專利名稱：海藻糖的發(fā)酵制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種海藻糖的發(fā)酵制備方法。其屬于生物技術(shù)、輕工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中的海藻糖(Trehalose)又名覃糖，存在于細(xì)菌、酵母菌、真菌以及一些昆蟲、脊椎動物和植物中。海藻糖不僅可以作為細(xì)胞碳源儲存物，而且可用作高效保護(hù)劑增加細(xì)胞組分對不良環(huán)境條件(如高溫、冷凍、脫水、高滲透壓和高酒精濃度)的抗性。海藻糖的這種保護(hù)特性使它在許多方面具有廣泛的應(yīng)用，如醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)中作為細(xì)胞防凍劑、作為化妝品的有效成分、作為診斷試劑和生物產(chǎn)品的穩(wěn)定劑。應(yīng)用海藻糖作為保護(hù)劑是目前其它種類的保護(hù)劑都不可能達(dá)到的效果，例如利用海藻糖作為診斷工具酶等生物試劑的穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，可置于常溫條件下干燥并保存，不僅簡化了生物試劑的制備過程，也給患者的疾病診治帶來便利。海藻糖還可以用作新鮮食品的防腐劑，還可應(yīng)用于研究用生物試劑的保存，例如各種工具酶、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、抗體、抗原及病毒等等，使得生命科學(xué)研究更為方便快捷有效。因此，致力于用廉價的方法生產(chǎn)海藻糖是生物技術(shù)、輕工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的科技人員的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的就是要提供一種發(fā)酵制備海藻糖(Trehalose)的方法。本發(fā)明由濟(jì)南地區(qū)空氣中分離得到扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11突變株的菌種保藏號為CGMCC No.1426，保藏日期為2005年7月25日。保藏機構(gòu)為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國科學(xué)院微生物研究所。
本發(fā)明采用YPD培養(yǎng)基蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，瓊脂2％，pH5.5；將該YPD平板暴露于空氣中，再在30℃下培養(yǎng)48小時，挑取單菌落，再在YPD平板上劃線純化，直到得到純種扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。取菌種在YPD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48h，檢測海藻糖含量，取海藻糖含量最高的為目的菌株。對目的菌株鑒定為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。經(jīng)化學(xué)誘變；篩選；將挑選出的突變株接入YPS培養(yǎng)基，兩次在30℃下振蕩培養(yǎng)后。用蒽酮法檢測各個突變株海藻糖積累量，并與野生型的海藻糖積累量作比較；挑選出海藻糖積累量較高的目的菌株。
本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案完成的，研制了一種海藻糖(Trehalose)的發(fā)酵制備方法。所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligerasdu)A11菌株CGMCC No.1426發(fā)酵產(chǎn)生的；所述的制備方法如下(1)制備種子液將菌種保藏號為CGMCC No.1426的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培養(yǎng)1-2天后，由斜面菌苔接種入裝有50ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)24-36小時，以培養(yǎng)好的菌懸液為種子液；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵將該A11菌株的菌懸液以6-16％接種量接種入裝有可溶性淀粉培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為25-35℃，通氣量為1.