專利名稱：畜禽用三元活性微生態(tài)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜禽用飼料添加劑，進一步是指用做所述添加劑的畜禽用三元活性微生態(tài)制劑。
背景技術(shù)：
抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用，為世界畜牧業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)，然而也帶來了極大的隱患第一，引起內(nèi)源性感染和二重感染；第二，使畜禽機體免疫力下降，細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，并通過質(zhì)粒發(fā)生傳遞，可轉(zhuǎn)移到人體，威脅人類身體健康；第三，化學(xué)殘留會污染肉、蛋、奶，降低畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，世界發(fā)達(dá)國家已于1989年開始全面禁止抗生素在飼料中的應(yīng)用。
為了克服抗生素的各種弊端，世界各國先后開展了無毒副作用、無殘留的綠色飼料添加劑的研究，而在其研究與開發(fā)過程中，首選研究的是微生態(tài)制劑。微生態(tài)制劑是一種含有大量有益菌及其代謝產(chǎn)物和生長促進因子，并且有維持腸道微生態(tài)平衡、提高機體健康水平的活菌制劑。免疫球蛋白是動物機體產(chǎn)生的抗感染物質(zhì)，近年來，國外研究證明，在日糧中添加多克隆抗體，可以預(yù)防仔豬和牛犢的大腸桿菌腹瀉癥。美國食品和藥品管理局于1996年將卵黃免疫球蛋白(Igy)列入“一般公認(rèn)安全物質(zhì)”范疇，德國于1995年批準(zhǔn)將其用于飼料添加劑。
微生態(tài)制劑這種新型的生物產(chǎn)品，雖然正在以其獨特的功能影響日益發(fā)展的畜牧業(yè)，但還存在許多有待進一步研究問題第一，針對性不強，不如抗生素那樣可針對某種腸道疾病而采用相應(yīng)的產(chǎn)品，針對性很強地進行治療；第二，微生態(tài)制劑菌株的穩(wěn)定性不高，如活菌劑的抗熱性、耐酸性等抵抗外界不良環(huán)境的能力低；第三，微生態(tài)制劑產(chǎn)品的貨架期不長，隨著貯存期的增加，活菌數(shù)量逐步降低。
從國外開發(fā)和使用效果看，復(fù)合菌制劑較單一菌劑作用效果更好，復(fù)合菌制劑一般都具有協(xié)同作用。為了提高微生態(tài)制劑的有效性，人們正著力于微生態(tài)制劑輔助劑的研制與開發(fā)。如對低聚寡糖與活菌制劑復(fù)合添加的試驗，取得一定效果；同時也在開發(fā)和研究活菌劑與其他制劑間的聯(lián)合作用。目前國外還在研究通過基因工程技術(shù)，把一些有用的外源基因?qū)牖罹苿┑木N中，擴大其生物學(xué)特殊功能，從而達(dá)到一種制劑多種功能的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種畜禽用三元活性微生態(tài)制劑，它將活菌制劑、低聚寡糖、抗體球蛋白有機地結(jié)合起來，以充分發(fā)揮抗體球蛋白的特異性免疫功能和活菌劑、低聚寡糖的非特異性免疫功能，以提高了微生態(tài)制劑的針對性；還可采用低溫真空冷凍干燥技術(shù)，將活菌劑制成干粉，使活菌處于休眠狀態(tài)，以提高微生態(tài)制劑的穩(wěn)定性；還可采用微膠囊包埋技術(shù)，將三元活性制劑包埋起來，以延長微生態(tài)制劑的貨架期。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，所述畜禽用三元活性微生態(tài)制劑的重量份組成是活菌制劑 94％-98％；低聚寡糖 0.1％-1％；卵黃免疫球蛋白 1％-5％；
其中，所述活菌制劑由植物乳桿菌液、酵母菌液、芽孢桿菌液按1∶0.9-1.1∶0.9-1.1之重量比組成，且每克植物乳桿菌液中含植物乳桿菌≥8×108個，每克酵母菌液中含酵母菌≥7×108個，每克芽孢桿菌液中含芽孢桿菌≥4×108個。
以下對本發(fā)明做出進一步說明。
所述低聚寡糖可以是低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露中的一種，也可以是其它低聚寡糖。
本發(fā)明可以上述三元活性微生態(tài)制劑的有效成份為芯材，以下述重量份成分的均勻混合物為壁材變性淀粉35％-45％；阿拉伯膠10％-20％；麥芽糊精20％-30％；玉米糖槳15％-25％；將上述芯材與壁材按1∶0.9-1.1之重量比混合均質(zhì)后，經(jīng)常規(guī)低溫噴霧工藝制成微膠囊狀態(tài)產(chǎn)品。
