的反應(yīng)性。
附圖的簡要說明

圖1是顯示了藥物誘導(dǎo)的p21 mRNA在人血液(空圈)和培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞中的表達(dá)的圖。
圖2是顯示依托泊苷誘導(dǎo)的來自混入50μL健康成人血液中的U937細(xì)胞的p21mRNA的表達(dá)的圖。
圖3包括顯示藥物誘導(dǎo)的p21(上面的)和BAX(下面的)mRNA在白血病淋巴瘤(左，中)和健康成人(右)中的表達(dá)的柱狀圖。
圖4顯示了來自圖3的病人2的臨床過程。
圖5顯示了在凋亡期間的早期基因表達(dá)。
圖6顯示了篩選多種促進(jìn)凋亡的mRNA的結(jié)果。
圖7顯示了劑量反應(yīng)的評定結(jié)果。
圖8顯示了在白血病和淋巴瘤病人中，藥物誘導(dǎo)的基因表達(dá)的評定結(jié)果。
圖9顯示了VP-16誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因在人全血中的表達(dá)。
圖10顯示了BLM誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因在人全血中的表達(dá)。
圖11顯示了p21與PUMA引起的反應(yīng)、VP-16與BLM引起的反應(yīng)的比較。
圖12顯示了mRNA水平測定的每日變化。
圖13顯示了taxol誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因在人全血中的表達(dá)。
圖14顯示了藥物誘導(dǎo)的BAX、p21和PUMA的表達(dá)之間的比較。
圖15顯示了在健康的供體和血癌病人中BLM誘導(dǎo)的p21 mRNA的表達(dá)。
圖16顯示了癌癥病人的全血中，p21和Bax mRNA經(jīng)由大量抗癌藥的激活的測定結(jié)果。
圖17顯示了癌癥病人的全血中，p21、BAX和PUMA mRNA經(jīng)由大量抗癌藥的激活的測定結(jié)果。
圖18是顯示PHA-P誘導(dǎo)的白細(xì)胞IL-2 mRNA在肝素化全血中被誘導(dǎo)的圖。
圖19顯示了PHA-P誘導(dǎo)的白細(xì)胞IL-2 mRNA在肝素化全血中的表達(dá)的動力學(xué)。
圖20顯示了CsA抗PHA-P誘導(dǎo)的白細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)的劑量依賴性效果。
圖21顯示了CsA抗PHA-P誘導(dǎo)的白細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)的效果。
圖22顯示了在健康供體血液中，對100和500ng/mLCsA作用于PHA-P誘導(dǎo)的IL-2 mRNA的表達(dá)的反應(yīng)。
圖23顯示了接受了CsA或者FK的健康成人和病人之間比較的結(jié)果。
圖24A顯示了CsA的血液水平(X軸)和IL-2 mRNA的值/基準(zhǔn)的白細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系。
圖24B顯示了CsA的血液水平(X軸)和后PHA-A的刺激(右)之間的關(guān)系。
圖25A顯示了FK的血液水平(X軸)和基準(zhǔn)IL-2 mRNA的值/白細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系。
圖25B顯示了FK的血液水平(X軸)和基準(zhǔn)IL-2 mRNA的值/PHA-A刺激后白細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系。
優(yōu)選方案的詳細(xì)描述方案1p21/BAX在定制給藥治療白血病和淋巴瘤中的應(yīng)用在本方法中，由醫(yī)藥制劑的作用引起的白細(xì)胞細(xì)胞死亡與p21和BaxmRNA的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。在這兩個標(biāo)記mRNA中，p21引起細(xì)胞周期停滯，BAX則作為凋亡的啟動信號。如果一種藥物誘導(dǎo)了癌細(xì)胞中的p21，這表明這種藥物顯示出了癌細(xì)胞抑制活性，而對BAX的誘導(dǎo)則意味著這種藥物具有殺細(xì)胞活性。雖然在凋亡的過程中涉及許多基因，但這兩種早期基因標(biāo)記的表達(dá)表明了藥物的細(xì)胞毒性活性。
血液從健康成人和兩個白血病的非霍奇金惡性淋巴瘤病人中獲得。U937、KG-1和Jurkat細(xì)胞獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC，馬納薩斯，VA)，在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。其中，U937細(xì)胞是一種人組織細(xì)胞的淋巴瘤細(xì)胞系，KG-1是一種人骨髓粒細(xì)胞性白細(xì)胞血病細(xì)胞系，Jurkat細(xì)胞是一種人T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞樣、白血病來源的細(xì)胞系。細(xì)胞被懸浮在無血清培養(yǎng)液中，在37℃下暴露到依托泊苷(Sigma，St.Louis，MO)2個小時后對p21進(jìn)行測定。用于人體實(shí)驗(yàn)的血液部分在37℃由多種抗癌癥藥物刺激2個小時，然后對p21和Bax mRNA進(jìn)行測定。用于這些研究的抗癌藥物是臨床藥物，在靜脈內(nèi)給藥后3-6個小時，每種藥物的濃度調(diào)節(jié)到典型的血液水平。所使用的藥物是阿得里亞霉素(阿霉素，Kyowa Hakko)、Fludara(氟達(dá)拉賓，Schering)、Novantron(米托蒽醌，Wyeth)、Vepesid(VP-16，依托泊苷，Bristol-Myers Squibb)、Randa(順氯氨鉑，Nihon Kayaku)，Rituxan(利妥昔單抗，抗CD20的單克隆抗體，Chugai)，F(xiàn)ildesin(長春地辛，Shionogi)，Therarubicin(吡柔比星，Meiji Seika)，Paraplatin(卡鉑，Bristol)和Endoxan(環(huán)磷酰胺，Shionogi)。
從全血中制備mRNA和cDNA。簡言之，將國內(nèi)制造的96孔過濾板置于收集盤中，加入150μl5mM Tris，pH7.4。以120xg在4℃離心1分鐘后，將50μl的血樣加入每個孔中，立即以120xg在4℃離心2分鐘，接著用300μlPBS清洗每個孔一次，以2000xg在4℃離心5分鐘。然后，將60μl預(yù)備的裂解緩沖液加入過濾板中并于37℃孵育10分鐘，所述的裂解液含有例如0.5％N-十二烷基肌氨鈉，4XSSC，10mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA，0.1％IGEPALCA-630和1.791M硫氰酸胍，并進(jìn)一步添加了1％2-巰基乙醇(BioRad，Hercules，CA，USA)，0.5mg/ml蛋白酶K(Pierce Rockford IL USA)，0.1mg/ml鮭精DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkmann，Westbury，NY，USA)，0.1mg/ml大腸桿菌tRNA(Sigma)，10mM在表1中列出的每一種特異性反向引物的混合液和標(biāo)準(zhǔn)RNA34寡聚核苷酸。之后，過濾板被置于寡聚(dT)-固定的微孔板(GenePlate，RNAture)中，在4℃以2000xg離心5分鐘。4℃保存過夜后，在4℃用100μl普通裂解液清洗微孔板三次，再用150μl的清洗緩沖液(0.5MNaCl，10mM Tris，pH7.4，1mM EDTA)清洗三次。通過在每個孔中加入30μl含有IxRT-緩沖液、1.25mM每一種dNTP、4單位的rRNasin和80單位的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)的緩沖液(無引物)，在37℃孵育2個小時，cDNA被直接合成。特異性引物引發(fā)的cDNA存在于溶液中，寡聚(dT)-引發(fā)的cDNA被保留固定在微孔板中。對于TaqManPCR(圖1、3、4)，生成的4μlcDNA溶液被直接轉(zhuǎn)移到384孔PCR板中，所述板中加入了5μl的TaqMan通用樣品混合物(ABI)和1μl的寡聚核苷酸混合液(15μM每一種正向和反向引物和3-6μM TaqMan探針)，PCR在PRISM7900HT(ABI)中進(jìn)行，一個周期包括95℃10分鐘，接著95℃30秒、55℃30秒和60℃1分鐘共45個循環(huán)。對于SYBR Green PCR(見圖6)，cDNA在水中被稀釋3-4倍，4μl的cDNA溶液被直接轉(zhuǎn)移到384孔PCR板中，所述PCR板中加入了5μ1樣品混合物(BioRad，Hercules，CA)和1μl寡聚核苷酸混合液(15μM每一種正向和反向引物)，PCR在PRISM 7900HT(ABI)中進(jìn)行，95℃10分鐘一個循環(huán)后，接著95℃30秒和60℃1分鐘共45個循環(huán)。每種基因被加入獨(dú)立的孔中。通過分析軟件(SDS，ABI)確定Ct。
為了確定依托泊苷用于誘導(dǎo)血液和培養(yǎng)細(xì)胞中p21mRNA的適宜濃度，將來自健康成人的血樣在37℃經(jīng)由多種濃度的這種藥物刺激2個小時，然后測定p21 mRNA的水平。如圖1所示，在10μM依托泊苷時沒有在健康的白細(xì)胞中檢測到顯著的p21mRNA表達(dá)，盡管p21在100μM依托泊苷時顯著地表達(dá)。相反，當(dāng)U937細(xì)胞暴露到10μM依托泊苷時，從U937細(xì)胞中檢測到了細(xì)微但顯著的p21表達(dá)(圖1，空圈，箭頭標(biāo)記)。KG-1細(xì)胞的藥物敏感性(圖1，閉合三角形)類似于人血液中的那些，即使當(dāng)100μM依托泊苷使用時Jurkat細(xì)胞也有抗性(圖1，閉合的鉆石形)。這些結(jié)果表明p21mRNA的表達(dá)是一種用于藥物細(xì)胞毒性的有用標(biāo)記，以及10μM依托泊苷是用于選擇易感癌細(xì)胞的一種方法。