0-4.0∶1，攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm，培養(yǎng)pH5.3--5.7，隔4--6小時取樣在100℃烘干至恒重檢測菌體干重和測海藻糖含量，培養(yǎng)48--54小時后終止發(fā)酵，并將發(fā)酵液分離取菌體；(3)蒸餾水提取將分離的濕菌體按重量/體積比1∶4-12的投料比分次加入蒸餾水，并在75--85℃下水浴中提取，累計提取時間為28--32min，然后離心取濾液，棄去菌體；(4)超濾膜提取(3)步濾液中仍含有少量的可溶性多糖類和蛋白質(zhì)，采用截流分子量為5Kda的超濾膜超濾，以除去分子量較大的多糖類和蛋白質(zhì)物質(zhì)；(5)脫色將(4)步超濾液用201X7型陰離子樹脂柱和717型陽離子樹脂柱，上柱脫色，收集洗脫液；(6)真空濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮(5)步的洗脫液，檢測該濃縮液中的海藻糖含量在20--50％；(7)將(6)步的濃縮液在-50℃下直接冷凍干燥，得海藻糖晶體；該海藻糖是非還原性雙糖，其分子式為C12H22O11，含兩分子結(jié)晶水的相對分子量為378.33，溶解度10℃時為55.3，50℃時為140.1，90℃時為602.9；該糖的水溶液在37℃下可保存12個月，無色無嗅，口感略帶甜味；該糖不能使斐林試劑還原，也不能被α-糖苷酶水解，在強酸條件下能被水解為兩個葡萄糖分子；熱穩(wěn)定性在120℃的水中或在含蛋白質(zhì)溶液的沸水中，90min褐變。
所述的發(fā)酵罐裝有的可溶性淀粉培養(yǎng)基的組成如下豆粕水解液1.0--6.0％(w/v)，可溶性淀粉0.5--6.0％(w/v)，其余為水。
所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯類淀粉，或大米淀粉。
所述的YPD培養(yǎng)基的組成如下酵母膏(粉)0.5--2.0％(w/v)，葡萄糖1.0--3.0％(w/v)，蛋白胨1.0--3.0％(w/v)，其余為水。
本發(fā)明的優(yōu)點在于由于分離得到的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera sdu)A11突變株，其菌種保藏號為CGMCC No.1426，保藏日期為2005年7月25日。由于該菌種經(jīng)化學(xué)誘變技術(shù)，而獲得酸性和中性海藻糖酶活力大大降低的A11突變株，而且該突變株在可溶性淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體內(nèi)海藻糖的累積量較高。尤其重要的是用可溶性淀粉代替葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，節(jié)約了成本。又用價格便宜的豆餅粉水解液代替蛋白胨和酵母粉，使得海藻糖積累量達(dá)到了21.2％(W/W)。用玉米淀粉代替可溶性淀粉來生產(chǎn)海藻糖能使海藻糖的生產(chǎn)成本更低，A11突變株在1％(w/v)玉米淀粉培養(yǎng)基中發(fā)酵48小時菌體內(nèi)海藻糖的累積量達(dá)到22.89％(w/w)。本發(fā)明由于采用蒸餾水提取，將分離的濕菌體按重量/體積比1∶4-16的投料比分次加入蒸餾水，并在75--85℃下水浴中提取，累計提取時間為28--32min，然后離心取濾液，棄去菌體；其提取率在12.99％-16.49％。
具體實施例方式
本發(fā)明的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)由濟(jì)南市空氣中分離得到，采用YPD培養(yǎng)基(蛋白胨，2％；酵母粉，1％；葡萄糖，2％；瓊脂，2％；pH，5.5)分離，將YPD平板暴露于空氣中，在30℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落在YPD平板上劃線純化，直到得到純種酵母菌。取菌種在YPD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48h，檢測海藻糖含量，取海藻糖含量最高的為目的菌株。對目的菌株鑒定為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。
化學(xué)誘變1)將扣囊復(fù)膜酵母由斜面轉(zhuǎn)接入50ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)18小時，取適量培養(yǎng)液離心去上清液，菌體用無菌水離心洗滌三次后懸浮于誘變?nèi)芤?0.1M磷酸緩沖液，pH8.0，5％(v/v)EMS)中，30℃保溫30min后迅速離心去上清，洗滌菌體后用5％(w/v)硫代硫酸鈉處理15min，除去EMS的毒性。
