專利名稱：一種食用菌液體菌種的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食用菌液體菌種的保存方法。
背景技術(shù)：
食用菌液體深層發(fā)酵技術(shù)是近20多年來發(fā)展起來的，適應(yīng)食用菌工廠化生產(chǎn)的新技術(shù)，與傳統(tǒng)的固體菌種培養(yǎng)方式相比，具有周期短、效益高、接種方便且不易污染、發(fā)菌快、菌齡整齊等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)出的食用菌產(chǎn)量高、品質(zhì)好，且由于發(fā)菌快、不易受雜菌污染，用液體菌種生產(chǎn)食用菌很少使用化學(xué)殺菌劑，生產(chǎn)得到的食用菌不含有毒物質(zhì)殘留，是天然綠色食品。因此，應(yīng)用液體菌種是食用菌生產(chǎn)的發(fā)展方向。由于食用菌菌種的液體培養(yǎng)技術(shù)對資金、設(shè)備、技術(shù)和相關(guān)專業(yè)人才的要求較高，而目前我國食用菌生產(chǎn)的現(xiàn)狀難以適應(yīng)這樣的要求；同時(shí)，由于液體菌種營養(yǎng)成分豐富，容易老化失活。因此，如何在貯運(yùn)過程中較長時(shí)間地保存液體菌種的活力，使菌種使用者能購買和使用到貯藏和接種方便，同時(shí)有足夠活力的液體菌種是目前在食用菌工廠化生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，常溫條件下菌種保存時(shí)間只有24小時(shí)，超過此時(shí)間，菌種活力迅速下降，不能滿足生產(chǎn)要求。
目前，已有的實(shí)驗(yàn)證明，0℃～4℃條件下，保存時(shí)間由于食用菌品種的不同而有差異，一些品種為3～7天，一些可達(dá)2～3個(gè)月。中國專利92108733.0公開了一種食用菌液體菌種的儲(chǔ)存方法，是將液體菌種儲(chǔ)存于一種密閉容器的內(nèi)腔中，儲(chǔ)存溫度為1℃～25℃，儲(chǔ)存時(shí)間最長可達(dá)到90天，即3個(gè)月。
以上菌種的保存溫度沒有突破液體菌種的相變溫度(0℃)，在保存時(shí)間和保存效果上難以做到效益最大化。
MTT([3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基]四氮唑溴鹽)比色技術(shù)是利用活細(xì)胞體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶(NADH)催化MTT生成藍(lán)紫色晶體(formazan)沉淀在細(xì)胞中，再通過有機(jī)溶劑將之溶解，在570nm波長處，用722吸光光度計(jì)測量吸光度(OD值)，細(xì)胞的活度不同，相對應(yīng)的OD值不同，OD值與細(xì)胞活度在一定范圍內(nèi)具有正相關(guān)的關(guān)系。該方法廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的凋亡研究領(lǐng)域。但是，食用菌屬絲狀真菌，其在液體菌種中的菌球是由菌絲體緊密纏繞形成的，它具有體積大(直徑1mm左右)，MTT難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，形成的藍(lán)色物質(zhì)不容易析出的問題，目前還未見該技術(shù)應(yīng)用于評價(jià)食用菌液體菌種活力方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、保存時(shí)間長的食用菌液體菌種的保存方法。
本發(fā)明所提供的食用菌液體菌種的方法，是將食用菌液體菌種先經(jīng)過快速冷凍降溫到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃溫度下進(jìn)行保藏，其溫度下降速率為1-6℃/min。
常用的冷凍降溫采用低溫鹽溶液水浴冷凍法，如采用飽和CaCl2溶液水浴法進(jìn)行冷凍降溫。經(jīng)過保存的菌種在需要使用時(shí)只需要在室溫條件下融化并恢復(fù)活力24h即可用于使用。
經(jīng)過保存的食用菌菌種經(jīng)過活化后，其活力測定方法是將經(jīng)保存的食用菌菌球用MTT溶液振蕩染色，然后，加入二甲基亞砜或酸化異丙醇采用超聲破碎法使色素完全溶解，測定吸光度。