圖1中顯示的結(jié)果表明10μM依托泊苷是用于區(qū)別健康血液和U937之間的一個邊界值。為了使用培養(yǎng)細(xì)胞模擬白血病，不同數(shù)量的U937與血液混合并暴露到10μM依托泊苷。結(jié)果在圖2中顯示。為了避免血液-U937的交互作用，將分開的管中的血液和細(xì)胞暴露到依托泊苷，并被加入到相同過濾板的孔中。為了確定U937中天然p21 mRNA的表達(dá)，相同數(shù)量的未經(jīng)處理的U937被加入到血樣中作為對照。在圖中，空正方形表明DMSO處理的U937細(xì)胞，實(shí)菱形表明10μM依托泊苷處理的U937細(xì)胞。如圖2所示，當(dāng)1,250U937細(xì)胞中加入了1μL血液時鑒定到顯著的(p＝0.04)p21 mRNA表達(dá)(箭頭)。這些結(jié)果表明當(dāng)癌細(xì)胞群體只有20％(每1μL血液每5,000個正常白細(xì)胞1,250個癌細(xì)胞)少時，癌細(xì)胞的藥物敏感性可以在全血中鑒定。
產(chǎn)生圖1-2所示結(jié)果的培養(yǎng)的細(xì)胞條件是人為的，未必反映了體內(nèi)的藥效。源于培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果可能難以解釋。相反，來自全血的數(shù)據(jù)產(chǎn)生自非常接近于生理情況的條件，這種數(shù)據(jù)是容易解釋的。
圖3顯示了在適應(yīng)大量藥物的兩位白血病淋巴瘤病人和1位健康成人中，由藥物誘導(dǎo)的p21和Bax mRNA表達(dá)的結(jié)果。在該圖中，Adr表示阿霉素(400nM)，F(xiàn)ur表示Fludara(0.2μg/ml)，Nov表示Novantron(10ng/ml)，Vep表示Vepesid(5μg/ml)，Ran表示Randa(順氯氨鉑)(1μg/ml)，Rit表示Rituxan(200μg/ml)，F(xiàn)id表示Fildesin(10ng/ml)，Ter表示Therarubicin(50ng/ml)，Par表示Paraplatin(5μg/ml)和End表示Endoxan(1μg/ml)。它們的濃度根據(jù)靜脈注射后1-4小時后的血液水平來確定。黑色的長條表示p＜0.001，而淺灰色的長條表示p＜0.05。
當(dāng)血液用Therarubicin和Paraplatin刺激時，雖然所有的藥物均未能誘導(dǎo)健康成人中的p21和Bax mRNA，但病人1顯示出對p21和Bax mRNA顯著的誘導(dǎo)。Endoxan也誘導(dǎo)p21 mRNA。病人2顯示出由Adriacin和Fludara引起的顯著的p21 mRNA誘導(dǎo)，以及由Novantron引起的Bax mRNA誘導(dǎo)。在病人2中，Vepsid誘導(dǎo)了p21和Bax mRNA。雖然對全血進(jìn)行了測定，但由于兩個病人中不正常的淋巴細(xì)胞群超過了80％，故這些結(jié)果來自于有害的細(xì)胞。圖3中顯示的結(jié)果表明1)所述方法對于確定全血中癌癥細(xì)胞來源的基因表達(dá)是足夠靈敏的，和2)藥物反應(yīng)性變化很大，即使這些病人中的癌細(xì)胞是來源于B細(xì)胞。
圖4顯示了病人2的進(jìn)一步的臨床過程，該病人未能對CHOP化療(環(huán)磷酰胺(Endoxan)，阿得里亞霉素(Adriacin)，長春花新堿和潑尼松龍(predonisolone))和隨后的脾放射作出反應(yīng)，并顯示出連續(xù)的血小板減少。然而如圖所示，當(dāng)給予了Vepesid(VP-16，依托泊苷)時，血小板計數(shù)實(shí)質(zhì)上增加了。由于粒細(xì)胞群刺激因子(G-CSF)沒有抗血小板的功能，故血小板減少的改善可歸于依托泊苷的作用。因?yàn)橐劳胁窜帐俏ㄒ徽T導(dǎo)病人2中p21和Bax mRNA兩者的唯一藥物，這些臨床結(jié)果表明對全血中藥物誘導(dǎo)的p21和Bax mRNA表達(dá)的測定可用于對每個病人的敏感藥物的鑒定。
在所有情況下，敏感藥物通過檢測全血中藥物誘導(dǎo)的p21和Bax mRNA的表達(dá)來確定。因?yàn)檫@種試驗(yàn)偏差非常小及初始原料是一式三份的等分全血，故結(jié)果在統(tǒng)計上有顯著意義。有趣的是，雖然這兩個病人患的均是B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤，但敏感藥物的清單在這兩個病人之間是不同的。如果沒有mRNA檢測就不能完成對這些藥物的選擇。因此，這種檢測是定制醫(yī)學(xué)的有效手段。
與實(shí)體腫瘤不同，血癌細(xì)胞存在于血液中。因此，當(dāng)根據(jù)p21和Bax mRNA的誘導(dǎo)(圖3，右面的圖表)，確定了每一種藥物在全血中最大的耐受藥物濃度，那么癌細(xì)胞的藥物敏感性就可以通過將候選藥物簡單混入全血鑒定出來(圖3，左面和中間的圖表)。而且，孵育藥物單獨(dú)2小時是有必要的，這樣可以去除潛在的副效應(yīng)。雖然在p21和BAX表達(dá)后，下游的凋亡級聯(lián)可能被阻斷，但那些誘導(dǎo)p21和BAX表達(dá)的藥物很可能比那些未能誘導(dǎo)這些基因的mRNA的藥物更有效。在這個方案中的第二個病人對鑒定出的藥物作出反應(yīng)的事實(shí)(圖4)表明本方法對于將來用于癌癥化療的定制醫(yī)學(xué)是有用的。
方案2p22和PUMA mRNA在定制給予白血病和淋巴瘤藥物中的應(yīng)用PUMA或Bcl-2結(jié)合成分3(bbc3)是由三個獨(dú)立的小組在2001年幾乎相同的時間發(fā)現(xiàn)的，在GenBank中給出的登錄號分別為HSU82987、AF332558和AF354656。根據(jù)GenBank的信息，這些序列是在1996年12月、2000年12月和2001年3月分別提交的，最早的記錄UniGene(Hs.467020)使用了bb3作為該基因的名稱。許多出版物使用PUMA(p53調(diào)節(jié)的凋亡的調(diào)節(jié)子)而不是bbc3。它在各種細(xì)胞中不是普遍表達(dá)的，根據(jù)UniGene(Hs.467020)的表達(dá)圖譜可以看出，它在血液、子宮頸、結(jié)腸、眼睛、腎喉、肺、乳腺、卵巢皮膚、小腸、胃和睪丸中表達(dá)。也有報道PUMA是鼠中藥物誘導(dǎo)的凋亡的一個主要調(diào)節(jié)子。雖然PUMA在每個實(shí)驗(yàn)體系中被廣泛地表征，但PUMA與人血液白細(xì)胞中的促進(jìn)凋亡的其它mRNA之間的聯(lián)系還沒有建立起來。血液是特別重要的，因?yàn)閷ρ褐性缙诘蛲鲂盘柕臋z測被認(rèn)為能促進(jìn)新的診斷進(jìn)展，用于對每個血液病病人有效的抗癌藥物的鑒定(見圖8)。而且，任何實(shí)體腫瘤的抗癌藥物導(dǎo)致一些對白細(xì)胞的副作用，這種作用有時是致命的。因此，個體藥物的毒性可以通過體外孵育血液和靶藥物進(jìn)行預(yù)測。對某些藥物的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的鑒定被認(rèn)為有助于藥物開發(fā)的過程。
藥物敏感試驗(yàn)通常使用分離的單核白細(xì)胞進(jìn)行，其中單核白細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)基中并被置于二氧化碳恒溫箱中孵育幾天，以證實(shí)發(fā)生了細(xì)胞死亡或者凋亡或確立了等效物生物學(xué)指標(biāo)。由于這些條件與天然條件懸殊，所以難以解釋獲得的結(jié)果。這是為什么藥物敏感性試驗(yàn)在臨床實(shí)踐中不普遍的一個主要的原因，盡管對合適藥物的鑒定對于病人的生活質(zhì)量是必不可少的。本方法避免了這個問題，其是通過使用全血和短的2-4小時的孵育本方法可以對僅僅50μl的人全血中任一產(chǎn)生的mRNA的絕對數(shù)量靈敏地測定。由于高通量平臺容許使用一式三份的全血樣品，故通過合理的統(tǒng)計分析得出的結(jié)果是可靠的?；蚍中褪悄壳坝糜谒幬锩舾行栽囼?yàn)的新趨勢，然而，由于不知道其它基因中的遺傳多態(tài)性或者突變是否能夠抵償?shù)谝粋€突變的異常，故它難以基于某一基因的一個或多個位點(diǎn)上的遺傳多態(tài)性或者突變得出結(jié)論。本方法提供了一種使用遺傳學(xué)作為工具的表型測試，從而避免這些問題。
通過該體系對顯著的藥物誘導(dǎo)的p21和/或PUMA mRNA的誘導(dǎo)檢測出來，陽性結(jié)果表明藥物對生理學(xué)體外條件下早期的凋亡級聯(lián)至少是有作用的。相比于顯示陰性結(jié)果的那些，在這些測試中顯示出陽性結(jié)果的藥物很可能是用于治療的好的候選藥物。每個血樣中凋亡的最后確立可以通過一個較短孵育期的試驗(yàn)證實(shí)，以便更可靠地重現(xiàn)生理?xiàng)l件。p21對于細(xì)胞周期停滯作出響應(yīng)，PUMA是促進(jìn)凋亡的，對這些基因的分析與藥物的癌細(xì)胞抑制和殺細(xì)胞的效果相符。
以下方法被應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
血樣采自健康成人志愿者和患病的病人。各種Bax相關(guān)基因以及被報道的在凋亡期間被誘導(dǎo)的基因通過文獻(xiàn)檢索確定，相應(yīng)的PCR引物和TaqMan探針由PrimerExpress(AppliedBiosystem，F(xiàn)osterCity，CA)和HYBsimulator(RNAture，Irvine，CA)設(shè)計。寡聚核苷酸通過IDT(Coralville，IA)合成。GenBank登錄號和引物序列列于下表1中。
表1基因引物序列