2)誘變后的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)接入50ml YPD培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)18h，離心洗滌菌體后再轉(zhuǎn)接入內(nèi)含2.0％(w/v)海藻糖，20mg/1000ml賴氨酸的YNB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12小時。加入1mg/ml的制霉菌素100μl繼續(xù)振蕩1h。
3)取少量菌液，用美蘭染色，在顯微鏡下觀察，估計死菌和活菌的比例后用血球計數(shù)板計活菌數(shù)。
4)離心洗滌細(xì)胞，用無菌水稀釋細(xì)胞至適當(dāng)倍數(shù)后，涂布在YPD平板上，30℃下培養(yǎng)至長出單菌落。
篩選1)將長出的單菌落分別點種在YPD固體培養(yǎng)基和YNB固體培養(yǎng)基(內(nèi)含2.0％(w/v)海藻糖和20mg/1000ml Lys)上，挑選出在YPD平板上生長正常，在YNB平板上不長或生長緩慢的單菌落。
2)將挑選出的突變株點種在分別以淀粉、海藻糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖為唯一碳源的YNB固體培養(yǎng)基上，觀察生長情況，棄去在海藻糖以外的碳源上生長緩慢的菌株。
3)將挑選出的突變株接入50ml YPS培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接入100ml YPS培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)48h。用蒽酮法檢測各個突變株海藻糖積累量，并與野生型的海藻糖積累量作比較。挑選出海藻糖積累量較高的目的菌株。
本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于實施例中，利用發(fā)酵罐研究一種海藻糖(Trehalose)的發(fā)酵制備方法。所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera sdu)A11菌株CGMCC No.1426發(fā)酵產(chǎn)生的；所述的制備方法如下(1)制備種子液將菌種保藏號為CGMCC No.1426的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培養(yǎng)1-2天后，由斜面菌苔接種入裝有50ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)24-36小時，以培養(yǎng)好的菌懸液為種子液；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵將該A11菌株的菌懸液以8-12％接種量接種入裝有可溶性淀粉培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為28-32℃，通氣量(體積比)為1.0-4.0∶1，攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm，培養(yǎng)pH5.3-5.7，隔4-6小時取樣在100℃烘干至恒重檢測菌體干重和測海藻糖含量，培養(yǎng)48-54小時后終止發(fā)酵，并將發(fā)酵液分離取菌體；(3)蒸餾水提取將分離的濕菌體按重量/體積比1∶4-16的投料比分次加入蒸餾水，并在75-85℃下水浴中提取，累計提取時間為28-32min，然后離心取濾液，棄去菌體；(4)超濾膜提取(3)步濾液中仍含有少量的可溶性多糖類和蛋白質(zhì)，采用截流量為5Kda的超濾膜超濾，以除去分子量較大的多糖類和蛋白質(zhì)物質(zhì)；(5)脫色將(4)步超濾液用201X7型陰離子樹脂柱和717型陽離子樹脂柱，上柱脫色，收集洗脫液；(6)真空濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮(5)步的洗脫液，檢測該濃縮液中的海藻糖含量在20--50％；(7)將(6)步的濃縮液在-50℃下直接冷凍干燥，得海藻糖晶體；該海藻糖是非還原性雙糖，其分子式為C12H22O11，含兩分子結(jié)晶水的相對分子量為378.33，溶解度10℃時為55.3，50℃時為140.1，90℃時為602.9；該糖的水溶液在37℃下可保存12個月，無色無嗅，口感略帶甜味；該糖不能使斐林試劑還原，也不能被α-糖苷酶水解，在強酸條件下能被水解為兩個葡萄糖分子；熱穩(wěn)定性在120℃的水中或在含蛋白質(zhì)溶液的沸水中，90min褐變。