本發(fā)明中，所述活菌制劑可采用如下重量份組分的培養(yǎng)基主體碳源 5％-9％； 葡萄糖 1％-3％；蛋白胨 0.4-0.6％； 植物油 0.2-0.4％；K2HPO40.1-0.3％； CaCo31％-3％；MgSO40.05-0.07％； MnSO40.02-0.03％；水 84％-90％；其中，所述主體碳源為土豆粉、大豆粉、玉米粉中的一種，并植入相應(yīng)菌種，每克菌液中的菌種含量是植物乳桿菌≥8×108個、酵母菌≥7×108個、芽孢桿菌≥4×108個。
本發(fā)明中，豬用三元活性微生態(tài)制劑主體碳源可采用土豆粉，雞用三元活性微生態(tài)制劑主體碳源可采用大豆粉，反芻動物三元活性微生態(tài)制劑主體碳源可采用玉米粉。
本發(fā)明對所述植物乳桿菌(PC0586-2)、枯草芽孢桿菌(BL0067)、產(chǎn)朊假絲酵母菌(2.120)進行了單一菌株培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)初始PH值、需氧量、培養(yǎng)基組成等生產(chǎn)工藝參數(shù)進行了研究，并且對它們的復(fù)合培養(yǎng)進行工藝參數(shù)的修正。結(jié)果表明三種菌達(dá)到產(chǎn)量最高值的時間是48-54小時，酵母菌的發(fā)酵最適溫度為32℃，芽孢桿菌為38℃，乳酸菌為36℃，最適溫度各不相同，因此，復(fù)合培養(yǎng)時，分兩階段進行，第一階段溫度32℃，第二階段溫度31℃，時間各半(28小時)。三種菌的最初培養(yǎng)PH值分別為乳酸菌5.6，酵母菌5.8，芽孢桿菌6.0。因此，復(fù)合發(fā)酵時PH值要控制在6.0左右。三種菌發(fā)酵過程的需氧量各不相同，乳酸菌是以厭氧呼吸為主的兼性菌，酵母菌和芽孢桿菌是好氧呼吸的菌種。因此，復(fù)合培養(yǎng)分兩步進行，第一階段(前28小時)培養(yǎng)時，通氣1小時停2小時，第二階段通氣2小時停1小時。
本發(fā)明中，所述植物乳桿菌、酵母菌、芽孢桿菌可采用標(biāo)準(zhǔn)菌株，也可通過以下菌種分離篩選獲得取畜禽腸道或土壤樣品，稀釋后通過富集馴化培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、平板(劃線)分離培養(yǎng)、菌落采集、純化繼代分離培養(yǎng)、生產(chǎn)試驗培養(yǎng)、定性定量分析等步驟，從126份豬腸、雞腸、牛瘤胃樣品，近2萬株菌株中，分離篩選出一株高產(chǎn)乳酸的植物乳桿菌(暫編號為PC0586)乳酸產(chǎn)量90.7g/L，比標(biāo)準(zhǔn)菌株(中國科學(xué)院微生物菌種保存中心提供，乳酸產(chǎn)量為78g/L)乳酸產(chǎn)量高16％。從27份土壤樣品，近4000株菌株中，分離篩選出一株抑菌能力很強的枯草芽孢桿菌變異株，暫編號為BL0067。與標(biāo)準(zhǔn)菌株(中國科學(xué)院微生物菌種保存中提供)比較，抑菌能力提高31％。
本發(fā)明還可采用紫外對上述育出的植物乳桿菌PC0586進行誘變處理，處理劑量為成活率1％以下。紫外線波長為260nm左右，紫外燈功率為15W，距離固定在樣品30nm高處。誘變時間0-72h。從2000余份材料中，選育出一株高產(chǎn)乳酸的植物乳桿菌，乳酸產(chǎn)量達(dá)到了130g/L，對糖的轉(zhuǎn)化率為86％-90％，而且表現(xiàn)較好的遺傳穩(wěn)定性。該菌株暫定名為PC0586-1。
本發(fā)明還可用基因工程對所述菌種進行遺傳改良。其中，轉(zhuǎn)體高產(chǎn)賴氨酸的棒桿菌(AS1.536)由中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心提供，各種DNA的內(nèi)切酶、賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因二氫吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)由湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物研究室提供；受體可采用誘變育種選育出的植物乳桿菌PC0586-1。載體大腸桿菌。