在8孔條狀微管中加入1.4μl的50濃度的藥物或者控制液(磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或者DMSO)，使用前一直保存于-20℃。
使用的化學(xué)制品是長春花堿(VLB)，長春新堿(VCL)，米托蒽醌(MIT)，阿克拉霉素(ACR)，博來霉素(BLM)，紅必霉素(DNR)，阿得里亞霉素(DXR)，依托泊苷(VP-16)，卡鉑(CBDCA)，順氯氨鉑(CDDP)，氟達(dá)拉賓(FDB)，氨甲喋呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(Ara-C)，氮烯唑胺(DTIC)，環(huán)磷酰胺(CPA)(Sigma，StLouis，MO)，吡柔比星(THP)和培來霉素(PEP)(WakoPureChemicals，Osaka，Japan)。70μl的新鮮肝素化全血以一式三份加入每個孔，閉合蓋子于37℃孵育2-8小時。使用銫-137以指定的劑量刺激血液用于輻射處理，。在每個處理后，50μl的全血被轉(zhuǎn)移到如下所述的過濾板中。mRNA和cDNA從全血中制備?？傊?，自制的96孔過濾板被置于收集盤中，其中加入了150μl的5mM Tris，pH7.4。在4℃以120xg離心1分鐘后，將50μl的血樣加入到每個孔中并立即在4℃以120xg離心兩分鐘，接著用300μ1PBS清洗每個孔一次，在4℃以2000xg離心5分鐘。然后，將60μl預(yù)備的裂解緩沖液加到過濾板中并于37℃孵育10分鐘，所述的裂解液含有例如0.5％N-十二烷基肌氨鈉，4XSSC，10mM TrisHCl，pH7.4，1mM EDTA，0.1％IGEPALCA-630和1.791M硫氰酸胍，并進(jìn)一步添加了1％2-巰基乙醇(BioRad，Hercules，CA，USA)，0.5mg/ml蛋白酶K(PierceRockfordILUSA)，0.1mg/ml鮭精DNA(5PrimeEppendorf/Brinkmann，Westbury，NY，USA)，0.1mg/ml大腸桿菌tRNA(Sigma)，10mM在表1中列出的每一種特異性反向引物的混合液和標(biāo)準(zhǔn)RNA34寡聚核苷酸。之后，將過濾板置于寡聚(dT)-固定的微孔板(GenePlate，RNAture)中，在4℃以2000xg離心5分鐘。4℃過夜保存后，在4℃用100μl普通裂解液清洗微孔板三次，再用150μl的清洗緩沖液(0.5MNaCl，10mM Tris，pH7.4，1mM EDTA)清洗三次。通過在每個孔中加入含有IxRT緩沖液、1.25mM每一種dNTP、4單位的rRNasin和80單位的MM LV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)的30μl緩沖液(無引物)并在37℃孵育2小時，cDNA被直接合成。特異性引物引發(fā)的cDNA存在于溶液中，寡聚(dT)引發(fā)的cDNA被保留固定在微孔板中。對于TaqManPCR(圖1、3、4)，生成的4μlcDNA溶液被直接轉(zhuǎn)移到384孔PCR板中，所述板中加入了5μl的TaqMan通用樣品混合物(ABI)和1μl的寡聚核苷酸混合液(15μM每一種正向和反向引物和3-6μMTaqMan探針)，PCR在PRISM7900HT(ABI)中進(jìn)行，一個周期包括95℃10分鐘，接著95℃30秒、55℃30秒和60℃1分鐘共45個循環(huán)。對于SYBR Green PCR(見圖6)，cDNA在水中被稀釋3-4倍，4μl的cDNA溶液被直接轉(zhuǎn)移到384孔PCR板中，所述PCR板中加入了5μl樣品混合物(BioRad，Hercules，CA)和1μl寡聚核苷酸混合液(15μM每一種正向和反向引物)，PCR在PRISM7900HT(ABI)中進(jìn)行，95℃10分鐘一個循環(huán)后，接著95℃30秒和60℃1分鐘共45個循環(huán)。每種基因被加入獨(dú)立的孔中。Ct通過分析軟件(SDS，ABI)確定。雖然1xRT緩沖液被作為陰性對照，但沒有引物對在這些實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生非特異性的引物二聚物。對于圖8中的PUMA，固定在寡聚(dT)固定的微孔板上的cDNA在icycler(BioRad)上被直接擴(kuò)增。
使用商業(yè)試劑盒(Puregene，Gentra，Minneapolis，MN)，從有或沒有進(jìn)行治療的300μl每種全血中純化出基因組DNA。然后通過3.5％瓊脂糖(3∶1NuSieve∶agarose，F(xiàn)MC，Rockland，ME)的凝膠電泳分析DNA，用0.5μg/ml溴化乙錠染色，并由Alphalmager(AlphaInnotech，SanLeandroCA)記錄拍攝的圖像。
為了引起凋亡，肝素化人全血分別用30Gy的電離輻射、20μM博來霉素(BLM)或者100μM依托泊苷(VP-16)刺激。15-25Gy的放射療法在臨床上用于殺死受體白細(xì)胞以預(yù)防輸血過程中的移植物抗宿主病。已知博來霉素誘導(dǎo)經(jīng)由DNA和染色體斷裂的人淋巴細(xì)胞的凋亡。依托泊苷(Etoposide，VP-16)，一種有效的局部異構(gòu)酶II抑制劑，引起人淋巴細(xì)胞中DNA鏈斷裂和凋亡。為了模仿生理?xiàng)l件，使用沒有分離單核細(xì)胞的全血。DNA的斷裂，凋亡的一種典型標(biāo)志，對它的分析如圖5中的插圖所示。孵育1天后，抽提基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳并使用溴化乙錠染色分析DNA斷裂。泳道1顯示了100bp的DNAladder(最小的為200bp，invitrogen，CA)，而泳道2-6分別表示與二甲基亞砜、PBS、100μM的VP-16、20μM的BLM和30Gy的放射線孵育1天后的結(jié)果，泳道7顯示了對于新鮮血液(圖中的對照)的結(jié)果。從該圖可以觀察到DNA的斷裂。
各種mRNA的定量使用下述方法進(jìn)行。將50μl每一種肝素化全血的一式三份的等分試樣加入96孔過濾板中以俘獲白細(xì)胞。將過濾板置于收集盤中并加入150μl的5mM Tris(pH7.4)。以120xg在4℃離心1分鐘后，將50μl的血樣加入每個孔中，立即以120xg在4℃離心2分鐘，接著用300μl的PBS清洗每個孔一次，以2000xg在4℃離心5分鐘。然后，將60μl預(yù)備的裂解緩沖液加入過濾板中并于37℃孵育10分鐘，所述的裂解液含有例如0.5％ N-十二烷基肌氨鈉，4XSSC，10mM TrisHCl，pH7.4，1mM EDTA，0.1％IGEPALCA-630和1.791M硫氰酸胍，并進(jìn)一步添加了1％2-巰基乙醇(BioRad，Hercules，CA，USA)，0.5mg/ml蛋白酶K(PierceRockfordILUSA)，0.1mg/ml鮭精DNA(5PrimeEppendorf/Brinkmann，Westbury，NY，USA)，0.1mg/ml大腸桿菌tRNA(Sigma)，10mM在表1中列出的每一種特異性反向引物的混合液和標(biāo)準(zhǔn)RNA34寡聚核苷酸。之后，過濾板被移至寡聚(dT)-固定的微孔板(GenePlate，RNAture)中，在4℃以2000xg離心5分鐘。4℃過夜保存后，在4℃用100μl普通裂解液清洗微孔板三次，再用150μl的清洗緩沖液(0.5MNaCl，10mM Tris，pH7.4，1mM EDTA)清洗三次。通過在每個孔中加入含有IxRT緩沖液、1.25mM每一種dNTP、4單位的rRNasin和80單位的MM LV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)的30μl緩沖液(無引物)，在37℃孵育2小時，cDNA被直接合成。特異性引物引發(fā)的cDNA存在于溶液中，寡聚(dT)-引發(fā)的cDNA被保留固定在微孔板中。對于TaqManPCR(圖1、3、4)，生成的4μlcDNA溶液被直接轉(zhuǎn)移到384孔PCR板中，所述板中加入了5μl的TaqMan通用樣品混合物(ABI)和1μl的寡聚核苷酸混合液(15μM每一種正向和反向引物和3-6μMTaqMan探針)，PCR在PRISM7900HT(ABI)中進(jìn)行，一個周期包括95℃10分鐘，接著95℃30秒、55℃30秒和60℃1分鐘共45個循環(huán)。對于SYBR Green PCR(見圖2)，cDNA在水中被稀釋3-4倍，4μl的cDNA溶液被直接轉(zhuǎn)移到384孔PCR板中，所述PCR板中加入了5μl樣品混合物(BioRad，Hercules，CA)和1μl寡聚核苷酸混合液(15μM每一種正向和反向引物)，PCR在PRISM7900HT(ABI)中進(jìn)行，95℃10分鐘一個循環(huán)后，接著95℃30秒和60℃1分鐘共45個循環(huán)。每種基因被加入獨(dú)立的孔中。因?yàn)镃t是一個對數(shù)比例(logscale)，1ΔCt通常意謂著在數(shù)量上的兩倍或者一半，負(fù)的ΔCt意謂表達(dá)的增加。Ct通過分析軟件(SDS，ABI)確定。為了使該試驗(yàn)有效，對spiked RNA也進(jìn)行了測定。雖然1xRT緩沖液被作為陰性對照，但并沒有引物對在這些實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生非特異性的引物二聚物。對于圖8中的PUMA，固定在寡聚(dT)固定的微孔板上的cDNA在icycler(BioRad)上被直接擴(kuò)增。