所述的發(fā)酵罐裝有的可溶性淀粉培養(yǎng)基的組成如下豆粕水解液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0％(w/v)；可溶性淀粉0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0％(w/v)；其余為水。
所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯類淀粉，或大米淀粉。
所述的YPD培養(yǎng)基的組成如下酵母膏(粉)0.5，1.0，2.0％(w/v)；葡萄糖1.0，2.0，3.0％(w/v)；蛋白胨1.0，2.0，3.0％(w/v)；其余為水。
本發(fā)明的具體發(fā)酵條件與結(jié)果見表1 本發(fā)明的最佳發(fā)酵工藝實例應(yīng)用玉米淀粉生產(chǎn)海藻糖，可得A11菌株積累海藻糖的最佳條件是培養(yǎng)基初始pH5.5，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量41/min，最佳碳源濃度為2.0％(w/v)的玉米淀粉，在這種最佳條件下，該突變株轉(zhuǎn)化玉米淀粉可以產(chǎn)生22.89％(w/w)的海藻糖，這是利用玉米淀粉直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖最高產(chǎn)量的酵母菌菌株，建立了利用玉米淀粉直接經(jīng)過產(chǎn)淀粉酶酵母菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖的工藝。
本發(fā)明的發(fā)酵法制備的海藻糖應(yīng)用實例(1)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)水稻、玉米雜交種子經(jīng)消毒后，用18～23mg/L海藻糖液在8～12℃下浸泡24h，浸泡后用蒸餾水沖洗，在30℃下鼓風(fēng)干燥至含水量與原料處理前相同。處理后貯存在濕度小于70％的環(huán)境下可長期保存。
(2)應(yīng)用于花卉栽培玫瑰花整枝浸泡在2～3％的海藻糖溶液中，15～18分鐘后取出，將其插入同濃度的海藻糖溶液中，在30～32℃的室內(nèi)環(huán)境下，25天后玫瑰花仍亭亭玉立，嬌艷如初。而用自來水處理的對照樣，保鮮期最多只能7天左右。
(3)應(yīng)用于提高雙岐桿菌的存活率保證其貨架壽命，采用海藻糖作保護(hù)劑，雙岐桿菌的存活率比脫脂牛奶提高一倍以上，特別令人振奮的是，海藻糖能夠使凍干雙岐桿菌在常溫下長期保持活性，大幅度延長活菌制劑的保質(zhì)期。從而可以解決活菌制劑行業(yè)所面臨的產(chǎn)品儲存性能差，貨架壽命短的問題。
(4)應(yīng)用于食品烘烤制品類在烘烤制品中應(yīng)用海藻糖能調(diào)節(jié)蛋糕和餅干、糕點上的糖霜、面包奶油和水果餡的甜味與芳香，不損害貯藏壽命，保持食品原有的風(fēng)味。同時，海藻糖能有助于甜餅、面包奶油和糖霜中脂肪的降低，在可口餅及快餐中產(chǎn)生獨特的糖霜感覺。在保持產(chǎn)品貯藏期時，海藻糖能減少多成份的烘烤制品中濕氣流動，以能使甜味更佳。
(5)應(yīng)用于糖果類與其它大多數(shù)增甜劑混合，海藻糖可在糖果特別是果汁飲料和藥草產(chǎn)品中使用，以調(diào)節(jié)產(chǎn)品甜度，從而能真正保持產(chǎn)品的原有風(fēng)味。這對成人消費者來說特別重要。海藻糖適用于用配方配制″益齒″產(chǎn)品。海藻糖極穩(wěn)定，工藝及加工產(chǎn)品中不被水解。海藻糖能用作糖果的外層而形成一種穩(wěn)定的非吸濕性保護(hù)層。由于工藝的穩(wěn)定性，海藻糖能在長期高溫下進(jìn)行而不用擔(dān)心水解和色變。滾海藻糖衣性能極好。海藻糖特有的溶解特性能真正使它們本身滾動形成保護(hù)層，這層履蓋物極穩(wěn)定、堅固，從而改善其它大多數(shù)增甜劑相對的白色層面。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對于上述實施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種海藻糖(Trehalose)的發(fā)酵制備方法，其特征在于所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株CGMCC No.1426發(fā)酵產(chǎn)生的；所述的制備方法如下(1)制備種子液將菌種保藏號為CGMCC