利用重組DNA的基因工程技術(shù)將棒桿菌(AS1.563)賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因-二氫吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)，采用隨機整合法，以大腸桿菌作為載體，成功地導(dǎo)入了目標(biāo)菌株植物乳桿菌PC0586-1，培養(yǎng)出一株基因工程菌株，暫編號為PC0586-2。結(jié)果表明，外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率高，能在目標(biāo)菌中長期保存，且高水平表達(dá)。使無蛋白質(zhì)分解酶的植物乳桿菌能合成賴氨酸，并且產(chǎn)量達(dá)到了27g/L，應(yīng)用到生產(chǎn)中，起到了既高產(chǎn)乳酸，又能產(chǎn)生賴氨酸的雙重作用。
微生態(tài)制劑是近十年來研制開發(fā)的一種新型生物制劑，目前國內(nèi)外大多還都是單元的活菌制劑，典型代表是日本流球大學(xué)研究開發(fā)的“EM原露”，已在日本歐美和我國廣泛推廣應(yīng)用。在此，本發(fā)明與“EM原露”的各項技術(shù)指標(biāo)比較如下1.同源性比較本發(fā)明產(chǎn)品中的菌種來源之一為來源于畜禽腸道，制成三元活性制劑添加于飼料中，取食后再返回畜禽腸道，由于有良好的同源性，提高了微生物在禽畜腸道內(nèi)的定植能力。而以“EM原露”為代表的其他微生態(tài)制劑菌種大都來源于土壤，在畜禽腸道內(nèi)的定植能力低于本發(fā)明產(chǎn)品。
2.針對性的比較表1三元活性制劑(本發(fā)明)與EM原露針對性的比較

從上述比較結(jié)果可以看出，“EM原露”含有80個菌種，可用于動物飼料，也可作植物的生物肥料，其廣普性好、針對性差；而三元活性制劑中含有針對大腸桿菌和沙門氏桿菌的抗體球蛋，具有特異的免疫功能，針對性強。
3.熱穩(wěn)定性比較將本發(fā)明的三元活性制劑和EM原露采取了70℃高溫處理10分鐘，結(jié)果表明，三元活性制劑中的活菌成活率高達(dá)88.7％，比EM原露(41.5％)提高了一倍多。
表2三元活性制劑(本發(fā)明)與EM原露的熱稱定性比較

4.酸穩(wěn)定性比較畜禽取食后，微生態(tài)制劑在動物的胃內(nèi)被大量的胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶殺滅或被消化，能夠達(dá)到腸道的活菌數(shù)量會大量降低。本發(fā)明進行了三元活性制劑與EM原露的模擬胃液試驗。
模擬胃液組成胃酸10％、胃蛋白酶1％、胰蛋白酶0.1％、胰凝乳蛋白酶0.05％、PH值4.0-5.0、時間1-8h。
表3三元活性制劑(本發(fā)明)與EM原露胃酸穩(wěn)定性比較

從表3可以看出，三元活性制劑抗抵胃酸的能力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EM原露，經(jīng)模擬胃液處理6小時后，三元活性制劑中的活菌率還有41.0％，比EM原露提高4倍，處理7小時后，EM原露中已不存在活菌了，而三元活性制劑還有37.6％的活菌存活率。
5.抑菌能力的比較表4三元活性制劑與EM原露抑菌能力的比較

從表4可以看出，三元活性制劑和EM原露都對腸道內(nèi)的有害菌表現(xiàn)出抑制作用，而對有益菌不表現(xiàn)抑制作用。從抑菌能力上比較，三元活性制劑對大腸桿菌的抑制能力(抑菌圈直徑27.3mm)是EM原露(抑菌圈直徑10.6)的2.5倍。
6.貨架期的比較表5三元活性制劑與EM原露貨架期的比較

從表5的結(jié)果可以看出，三元活性制劑經(jīng)過6個月的貨架期后，活菌成活率仍然達(dá)到了89.8％，而EM原露經(jīng)過6個月貯存后，活菌成活率只有61.1％。三元活性制劑貨架貯存能力提高了45％。
由以上可知，本發(fā)明為畜禽用三元活性微生態(tài)制劑，它將活菌制劑、低聚寡糖、抗體球蛋白有機地結(jié)合起來，充分發(fā)揮了抗體球蛋白的特異性免疫功能和活菌劑、低聚寡糖的非特異性免疫功能，提高了微生態(tài)制劑的針對性；還采用了低溫真空冷凍干燥技術(shù)，將活菌劑制成干粉，使活菌處于休眠狀態(tài)，提高了微生態(tài)制劑的穩(wěn)定性；還采用了微膠囊包埋技術(shù)，將三元活性制劑包埋起來，延長了微生態(tài)制劑的貨架期。
具體實施例方式