結(jié)果在圖5中顯示。在圖中，在30Gy放射線(●)、20μ MBLM(▲)、100μMVP-16(◆)或相應(yīng)的對照(沒有放射線)、△(PBS)、◇(DMSO)刺激后，肝素化全血在37℃孵育0-8小時。對照RNA34(A)、p21(B)和PUMA(C)的RNA水平按如上所述進(jìn)行定量，計算出ΔCt(ΔCt，Y軸)。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)是來源于一式三份的等分全血的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。如圖5A中所示，在各種刺激和對照中，來源于spiked RNA(RNA34)的ΔCt全都在±1之內(nèi)。這些證實(shí)了試驗(yàn)是可重復(fù)和可靠的。p21被用于證實(shí)實(shí)驗(yàn)條件，如已知它在DNA損傷期間經(jīng)由轉(zhuǎn)錄因子p53的活化誘導(dǎo)。p21 mRNA在沒有任何刺激下增加了。然而，這三種刺激后p21的水平都顯著地提高了(圖5B)。當(dāng)血液被放射線或者BLM刺激時，p21水平連續(xù)8小時提高了，而VP-16顯示出短暫的誘導(dǎo)，在2-4時左右出現(xiàn)一個峰值(圖5B)。因?yàn)槟康氖谴_定早期基因標(biāo)記，所以在37℃孵育接近4個小時時固定。cDNA被用于通過SYBRgreen實(shí)時PCR來篩選各種促進(jìn)凋亡的mRNA。圖6顯示了篩選各種促進(jìn)凋亡的mRNA的結(jié)果。在圖中，肝素化全血由30Gy放射線(A)、20μMBLM(B)或100μMVP-16(C)于37℃刺激4小時，然后定量各種mRNA。每個條形為來自每個人全血(5個用于反射線(3個用于Bcl-2和Bcl-w)，3個用于BLM和VP-16)的一式三份等分試樣的ΔCt的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。如圖6所示，所有測試的個體(5個用于反射線(3個用于Bcl-2和Bcl-w)，3個用于BLM和VP-16)顯示出顯著的p21誘導(dǎo)，ΔCt大于2。Bax也被誘導(dǎo)；然而ΔCt小于p21的ΔCt(圖6)。另外，Bax也不是完全可靠的標(biāo)志，因?yàn)樗?或者2個個體中沒有被誘導(dǎo)出來，雖然它可以用于這里公開的方法。PUMA是最主要的mRNA，它的結(jié)果類似于p21的那些，反應(yīng)在所有的個體中均得到了證實(shí)(圖6)。NOXA在所有的個體中也被誘導(dǎo)出，但誘導(dǎo)的程度要小于PUMA的那些(圖6)。因此，在本方法測定的表明凋亡和這種藥效的標(biāo)記中，PUMA、NOXA和BAX均可以被使用，其中PUMA是最優(yōu)選的mRNA。雖然應(yīng)用了這些mRNA，但本發(fā)明也期望通過利用上面描述的Bcl-2/Bax家族的其它成員和僅BH3 Bcl-2家族成員。此外，顯示癌細(xì)胞對醫(yī)藥制品敏感性的其它mRNA的使用也在預(yù)期中。例如，ATP結(jié)合盒(ABC)亞家族A-G的mRNA也可以使用。這些基因編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些蛋白與跨膜生物分子的運(yùn)輸和對生物體內(nèi)異物的宿主防御機(jī)制密切相關(guān)。具體地，這些基因包括ABCA1、ABCA2變體1、ABCA2變體2、ABCA3、ABCA4、ABCA5變體1、ABCA5變體2、ABCA6變體1、ABCA6變體2、ABCA7變體1、ABCA7變體2、ABCA8、ABCA9變體1、ABCA9變體2、ABCA10、ABCA12變體1、ABCA12變體2、ABCA13、ABCB1、TAP1、TAP2變體1、TAP2變體2、ABCB4變體A、ABCB4變體B、ABCB4變體C、ABCB5、ABCB6、ABCB7、ABCB8、ABCB9變體1、ABCB9變體2、ABCB9變體3、ABCB9變體4、ABCB10、ABCB11、ABCC1變體1、ABCC1變體2、ABCC1變體3、ABCC1變體4、ABCC1變體5、ABCC1變體6、ABCC1變體7、ABCC2、ABCC3變體MRP3、ABCC3變體MRP3A、ABCC3變體MRP3B、ABCC4、ABCC5變體1、ABCC5變體2、ABCC6、ABCC8、ABCC9變體SUR2A、ABCC9變體SUR2B、ABCC9變體SUR2A-δ-14、ABCC10、ABCC11變體1、ABCC11變體2、ABCC11變體3、ABCC12變體A、ABCC12變體B、ABCC12變體C、ABCC12變體D、ABCC12變體E、ABCC13變體1、ABCC13變體2、ABCC13變體3、ABCC13變體4、ABCD1、ABCD2、ABCD3、ABCD4變體1、ABCD4變體2、ABCD4變體3、ABCD4變體4、ABCD4變體5、ABCF1變體1、ABCF1變體2、ABCF2變體1、ABCF2變體2、ABCF3、ABCE1、ABC G1變體1、ABCG1變體2、ABCG1變體3、ABCG1變體4、ABCG1變體5、ABCG1變體6、ABCG1變體7、ABCG2、ABCG4、ABCG5和ABCG8。在這些基因中，特別優(yōu)選的mRNA是對應(yīng)于ABCC2基因產(chǎn)物、包括長春花堿和ABCG2基因產(chǎn)物的底物的那些，ABCG2基因產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定作為負(fù)責(zé)癌多種抗病性的候選蛋白。
為了確認(rèn)圖6的結(jié)果，PUMA被進(jìn)一步通過TaqMan實(shí)時PCR在圖5所示的相同條件下進(jìn)行表征。與p21不同，基準(zhǔn)PUMA表達(dá)在37℃孵育8小時期間沒有變化。在刺激下，PUMA迅速地被誘導(dǎo)，其動力學(xué)和程度均與p21的那些相似(圖5C)。圖7中對RNA34、p21和PUMA也進(jìn)行了研究。對照RNA34的ΔCt沒有變化(圖7)。圖7中，在用0-30Gy放射線(A)、0-20μMBLM(B)或0-100μMVP-16(C)的刺激后，肝素化全血在37℃孵育4個小時，然后定量對照RNA34(○)、p21(▲)和PUMA(●)。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)是來源于一式三份的等分全血的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p21和PUMA顯著的誘導(dǎo)各自出現(xiàn)在超過0.1(PUMA)-1(p21)Gy的放射線、0.1μMBLM和100μMVP-16時(圖7)。
對藥物誘導(dǎo)的早期凋亡信號的檢測可以應(yīng)用到對白血病和淋巴瘤的藥物敏感試驗(yàn)中，所述病癥中大多數(shù)循環(huán)的白細(xì)胞是白血病的。為了確定在異常白細(xì)胞以及健康個體的正常白細(xì)胞中，p21和PUMA是否是好的凋亡標(biāo)記(圖5-7)，進(jìn)一步采取了臨床研究。圖8顯示了三例臨床病例慢性淋巴細(xì)胞性白血病(ACLL)、急性骨髓性白血病(BAML)和白血病性非霍奇金淋巴瘤(CNHL)。超過70％的外周血液白細(xì)胞是不正常的。肝素化全血在37℃與各種藥物孵育兩個小時，RNA34、Bax和PUMA被定量。特別地，來自患有CLL(A)、AML(B)和NHL(C)的病人的肝素化全血與各種抗癌藥物在37℃孵育兩個小時。然后按如上所述對RNA34(□)、p21(■)和PUMA mRNA進(jìn)行定量。每個條形是來源于一式三份的等分全血的ΔCt的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用的化學(xué)制品為長春花堿(VLB，終濃度1μM)，長春新堿(VCL，0.5μM)，吡柔比星(THP，0.5μM)，米托蒽醌(MIT，0.1μM)，培來霉素(PEP，0.5μM)，阿克拉霉素(ACR，0.1μM)，博來霉素(BLM，0.5μm)，紅必霉素(DNR，2.5μM)，阿得里亞霉素(DXR，1μM)，依托泊苷(VP-16，10μM)，卡鉑(CBDCA，10μM)，順氯氨鉑(CDDP，10μM)，氟達(dá)拉賓(FDB，1μM)，氨甲喋呤(MTX，10μM)，5-氟尿嘧啶(5-FU，10μM)，阿糖胞苷(Ara-C，10μm)，氮烯唑胺(DTIC，10μM)，環(huán)磷酰胺(CPA，1μM)。因?yàn)檫@些藥物在臨床實(shí)踐時是經(jīng)靜脈內(nèi)給藥的，所以被采用的全血實(shí)驗(yàn)是真實(shí)臨床條件的一種模擬。RNA34(圖8A-C)和BAX(數(shù)據(jù)未給出)的結(jié)果均小于1ΔCt。如圖8所示，PUMA被MIT和DNR誘導(dǎo)，其中在CLL病人中，p2l不被這些藥物中的任何一種誘導(dǎo)。在圖8B中，顯著的p21誘導(dǎo)僅出現(xiàn)于VLB，而PUMA的大量誘導(dǎo)則由THP、MIT、PEP、VP-16、CDDP、FDB和MTX得到了證實(shí)。圖8C中的NHL病人顯示了強(qiáng)烈的抗THP、MIT、VP-16和MTX的PUMA反應(yīng)，而p2l反應(yīng)均小于2ΔCt。這些結(jié)果表明PUMA在異常白細(xì)胞中是功能性反應(yīng)的，這與在正常白細(xì)胞中不同，它在一些病人中比p21更靈敏。
本技術(shù)方案預(yù)期通過分析來自于遭受例如癌癥的病人的血液，以在采用的治療方案中調(diào)整藥物選擇。在預(yù)期的方法中，血液從病人分離并與暴露到預(yù)期用于治療方案的特異的抗癌劑以預(yù)期的劑量。適當(dāng)?shù)目拱﹦┌橹委煱┌Y開出處方的全部藥物；預(yù)期的具體藥物包括但不局限于依托泊苷博來霉素、長春花堿、吡柔比星、米托蒽醌、培來霉素、阿克拉霉素、紅必霉素、阿得里亞霉素、卡鉑、順氯氨鉑、氟達(dá)拉賓、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氮烯唑胺、環(huán)磷酰胺，和Katzung在基本臨床藥理學(xué)(Basic & Clinical Pharmacology，2001年第8版，第923-958頁)中論述的藥劑，該文引入本申請作為參考。p21和PUMA(或換NOXA)的mRNA水平隨后被測定。優(yōu)選暴露7小時或更少時間后測定。優(yōu)選暴露4小時或更少之后測定。優(yōu)選暴露2小時或更少之后測定。也可以選擇在暴露其它時間長度后進(jìn)行測定。適合的測定方法包括，例如使用TaqMan或者SYBRGreen體系的實(shí)時PCR，或者任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合于mRNA水平測定的體系。然后將測定的水平暴露到藥劑之前血液中的水平比較，或優(yōu)選與對照樣品比較，對照樣品中病人的血液暴露到對照載體同樣長的時間。這些對照載體包括用于本方法中的溶解了藥物在其中的溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO)和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。根據(jù)個體病人的血液對治療方案的反應(yīng)，應(yīng)用的實(shí)際方案可以通過增加或減少劑量或改變使用的藥劑進(jìn)行調(diào)整。在血癌的例子中，結(jié)果被用于使治愈的概率最大化，因?yàn)樵摲椒ㄌ峁┝巳绨┬匝h(huán)血液細(xì)胞的治療方式有效性的直接數(shù)據(jù)。在實(shí)體腫瘤的例子中，結(jié)果被用來評定伴隨一個特定方案的副作用如血液白細(xì)胞抑制的風(fēng)險，以便在使毒性減到最小的同時使治療的效果最大化。