No.1426的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培養(yǎng)1-2天后，由斜面菌苔接種入裝有50ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)24-36小時，以培養(yǎng)好的菌懸液為種子液；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵將該A11菌株的菌懸液6-16％接種量接種入裝有可溶性淀粉培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為25-35℃，通氣量為1.0-4.0∶1，攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm，培養(yǎng)pH5.3-5.7，隔4-6小時取樣在100℃烘干至恒重檢測菌體干重和測海藻糖含量，培養(yǎng)48-54小時后終止發(fā)酵，并將發(fā)酵液分離取菌體；(3)蒸餾水提取將分離的濕菌體按重量/體積比1∶4-12的投料比分次加入蒸餾水，并在75-85℃下水浴中提取，累計提取時間為28-32min，然后離心取濾液，棄去菌體；(4)超濾膜提取(3)步濾液中仍含有少量的可溶性多糖類和蛋白質(zhì)，采用截流量為5Kda的超濾膜超濾，以除去分子量較大的多糖類和蛋白質(zhì)物質(zhì)；(5)脫色將(4)步超濾液用201X7型陰離子樹脂柱和717型陽離子樹脂柱，上柱脫色，收集洗脫液；(6)真空濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮(5)步的洗脫液，檢測該濃縮液中的海藻糖含量在20--50％；(7)將(6)步的濃縮液在-50℃下直接冷凍干燥，得海藻糖晶體；該海藻糖是非還原性雙糖，其分子式為C12H22O11，含兩分子結(jié)晶水的相對分子量為378.33，溶解度10℃時為55.3，50℃時為140.1，90℃時為602.9；該糖的水溶液在37℃下可保存12個月，無色無嗅，口感略帶甜味；該糖不能使斐林試劑還原，也不能被α-糖苷酶水解，在強酸條件下能被水解為兩個葡萄糖分子；熱穩(wěn)定性在120℃的水中或在含蛋白質(zhì)溶液的沸水中，90min褐變。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述海藻糖(Trehalose)的發(fā)酵制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐裝有的可溶性淀粉培養(yǎng)基的組成如下豆粕水解液1.0-6.0％(w/v)，可溶性淀粉0.5-6.0％(w/v)，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述海藻糖(Trehalose)的發(fā)酵制備方法，其特征在于所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯類淀粉，或大米淀粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述海藻糖(Trehalose)的發(fā)酵制備方法，其特征在于所述的YPD培養(yǎng)基的組成如下酵母膏(粉)0.5-2.0％(w/v)，葡萄糖1.0-3.0％(w/v)，蛋白胨1.0-3.0％(w/v)，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明是海藻糖的發(fā)酵制備方法，該糖是由扣囊復(fù)膜酵母A11菌株，其菌種保藏號為CGMCC No.1426，保藏日期為2005年7月25日；而發(fā)酵產(chǎn)生的。其制備方法如下(1)制備種子液；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵；(3)蒸餾水提??；(4)超濾膜提??；(5)脫色；(6)真空濃縮；(7)將(6)步的濃縮液冷凍干燥，得海藻糖晶體。本發(fā)明由于用可溶性淀粉或用玉米淀粉代替葡萄糖發(fā)酵，節(jié)約了成本，使得海藻糖積累量達(dá)到了22.89％。本發(fā)明由于采用蒸餾水提取，提取率在12.99％－16.49％。該海藻糖具有較高的熱穩(wěn)定性。其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、花卉栽培；用于提高雙岐桿菌的存活率保證其貨架壽命的保護(hù)劑；用于食品烘烤制品類；用于糖果類與其它大多數(shù)增甜劑混合；用于配制“益齒”產(chǎn)品；具有積極的工業(yè)實用性。
文檔編號C12R1/85GK1740333SQ200510044578
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月18日
發(fā)明者王祥紅, 池振明 申請人:中國海洋大學(xué)