其中，MTT溶液的濃度為4-6mg/ml。
該測試方法包含染色和色素溶解兩個(gè)部分，具體操作如下染色過程是將MTT試劑溶解于無菌的磷酸鹽緩沖液PBS中，配制成5mg/ml的MTT溶液。先將一定數(shù)量菌球置于一定體積的無菌水中，加入10％(v/v)MTT染液，通過震蕩等措施使菌球完全染色，染色完成后菌球呈藍(lán)紫色，而無菌水仍為無色；色素溶解過程是將細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色晶體物質(zhì)溶解在一定體積的溶解劑中，溶解劑的選擇有很多種，如二甲基亞砜(DMSO)，酸化異丙醇等。經(jīng)過細(xì)胞破碎處理后，形成顏色穩(wěn)定均勻的溶解液，利用分光光度計(jì)在570nm處測量OD值。以正常培養(yǎng)出具有百分之百活力的菌球定為活力1，經(jīng)過冷凍保存后的菌種活力計(jì)算公式為菌種活力＝(經(jīng)冷凍保存后的OD值/正常培養(yǎng)菌球的OD值)×100％。
本發(fā)明利用-40℃～-20℃的低溫保存菌種，經(jīng)冷凍保存的液體菌種經(jīng)解凍活化，接種固體培養(yǎng)基后能正常萌發(fā)，可用于生產(chǎn)食用菌。使用MTT比色法檢測，經(jīng)過7個(gè)月冷凍保存的菌種活力可保持在75％以上。與現(xiàn)有的液體菌種保存方法相比，本發(fā)明方法保存時(shí)間更長，能夠快速檢驗(yàn)檢測保存后菌種的活力，適應(yīng)食用菌液體菌種工廠化生產(chǎn)、保存和銷售的需要。本發(fā)明的食用菌液體菌種的低溫保存方法簡便易行，采用冷藏冰柜即可滿足要求，成本低、效益高，對菌種的前期培養(yǎng)條件沒有附加要求，凡是以液體培養(yǎng)方式得到的食用菌菌種均可以用本發(fā)明的方法保存，在實(shí)際生產(chǎn)中容易推廣使用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、平菇的冷凍保存平菇液體培養(yǎng)基的配方為每1000毫升培養(yǎng)基中含玉米粉50-60g、蔗糖10g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、維生素B10mg；裝量水平為500毫升三角瓶裝液體培養(yǎng)基125毫升，接種量為10％；接種斜面菌種后在25℃靜止培養(yǎng)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入25℃水浴搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)5天后將液體菌種進(jìn)行低溫鹽水浴冷凍處理，降溫速率為3℃/min，降溫到-30℃后，置于-30℃條件下冷凍保存。
將菌種保存5個(gè)月后取出，室溫活化24小時(shí)，無菌條件下選取8個(gè)直徑1mm左右的菌球置于1ml無菌水中，加入0.1mlMTT染液(5mg/ml)，25℃、150r/min水浴搖床染色12小時(shí)，取出菌球，加入到10mlDMSO中，0.5A功率條件下超聲2分鐘，菌球消失，細(xì)胞完全破碎，色素溶解完全；將色素溶解液在800r/min條件下離心5分鐘，后取3ml上清液，使用722分光光度計(jì)，在570nm處測量OD值，與同樣處理?xiàng)l件下得到的正常培養(yǎng)的菌球的OD值相比，得菌種活力為82.8％。
接種冷凍保存過得菌種到栽培培養(yǎng)基上，之后的發(fā)菌條件、出菇管理與普通液體菌種相同，得出正常子實(shí)體。
實(shí)施例2、杏鮑菇的冷凍保存杏鮑菇液體培養(yǎng)基的配方為黃豆粉培養(yǎng)基每1000毫升培養(yǎng)基中含黃豆粉(過濾后)60g，葡萄糖30g，蛋白胨2g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，VB1 10mg；培養(yǎng)溫度30℃；轉(zhuǎn)速210r/min；接種量15％；裝量100ml。在上述條件下培養(yǎng)4天后將培養(yǎng)好的液體菌種進(jìn)行低溫鹽水浴冷凍處理，降溫速率為1.5℃/min，降溫到-25℃，后置于-25℃下進(jìn)行冷凍保存，保存5個(gè)月。