方案3白細(xì)胞抑制的評定血樣獲自健康的志愿者或者患有白血病和淋巴瘤的病人。50μL每種肝素化全血的一式三份的等分血樣與不同濃度的抗癌藥物(BLM，VP-16和taxol)孵育特定長度的時間，然后純化mRNA并合成cDNA，通過上述的TaqMan實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定p21、PUMA和BAX的水平。總之，每個血樣被加到96孔過濾板以俘獲白細(xì)胞。在過濾板上加入含有人工RNA(RNA34)和特異性引物的混合物的裂解緩沖液，細(xì)胞溶解產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到寡聚(dT)固定的微孔板(GenePlate，RNAture，Irvine，CA)上用于雜交。隨后在沒有另外的引物時，DNA在寡聚(dT)固定的微孔板上合成并用于在384孔板中進(jìn)行TaqMan實(shí)時PCR(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)。為了證實(shí)每個試驗(yàn)條件，對spiked RNA也進(jìn)行了測定。引物和探針的序列通過計算機(jī)軟件Primer Express(Applied Biosystems)和HYBsimulator(RNAture)設(shè)計。使用的序列在下面表2列出。
表2引物和探針序列
*5′-FAM，3′-TAMRA寡聚核苷酸通過IDT(Coralville，IA)合成。因?yàn)镃t是一個對數(shù)比例，1ΔCt通常意謂著在數(shù)量上的兩倍或者一半，負(fù)的ΔCt意謂提高的表達(dá)。一式三份的等分全血被用作起始材料用于精確的統(tǒng)計分析(Student′st-test)。由于p21對于細(xì)胞周期停滯作出響應(yīng)，而PUMA屬于促進(jìn)凋亡僅BH3基因家族，所以對這些基因的分析將相應(yīng)于每種藥物的癌細(xì)胞抑制和殺細(xì)胞的效果。在僅BAX和BH3的基因家族中的許多促進(jìn)凋亡基因中，測定了PUMA，與方案2中公開的結(jié)果一致。在一些情況中也測定了BAX。
使用商業(yè)試劑盒(Puregene，Gentra，Minneapolis，MN)，從經(jīng)過治療或沒有經(jīng)過治療的300μl每種全血中純化基因組DNA。然后通過3.5％瓊脂糖(3∶1 NuSieve∶agarose，F(xiàn)MC，Rockland，ME)凝膠電泳分析DNA，用0.5μg/ml溴化乙錠染色，拍照的圖像通過α-Iimager(Alpha Innotech，San Leandro，CA)記錄下來。
DNA的斷裂，凋亡的典型標(biāo)志，在全血被VP-16或BLM刺激一天時得到了證實(shí)(圖5A，插圖)。如圖5A中所示，在各種刺激和對照中，來源于spikedRNA(RNA34)的ΔCt全都在+1之內(nèi)。一式三份的等分全血之間的偏差也小于1ΔCt(圖5A-C，誤差線)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了試驗(yàn)是可重復(fù)和可靠的。p21mRNA在沒有任何刺激時增加了。然而，，p21的水平在VP-16或者BLM刺激下都顯著地提高了(圖5B)。當(dāng)血液被BLM刺激時，p21水平連續(xù)8小時提高了，而VP-16顯示出短暫的誘導(dǎo)，在2-4時左右出現(xiàn)一個峰值(圖5B)。根據(jù)如上所示的VP-16和BLM對p21和PUMA表達(dá)的劑量反應(yīng)曲線，在隨后的研究中使用10-100μM的VP-16和0.2-20μM的BLM。
在圖9A和C中，介質(zhì)(DMSO)處理的血樣的p21(A)或PUMA(C)的Ct值(X軸)與VP-16刺激的那些(Y軸)比較。在圖中，一式三份的50μL每種肝素化全血的等分樣品與10(○)或100(●)μM的VP-16在37℃孵育兩小時。然后，按如上所述測定p21(A，B)和PUMA(C，D)mRNA的水平。在A和C中，比較了未被刺激的樣品的Ct值(X軸)和被刺激的樣品的Ct值(Y軸)。虛線表示未被刺激的和刺激的樣品兩者的等值線。實(shí)線是對每種劑量的回歸線。在B和D中，從被刺激樣品的Ct值中減去未被刺激樣品的Ct值得到ΔCt。在圖中，○表示非應(yīng)答者，●表示適中的應(yīng)答者(對B，n＝9，對D，n＝6)，▲表示高應(yīng)答者。每個數(shù)據(jù)代表了來源于每個個體一式三份的等分全血的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。箭頭1表示在10μM的VP-16時顯示出p21誘導(dǎo)的一個個體，箭頭2表示在100μM的VP-16時顯示出沒有p21誘導(dǎo)的另一個個體。
如圖9A所示，在多數(shù)情況下，低劑量(10μM)的VP-16未能誘導(dǎo)p21。然而，一個個體表達(dá)出顯著的p21誘導(dǎo)(圖9A箭頭1)。回歸線是y＝1.0529x-1.7719(r2＝0.883)。當(dāng)VP-16劑量增加到100μM時，大多數(shù)個體顯示出增加的p21表達(dá)。然而，一個個體顯示完全沒有誘導(dǎo)(圖9A箭頭2，9B空圈)?；貧w線是y＝0.7936x+4.427(r2＝0.7905)。基于回歸線y＝0.7529x+4.9108(r2＝0.625)，VP-16在100μM時也誘導(dǎo)了PUMA(圖9C)。有趣的是，一旦這些資料被轉(zhuǎn)化為圖9B和D所示的ΔCt，非應(yīng)答者(空圈，n＝1)、適中的應(yīng)答者(實(shí)圓對p21，n＝9和對PUMA，n＝6)和高應(yīng)答者(實(shí)三角形對p21，n＝2和對PUMA，n＝3)就被確定。
與VP-16相反，BLM在濃度低至0.2μM時在所有情況下均誘導(dǎo)了p21和PUMA(圖1OA，C)。在圖中，一式三份的50μL每種肝素化全血的等分樣品與0.2(△)、2(◇)或20(●)μM的VP-16在37℃孵育兩小時。然后，按如上所述測定p21(A，B)和PUMA(C，D)mRNA的水平。在A和C中，比較了未被刺激的樣品的Ct值(X軸)和被刺激的樣品的Ct值(Y軸)。虛線和實(shí)線同圖9。在B和D中，從被刺激樣品的Ct值中減去未被刺激樣品的Ct值得到ΔCt。在圖中，○表示非應(yīng)答者，●表示適中的應(yīng)答者(對B，n＝22，對D，n＝20)，▲表示高應(yīng)答者。每個數(shù)據(jù)代表了來源于每個個體一式三份的等分全血的平均值。
p21對0.2、2和20μM的BLM的回歸線分別是是y＝0.8487x+3.8275(r2＝0.8367)、y＝0.8082x+4.513(r2＝0.8444)和y＝0.8146x+3.7147(r2＝0.7552)。PUMA反應(yīng)類似于p21的那些，PUMA對0.2、2和20μM的BLM的回歸線分別是y＝0.8387x+3.7409(r2＝0.8654)、y＝0.793x+4.4688(r2＝0.7254)和y＝0.8764x+1.6353(r2＝0.7546)(圖10C)。當(dāng)這些資料被轉(zhuǎn)化為ΔCt，非應(yīng)答者(空圈，n＝1)、適中的應(yīng)答者(實(shí)圓對p21，n＝22和對PUMA，n＝20)和高應(yīng)答者(實(shí)三角形n＝3)就被確定(圖10B和D)。
圖11總結(jié)了其中p21和PUMA被分析用于VP-16和BLM刺激的例子，在圖中，圖9-10的數(shù)據(jù)被重新繪圖以比較p21(○)和PUMA(▲)反應(yīng)(A)，和VP-16(▲)和BLM(●)反應(yīng)(B)。實(shí)線同圖9和10。每個數(shù)據(jù)代表了來源于每個個體一式三份的等分全血的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖11A中，通過p21鑒別的高和低應(yīng)答者也被確定為與通過PUMA鑒別的應(yīng)答者相似。同樣地，如圖11B所示，抗VP-16的高和低應(yīng)答者也被確定為抗BLM的高和低的應(yīng)答者。為了研究藥物反應(yīng)的每日變化，在1-3天內(nèi)從相同個體抽取血樣將實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。結(jié)果在圖12中顯示。標(biāo)記是來自每個個體的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差，在圖中，分別地，●表示2μMBLM誘導(dǎo)的p21，○表示2μMBLM誘導(dǎo)的PUMA，◆表示20μMBLM誘導(dǎo)的p21，◇表示20μMBLM誘導(dǎo)的PUMA，▲表示100μMVP-16誘導(dǎo)的p21，△表示100μMVP-16誘導(dǎo)的PUMA，和表示對照未被刺激的RNA34。實(shí)線為兩個數(shù)據(jù)相等的線。虛線是±0.5ΔCt。如圖12所示，VP-16和BLM誘導(dǎo)的p21和PUMA的誘導(dǎo)在兩個樣品間是可比較的，偏差在+0.5ΔCt之內(nèi)。