實施例1三元活性微生態(tài)制劑的重量份組成是主體碳源用土豆粉培養(yǎng)的活菌制劑98％、低聚木糖1％、卵黃免疫球蛋白(320滴讀/g)1％；其中，所述活菌制劑由植物乳桿菌液、酵母菌液、芽孢桿菌液按1∶1∶1之重量比組成，且每克植物乳桿菌液中含植物乳桿菌≥8×108個，每克酵母菌液中含酵母菌≥7×108個，每克芽孢桿菌液中含芽孢桿菌≥4×108個；以上述三元活性微生態(tài)制劑的有效成份為芯材，以下述重量份成分的均勻混合物為壁材變性淀粉45％、阿拉伯膠20％、麥芽糊精20％、玉米糖槳15％；將上述芯材與壁材按1∶1之重量比混合均質(zhì)后，經(jīng)常規(guī)低溫(-5℃)噴霧工藝制成微膠囊狀態(tài)產(chǎn)品。產(chǎn)品應(yīng)用地點湖南省桃源縣畜禽良種場對象28日齡二元雜交(長×大)斷奶仔豬時間28天(2005年5月1日-2005年5月28日)日糧組成岳陽九鼎SH112型乳豬濃縮料分組和飼養(yǎng)試驗組12頭，對照組15頭，每日喂料2次。
應(yīng)用結(jié)果表6三元活性制劑的應(yīng)用效果

從表6可以看出，試驗組比對照組每日多增重196.78克，比對照提高了65％，料肉比降低了0.22，飼料轉(zhuǎn)化率提高了12.02％，腹瀉率比對照降低了3倍，成活率提高了20％，每增加一公斤體重，純收入增加1.73元。
實施例2三元活性微生態(tài)制劑的重量份組成是主體碳源用大豆粉培養(yǎng)的活菌制劑的重量份組成是活菌制劑94％、低聚果糖1％、卵黃免疫球蛋白(320滴讀/g)5％；其中，所述活菌制劑由植物乳桿菌液、酵母菌液、芽孢桿菌液按1∶0.9∶1之重量比組成，且每克植物乳桿菌液中含植物乳桿菌≥8×108個，每克酵母菌液中含酵母菌≥7×108個，每克芽孢桿菌液中含芽孢桿菌≥4×108個。以上述三元活性微生態(tài)制劑的有效成份為芯材，以下述重量份成分的均勻混合物為壁材變性淀粉35％、阿拉伯膠10％、麥芽糊精30％、玉米糖槳25％；將上述芯材與壁材按1∶0.9之重量比混合均質(zhì)后，經(jīng)常規(guī)低溫(0--10℃)噴霧工藝制成微膠囊狀態(tài)產(chǎn)品。
實施例3三元活性微生態(tài)制劑的重量份組成是主體碳源用玉米粉培養(yǎng)的活菌制劑的重量份組成是活菌制劑96％、低聚甘露0.1％、卵黃免疫球蛋白3.9％；其中，所述活菌制劑由植物乳桿菌液、酵母菌液、芽孢桿菌液按1∶1∶0.9之重量比組成，且每克植物乳桿菌液中含植物乳桿菌≥8×108個，每克酵母菌液中含酵母菌≥7×108個，每克芽孢桿菌液中含芽孢桿菌≥4×108個。以上述三元活性微生態(tài)制劑的有效成份為芯材，以下述重量份成分的均勻混合物為壁材變性淀粉40％、阿拉伯膠15％、麥芽糊精25％、玉米糖槳20％；將上述芯材與壁材按1∶1.1之重量比混合均質(zhì)后，經(jīng)常規(guī)低溫(-20℃)噴霧工藝制成微膠囊狀態(tài)產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種畜禽用三元活性微生態(tài)制劑，其特征是，它的重量份組成是活菌制劑 94％-98％；低聚寡糖 0.1％-1％；卵黃免疫球蛋白1％-5％；其中，所述活菌制劑由植物乳桿菌液、酵母菌液、芽孢桿菌液按1∶0.9-1.1∶0.9-1.1之重量比組成，且每克植物乳桿菌液中含植物乳桿菌≥8×108個，每克酵母菌液中含酵母菌≥7×108個，每克芽孢桿菌液中含芽孢桿菌≥4×108個。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽用三元活性微生態(tài)制劑，其特征是，以所述成份為芯材，以下述重量份成分的均勻混合物為壁材變性淀粉 35％-45％；阿拉伯膠 10％-20％；麥芽糊精 20％-30％；玉米糖槳 15％-25％；將上述芯材與壁材按1∶0.9-1.1之重量比混合均質(zhì)后，經(jīng)常規(guī)低溫噴霧工藝制成微膠囊狀態(tài)產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽用三元活性微生態(tài)制劑，其特征是，所述低聚寡糖為低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露中的一種。
全文摘要
一種用作飼料添加劑的畜禽用三元活性微生態(tài)制劑，其重量份組成是活菌制劑94％－98％、低聚寡糖0.1％－1％、卵黃免疫球蛋白1％－5％；所述活菌制劑由植物乳桿菌液、酵母菌液、芽孢桿菌液按1∶0.9－1.1∶0.9－1.1之重量比組成，且每克植物乳桿菌液中含植物乳桿菌≥8×10
文檔編號C12N9/54GK1903058SQ20051003192
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者羅赫榮, 龔章霞, 張秋勝, 梁志懷 申請人:湖南中業(yè)科技發(fā)展有限公司