將保存菌種取出，室溫活化24小時(shí)，無菌條件下選取16個(gè)直徑1mm左右的菌球置于1ml無菌水中，加入0.1mlMTT染液(5mg/ml)，25℃、150r/min水浴搖床染色12小時(shí)，取出菌球，加入到10mlDMSO中，0.5A功率條件下超聲2分鐘，菌球消失，細(xì)胞完全破碎，色素溶解完全。將色素溶解液在800r/min條件下離心5分鐘，后取3ml上清液，使用722分光光度計(jì)，在570nm處測量OD值，與同樣處理?xiàng)l件下得到的正常培養(yǎng)的菌球的OD值相比，得菌種活力為76.5％。
接種冷凍保存過得菌種到栽培培養(yǎng)基上，之后的發(fā)菌條件、出菇管理與普通液體菌種相同，得出正常子實(shí)體。
實(shí)施例3、茶樹菇的冷凍保存茶樹菇液體培養(yǎng)基的配方為每1000毫升培養(yǎng)基中含馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，酵母粉1g，初始pH6.5；培養(yǎng)溫度25℃；轉(zhuǎn)速150r/min；接種量15％；裝量100ml。在上述條件下培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)好的液體菌種進(jìn)行低溫鹽水浴冷凍處理降溫到-40℃，降溫速率為5℃/min。后置于-40℃進(jìn)行冷凍保存，保存7個(gè)月。
將保存菌種取出，室溫活化24小時(shí)，無菌條件下選取12個(gè)直徑1mm左右的菌球置于1ml無菌水中，加入0.1mlMTT染液，25℃，150r/min水浴搖床染色12小時(shí)，取出菌球，加入到10mlDMSO中，0.5A功率條件下超聲2分鐘，菌球消失，細(xì)胞完全破碎，色素溶解完全。將色素溶解液在800r/min條件下離心5分鐘，后取3ml上清液，使用722分光光度計(jì)，在570nm處測量OD值，與同樣處理?xiàng)l件下得到的正常培養(yǎng)的菌球的OD值相比，得菌種活力為87.5％。
接種冷凍保存過得菌種到栽培培養(yǎng)基上，之后的發(fā)菌條件、出菇管理與普通液體菌種相同，得出正常子實(shí)體。
權(quán)利要求
1.一種食用菌液體菌種的保存方法，是將食用菌液體菌種先經(jīng)過快速冷凍降溫到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃溫度下進(jìn)行保藏，所述降溫的速率為1-6℃/min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述冷凍降溫采用低溫鹽溶液水浴冷凍法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述被保存的食用菌菌種活力測定的方法，是將經(jīng)保存的食用菌菌球用MTT溶液振蕩染色，然后，加入二甲基亞砜或酸化異丙醇采用超聲破碎法使色素完全溶解，測定吸光度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述MTT溶液的濃度為4-6mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食用菌液體菌種的保存方法。本發(fā)明所提供的食用菌液體菌種的方法，是將食用菌液體菌種先經(jīng)過快速冷凍降溫到－40℃～－20℃后，再在－40℃～－20℃溫度下進(jìn)行保藏，其溫度下降速率為1－6℃/min。本發(fā)明利用－40℃～－20℃的低溫保存菌種，經(jīng)冷凍保存的液體菌種經(jīng)解凍活化，接種固體培養(yǎng)基后能正常萌發(fā)，可用于生產(chǎn)食用菌。本發(fā)明的食用菌液體菌種的低溫保存方法簡便易行，采用冷藏冰柜即可滿足要求，成本低、效益高，對菌種的前期培養(yǎng)條件沒有附加要求，凡是以液體培養(yǎng)方式得到的食用菌菌種均可以用本發(fā)明的方法保存，在實(shí)際生產(chǎn)中容易推廣使用。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1733899SQ20051009031
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者高振江, 吳薇, 馬浩, 張世湘 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)