相同的方法被用于不同類的抗癌藥物taxol。Taxol是一微管毒藥，已經(jīng)表明它對凋亡的誘導(dǎo)增加了促進(jìn)凋亡的BAK和BAX的表達(dá)。然而，taxol對血細(xì)胞的效果是非常弱的，IC50大于10mM。在本研究中，甚至在濃度高達(dá)100μM時，taxol也未能誘導(dǎo)所有個體中p21和PUMA的mRNA(圖13)。在圖中，一式三份的50μL每種肝素化全血的等分樣品與10或100μM的taxol在37℃孵育兩小時。然后，按如上所述測定p21和PUMA，ΔCt按如上所述計算。每個數(shù)據(jù)代表來源于每個個體一式三份的等分全血的平均值。Taxol使用濃度不高于100μM，因?yàn)楸?00μM更高的濃度超出了血液水平。
圖14顯示了BAX表達(dá)與p21和PUMA的表達(dá)的比較。在圖中，一式三份的50μL每種肝素化全血的等分樣品與100μM的VP-16(A)或20μMBLM(B)在37℃孵育兩小時。然后，按如上所述對BAX、p21和PUMA mRNA進(jìn)行定量，ΔCt按如上所述計算。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一式三份測定的平均值。BAX對VP-16和BLM的反應(yīng)顯著小于p21和PUMA的那些(p＜0.01)。在圖15中，BLM在健康供體中誘導(dǎo)的p21反應(yīng)與在白血病和淋巴瘤病人中進(jìn)行比較，其中超過80％的白細(xì)胞是白血病細(xì)胞，在圖中，一式三份的50μL每種肝素化全血的等分血樣在有或沒有1μMBLM時在37℃孵育兩小時。然后，按如上所述對p21 mRNA進(jìn)行定量。[來源于27個健康供體的血樣的ΔCt值與來源于13個病人的血樣的ΔCt值進(jìn)行比較，所述病人患有白血病和淋巴瘤，血液中超過80％的白細(xì)胞是癌細(xì)胞。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)是來自一式三份的測定的平均值。有趣地是，在白血病和淋巴瘤群體中的BLM反應(yīng)要顯著小于在健康對照中的，這意味著這些癌細(xì)胞對BLM有抗性。這些證實(shí)了BLM不是用于這些疾病藥物的合適選擇的這個事實(shí)。
目前體外基因表達(dá)分析是足夠靈敏的，它可以從少至70μL的全血(50μL的實(shí)際容積加上20μL儲備)中檢測出藥物誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)mRNA的基因表達(dá)，提供對來自于1血管(6mL)(6000/70/3＝28.6)的一式三份28套數(shù)據(jù)的分析。這些對于只需要11套數(shù)據(jù)、研究3劑量(0.2-100μM)的三種藥物(VP-16、BLM和taxol)加上未被刺激的對照(DMSO用于VP-16，PBS用于BLM和taxol)足足有余。同血清實(shí)驗(yàn)不同，血清實(shí)驗(yàn)中從6mL血液回收的血清體積在個體間存在差異，而全血實(shí)驗(yàn)容許對來自固定體積的血液進(jìn)行詳細(xì)分析的設(shè)計。傳統(tǒng)的試驗(yàn)使用懸浮在人工培養(yǎng)介質(zhì)中的分離的單核細(xì)胞。雖然這些試驗(yàn)是用于細(xì)胞本身的極好的研究模型，但它們忽視了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-血漿的相互作用，以及對人生理?xiàng)l件的總體了解的不可避免的考慮。作為ACD和EDTA螯合鈣，一種適合于許多生物學(xué)活性的重要組分，肝素是優(yōu)選的抗凝劑。
由于mRNA轉(zhuǎn)錄是蛋白質(zhì)合成的上游事件，它發(fā)生在刺激之后的兩個小時內(nèi)，所以進(jìn)行mRNA分析的條件要比隨后的蛋白質(zhì)分析或生物學(xué)活性檢測要更接近于生理?xiàng)l件，后者需要較長的孵育時間。孵育得越久，越多的副效應(yīng)可能發(fā)生。當(dāng)考慮個體-個體的差異時，這些尤其重要。mRNA分析也具有使用基因擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，它使得檢測比蛋白質(zhì)分析或者基于細(xì)胞的功能分析更靈敏，50μL的全血就足以分析至少20個基因。
雖然基因擴(kuò)增技術(shù)能夠檢測試管中單一拷貝的靶基因，但當(dāng)研究基因表達(dá)的正負(fù)調(diào)節(jié)時，分析靈敏度依賴于每個數(shù)據(jù)集的偏差。例如，如果兩個數(shù)據(jù)集的變異系數(shù)(CV)在所有情況下為10％，通過統(tǒng)計顯著性可以檢測在基因表達(dá)方面約20％的改變。如果CV變成30％，對于統(tǒng)計顯著性需要超過70％的變化。體外全血分析涉及大量能增加CV的因素。例如，粘滯全血的移液、RNA分離步驟、cDNA合成反應(yīng)和PCR都會引起偏差。因?yàn)镻CR按指數(shù)規(guī)律地擴(kuò)增了靶基因，任何步驟中的小偏差最后變成大得無法接受。另外，ΔCt的偏差變得非常大是因?yàn)樗莾身?xiàng)分析的多重加和。即使當(dāng)一式三份的全血等分血樣被用作起始材料和計算了ΔCt時，本方法也只顯示出極小的偏差。作為結(jié)果，確定藥物誘導(dǎo)的p21、PUMA和BAX的上調(diào)方面的細(xì)微變化是可能的如果某些藥物(例如VP-16和BLM)(圖13-14)在體外生理?xiàng)l件下誘導(dǎo)p21和PUMA，那么這種藥物在個體中應(yīng)該比陰性藥物(如taxol)的那些(圖13)更可能誘導(dǎo)白細(xì)胞問題。值得注意的是，一個個體未能誘導(dǎo)p21和PUMA，甚至是在VP-16的濃度高達(dá)100μM時(圖9)，如果那些藥物被應(yīng)用，這樣的個體將會有低的白細(xì)胞抑制的危險。癌細(xì)胞對BLM的反應(yīng)性也很小(圖15)。對這些非應(yīng)答者或者高應(yīng)答者的鑒定將使得對人類藥物反應(yīng)性和抗性的分析成為可能，這是動物或者培養(yǎng)的細(xì)胞試驗(yàn)所無法取代的。
方案4癌癥治療中的臨床結(jié)果為了表明用于本發(fā)明的定制用藥的方法在臨床上產(chǎn)生了有益的結(jié)果，上面描述的方法被用于研究9個患有不同形式淋巴瘤和白血病的病人。病人群體在以下的表3中列出。在表中，“FL”表示濾泡性淋巴瘤，“MCL”表示套細(xì)胞淋巴瘤，“AML”是急性骨髓性白血病(M2表示階段)，“T-”表示T細(xì)胞類型，和“ALL”表示急性淋巴母細(xì)胞性白血病。
表3臨床病人群體
將病人的全血暴露到列于下面表4的藥物，按如上所述的在暴露4小時后測定病人白細(xì)胞中的p21、BAX和一些例子中的PUMA的水平。對照血樣只是暴露到對照載體溶劑(DMSO或者PBS，如表4所示)，按如上所述的從測定的mRNA值中計算Ct和ΔCt。
表4使用的抗癌藥物
結(jié)果在圖16和17中顯示，列于表5中。從圖中可以看出，這些藥物顯示出p21或者PUMA mRNA的增加在病人到病人之間變化相當(dāng)大。雖然在該相對小的病人群體中，BAX普遍不被誘導(dǎo)，但本方法仍然包括對作為抗癌藥物活性可能標(biāo)記的BAX和Bcl-2/BAX家族另一個成員的測定。如圖所示，作為在選擇病人中用不同藥物刺激的結(jié)果，p21和PUMA均顯示了提高的mRNA水平。
表5臨床結(jié)果
表5顯示了使用任一種藥物(“敏感性藥物”)或其它藥物的改進(jìn)型治療的結(jié)果，其中使用的任一種藥物的單獨(dú)效力是通過本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果而暗示的。在表中，CHOP表示用CPA、Adriacin(ADR阿得里亞霉素)、VCR和predonisolone(PSL)治療；R-表示利妥昔單抗；COP表示用CPA、VCR和PSL治療；VP表示用VDS和PSL治療；RI表示用AraC、DNR、MIT和VP-16治療；CAG表示用低劑量AraC、ACR和G-CSF治療；CA表示用低劑量AraC和ACR治療；和VA表示用低劑量AraC和低劑量VP-16治療。VDS表示長春地辛。在“判定”欄，A表示完全緩解，B表示改善的血液學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果，和C表示沒有改善。
一些病人治療不只一次。如表所示，用敏感藥物治療的所有七種處理均引起了mRNA標(biāo)記的增加和良好的臨床結(jié)果(圖中顯示為“+/+”)。其中，三種完全緩解(在臨床結(jié)果為“A”)。受益于敏感藥物療法的病人中的兩個對用非敏感藥物的標(biāo)準(zhǔn)藥物療法沒有反應(yīng)。用非敏感藥物治療的六種處理中，僅僅一個產(chǎn)生了良好的臨床結(jié)果。其余顯示沒有改善。
本發(fā)明的方法因此表明了藥物方案適合于每個病人，當(dāng)接受相應(yīng)的藥物方案后產(chǎn)生了改善的臨床結(jié)果，包括在一半成功治療病例中得到了完全緩解。這顯然表明本發(fā)明的方法在個體病人的癌癥病例中對定制治療方案有用，所述定制治療方案是基于病人患病白細(xì)胞的藥物敏感性，如反映在那些白細(xì)胞內(nèi)部的標(biāo)記mRNA水平的變化。
結(jié)果也顯示在陽性mRNA結(jié)果與良好的臨床結(jié)果之間有緊密的相關(guān)除了一個結(jié)果之外都是+/+或者-/-。這些相關(guān)表明該方法也可用于定制治療方案以避免在用化療治療實(shí)體腫瘤的例子中的白細(xì)胞抑制。如果在全血分析中，白細(xì)胞顯示出標(biāo)記mRNA適應(yīng)于藥物的顯著增加，那么在用藥物治療期間，該病人白細(xì)胞的生長停滯或者凋亡有可能引起白細(xì)胞抑制。
方案5用于免疫抑制的定制給藥血液獲自健康成人和患有干癬(4)、再生障礙性貧血(1)、腎病綜合征(1)和骨髓移植(2)的病人。在血液提取的時候，一個EDTA管被送去臨床實(shí)驗(yàn)室用于白細(xì)胞計數(shù)的測定，一個肝素管被存儲在冰上。血液等分樣品在有或沒有CsA時在37℃被植物血細(xì)胞凝集素-P(PHA-P)刺激不同長度的時間。50μL每種血樣被加入過濾板的三個不同孔(從最初起的一式三份的)，通過在800xg離心2分鐘在膜上收集白細(xì)胞。一旦離心后用300μL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗每個孔，上面描述的裂解緩沖液被加到每個孔中，于37℃孵育10分鐘以從俘獲的白細(xì)胞中釋放出mRNA。隨后，通過以2000xg離心5分鐘將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到寡聚(dT)-固定的微量板(GenePlate，RNAture)中，在4℃孵育過夜用于雜交。用100μL裂解緩沖液沖洗每個孔三次后，接著用150μL的清洗緩沖液(10mM Tris，pH7.4，1mM EDTA，pH8.0和0.5MNaCl)清洗三次，通過在每個孔中加入緩沖液、核苷酸、特異性引物的混合液、RNasin和MM LV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI)并于37℃孵育兩個小時合成cDNA。生成的cDNA(4μL)被用于TaqMan實(shí)時PCR，置于384孔微孔板中，使用熱循環(huán)儀(ABI，PRISM7900)，其終濃度為10μL。
圖18顯示了健康成人中IL-2mRNA經(jīng)PHA-P的劑量依賴性誘導(dǎo)的結(jié)果。如圖18所示，IL-2 mRNA從5μg/mLPHA-P時開始增加，在40μg/mLPHA-P時達(dá)到一個峰值(圖19)。在圖19中，三角形表示10μg/mL的CsA濃度，而菱形表示40μg/mL的濃度，圓形表示100μg/mL的濃度。為了使個體差異最小化，100μg/mL的PHA-P被用于隨后的分析。PHA-P用于長期對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)，其中PHA-P的作用在10-20μg/mL時最大，在更高的劑量時活性下降。IL-2 mRNA數(shù)據(jù)是不同的，即使當(dāng)100μg/mLPHA-P使用時，其活性持續(xù)很高(圖19)。也可以使用其它的植物凝血素如商陸絲裂素。與需要在培養(yǎng)基中花費(fèi)3-5天的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化分析不同，在全血中的mRNA分析僅需要1-2小時。在全血中短時間的孵育模仿了生理?xiàng)l件，基本上減少了分析偏差。
不同濃度的CsA與健康自愿者的肝素化全血在37℃孵育30分鐘，然后由10μg/mLPHA-P在37℃誘導(dǎo)IL-2 mRNA兩個小時。如圖20所示，IL-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄被50-2000ng/mL的CsA以一種劑量依賴性方式抑制，IL-2 mRNA的表達(dá)幾乎被抑制了100％(圖20)。在圖3中，在加入PHA-P前的30分鐘在血樣中加入CsA。然而，當(dāng)CsA和PHA-P同時加入后鑒別到了相似的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，即使使用了100μg/mL PHA-P時，CsA的抑制作用仍然存在(圖21)。為了使分析偏差最小化，我們使用了100μg/mLPHA-P用于隨后的實(shí)驗(yàn)。
圖19中顯示的對15個健康供體的試驗(yàn)在一個月的周期內(nèi)重復(fù)，每個實(shí)驗(yàn)中用1-5個血樣。每個樣品中CsA的濃度為0、100和500ng/ml。如圖22所示，所有15個健康供體顯示了超過40％的顯著的抑制。有趣地是，100ng/mlCsA時，健康的供體被分成兩組大約1/3的高應(yīng)答者(空圈)和2/3低應(yīng)答者(實(shí)圓)。這表明臨床實(shí)用性低應(yīng)答者可以給予高劑量的CsA，或轉(zhuǎn)換成FK，和高應(yīng)答者可以給予低劑量的CsA以減少任一副作用的可能性。
接著，在服用了CsA或者FK的健康成人和病人之間進(jìn)行了比較。結(jié)果在圖23中顯示。在圖中，IL-2 mRNA的值除以每個樣品中的白細(xì)胞數(shù)目，因?yàn)榘准?xì)胞計數(shù)在病人之間變化很大。在圖中，實(shí)圓表示健康成人，空圈表示CsA病人和空三角形表示FK病人。病人具有以下疾病1骨髓移植性白血病，2干癬，3再生障礙性貧血，4干癬，5干癬，6干癬，7用骨髓移植性白血病和8腎病綜合癥。X軸是沒有PHA-P刺激的IL-2 mRNA的基線值，Y軸是PHA-P刺激后的值。實(shí)圓是來自健康成人的數(shù)據(jù)，空圈和三角形是來自于CsA或者FK病人的數(shù)據(jù)。如圖23所示，具有低的基線IL-2 mRNA的病人顯示微弱的誘導(dǎo)。因此，當(dāng)計算變化百分?jǐn)?shù)(％)時，這些組之間沒有顯著差異。然而，一旦數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)化成如圖6所示的二維圖表時，病人的繪圖清楚地區(qū)分于那些健康成人。對于健康成人和病人的基線IL-2 mRNA分別是0.16±0.10和0.03±0.03，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.001)。在PHA-P刺激后，對于健康成人和病人，IL-2 mRNA分別是26.68±12.03和10.86±16.97，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.007)。病人案例號1顯示隨高的PHA-P反應(yīng)的低基線IL-2 mRNA，表明了與其他病人相比，藥物處理沒有效果。病人案例號4顯示對那些健康成人的下限相似的反應(yīng)，也表明弱的藥物反應(yīng)。雖然藥物反應(yīng)是每個病人中合成物生物學(xué)活性的總和，但該功能的易感性分析將提供給臨床醫(yī)生有用信息以用于給他們的病人用藥。
圖24A和24B顯示了基線(圖24A)或者遞送PHA-P刺激的IL-2 mRNA(圖24B)和CsA的血液水平之間的關(guān)系。mRNA值除以白細(xì)胞數(shù)目。如圖所示，沒有明確的關(guān)系被鑒定。由于CsA的血液水平在這些病人中約為100ng/ml，其中存在高或低的應(yīng)答者(圖22)，所以這種功能分析相比藥物濃度的簡單測定具有優(yōu)勢，因?yàn)樗梢詤^(qū)分這兩個群體。
圖25顯示了當(dāng)FK被使用時的結(jié)果。雖然因?yàn)樾〉娜后w規(guī)模不可能有明確的結(jié)論，但使用FK的這種方法將是有用的也是可以預(yù)期的。
序列表<110>日立化成工業(yè)株式會社日立化成研究中心公司三橋?qū)⑷?amp;lt;120>通過定量mRNA定制給藥的方法<130>HITACHI.066VPC<150>60/620,603<151>2004-10-20<150>60/653,557<151>2005-02-16<150>60/688,741<151>2005-06-08<160>52<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>29catacacttt ttctctttcc atgacatc 28<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>30gggcatcgca gtagcttctg 20<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>31caggcctatg caaaaagagg at 22<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>32cgcaccggaa gggaatct18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>33ggcaggcgac gagtttga18<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>34gttcccatag agttccacaa aagtatc 27
<210>35<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>35tcacatgctg gttgcttaat cc 22<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>36gcacaaggac cccatcaca 19<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>37cacggcagag aatgcctatg a21<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>38cccaattgat gccactctca 20<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>39tttctgacgg caacttcaac tg 22<210>40
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>40ggtgcacagg gccttgag18<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<400>41ccaaggccca gccctcacac a21<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>42agccccctca ctcccaaa18<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>43gggtgctgtg cttctgtgaa c21<210>44<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<400>44ccactccaaa cgccggctga tc 22<210>45<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>45ttctgctgtc tctcctcaga tttct25<210>46<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>46ggattagggc ttcctcttgg a21<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<400>47ccccgcccca tcaatccca 19<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>48gggcccagac tgtgaatcct 20<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>49acgtgctctc tctaaaccta tgca 24<210>50<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探針序列<400>50ttgtcgccct tttctacttt gccagca 27<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>51tttctgacgg caacttcaac tg 22<210>52<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>52ggtgcacagg gccttgag18201127410200權(quán)利要求
1.一種測定病人對藥物的反應(yīng)性的方法，其包括將病人的全血暴露到藥物7個小時或者更少；在所述暴露后，測定血細(xì)胞中與藥物效果相關(guān)的mRNA的數(shù)量；以及根據(jù)測定的結(jié)果確定對藥物的反應(yīng)性，其中mRNA數(shù)量的改變表明病人對藥物的反應(yīng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中存在于血細(xì)胞中的mRNA的數(shù)量在所述暴露前被測定，通過比較暴露前測定的mRNA的量與暴露后測定的mRNA的量來確定mRNA數(shù)量的變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其另外包括將病人的全血暴露到對照載體7個小時或者更少；在所述暴露后，測定暴露到對照載體的血細(xì)胞中與藥物效果相關(guān)的mRNA的數(shù)量；以及鑒定對藥物的反應(yīng)性包括比較暴露到對照載體后獲得的測定結(jié)果與暴露到藥物后獲得的測定結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中對照載體選自由磷酸緩沖鹽溶液和二甲亞砜組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中對病人的全血進(jìn)行暴露包括加入肝素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中全血被刺激5個小時或者更少。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中全血被刺激2～4個小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中藥物的效果是血細(xì)胞的凋亡。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中mRNA選自由編碼Bcl-2/Bax基因家族的基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中mRNA編碼Bax基因產(chǎn)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中mRNA選自由編碼僅BH3 Bcl-2基因家族的基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中mRNA選自由編碼PUMA和NOXA基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中藥物的效果是血細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中mRNA編碼p21基因產(chǎn)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其另外包括測定與所述藥物在血細(xì)胞中的第二種效果相關(guān)的第二種mRNA的數(shù)量，其中所述藥物的第一種效果是血細(xì)胞的凋亡，第一種mRNA編碼PUMA基因產(chǎn)物；以及所述藥物的第二種效果是血細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，第二種mRNA編碼p21基因產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求8或者13所述的方法，其中藥物選自以下的組依托泊苷、阿得里亞霉素、氟達(dá)拉賓、米托蒽醌、利妥昔單抗、長春地辛、吡柔比星、卡鉑、環(huán)磷酰胺、博來霉素、長春花堿、長春新堿、培來霉素、阿克拉霉素、紅必霉素、阿得里亞霉素、順氯氨鉑、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氮烯唑胺、環(huán)磷酰胺和紫杉醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求8、13或15所述的方法，其中病人患有白血病或者白血病淋巴瘤。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將病人的全血暴露包括用植物凝血素刺激。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述植物凝血素選自由植物血細(xì)胞凝集素-P和商陸絲裂素組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中藥物的效果是抑制IL-2的轉(zhuǎn)錄。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中mRNA編碼IL-2基因產(chǎn)物。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中藥物是一種免疫抑制劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中藥物選自由環(huán)孢霉素A和藤霉素組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中mRNA選自由編碼來自ATP結(jié)合盒系列A、B、C、D、E、F和G的基因產(chǎn)物的mRNA組成的組。
25.一種測定病人對藥物的反應(yīng)性的方法，其中藥物選自下組依托泊苷、阿得里亞霉素、氟達(dá)拉賓、米托蒽醌、利妥昔單抗、長春地辛、吡柔比星、卡鉑、環(huán)磷酰胺、博來霉素、長春花堿、長春新堿、培來霉素、阿克拉霉素、紅必霉素、阿得里亞霉素、順氯氨鉑、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氮烯唑胺、環(huán)磷酰胺和紫杉醇，所述方法包括將病人的全血暴露到藥物4個小時或者更少；將病人的全血與暴露到對照載體4個小時或者更少；在所述暴露之后，測定血液細(xì)胞中一種mRNA的量，所述mRNA選自由編碼血細(xì)胞中p21、BAX和PUMA基因產(chǎn)物的mRNA組成的組；比較暴露到對照載體后獲得的測定結(jié)果與暴露到藥物后獲得的測定結(jié)果；基于比較的結(jié)果確定對藥物的反應(yīng)性，其中mRNA數(shù)量的變化表明病人對藥物的反應(yīng)性。
26.一種測定病人對藥物的反應(yīng)性的方法，所述藥物選自由環(huán)孢霉素A和藤霉素組成的組，所述方法包括將病人的全血暴露到所述藥物和植物凝血素4個小時或者更少；將病人的全血暴露到對照載體和植物凝血素4個小時或者更少；在所述暴露后，測定血細(xì)胞中編碼IL-2基因產(chǎn)物的mRNA的數(shù)量；比較暴露到對照載體后獲得的測定結(jié)果與暴露到藥物后獲得的測定結(jié)果；根據(jù)比較的結(jié)果確定對所述藥物的反應(yīng)性，其中mRNA數(shù)量的改變表明說病人對所述藥物的反應(yīng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種為個體病人定制藥物方案的方法，該方法是基于用候選藥物刺激病人的全血后所測定的白細(xì)胞中的標(biāo)記mRNA的水平。一種測定病人對藥物的反應(yīng)性的方法也被公開了，所述方法包括使病人的全血暴露到藥物7個小時或者更少；暴露后，測定血細(xì)胞中與藥物的效果相關(guān)的mRNA的數(shù)量；和根據(jù)測定的結(jié)果確定病人對藥物的反應(yīng)性，其中mRNA數(shù)量的改變表明病人對該藥物的反應(yīng)性。測定的血細(xì)胞中的mRNA的數(shù)量可與暴露前存在于細(xì)胞中的mRNA的水平或在暴露到對照載體相同長度時間后存在于細(xì)胞中的mRNA的水平比較。用于本發(fā)明的標(biāo)記mRNA包括編碼p21、BAX、PUMA、NOXA和IL－2基因的基因產(chǎn)物的mRNA。該方法可用于患有或連同其它癥狀的需要免疫抑制的癌癥或者疾病或者癥狀的病人。
文檔編號C12Q1/68GK101044249SQ200580035896
公開日2007年9月26日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月20日
發(fā)明者三橋?qū)⑷?申請人:日立化成工業(yè)株式會社, 日立化成研究中心公司