專利名稱：魚類精子冷凍保存的實用化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于低溫生物學(xué)中的動物精子超低溫冷凍保存技術(shù)，是一種在超低溫狀態(tài)(-196℃)中長期保存魚類精子的實用化技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
種質(zhì)資源是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)、優(yōu)良品種培育及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國是一個水生生物種質(zhì)資源較為豐富的國家，豐富多樣的水生生物種質(zhì)資源和遺傳多樣性對于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展起到了非常重要的作用。然而，由于漁業(yè)資源的過度捕撈、無序利用等，造成了某些魚類資源的衰退和瀕臨滅絕，如長江鰣、松江鱸等。如果不及時采取保護措施，若干年后，在自然界中將難以找到許多魚類原種、良種的遺傳資源。因此，借助低溫生物學(xué)技術(shù)，建立重要養(yǎng)殖魚類原種和良種及珍稀瀕危魚類的配子和胚胎冷凍庫，將這些魚類的種質(zhì)資源和遺傳多樣性以活的形式長期保存起來，已成為魚類遺傳多樣性保護和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中亟待攻克的重要科技問題。
精子冷凍保存技術(shù)作為長期保存動物種質(zhì)的一種方法，在防止魚類物種滅絕以及魚類遺傳育種、魚類育苗等方面都顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。盡管國際上自七十年代開始，開展了鮭鱒魚類、鯉科魚類等淡水魚類以及某些海水魚類精液冷凍保存的研究工作，但精子冷凍保存技術(shù)存在著凍精活率不夠高、受精率不高、凍精保存量小、達不到實用化水平等諸多問題。魚類精子低溫保存研究還處于實驗階段，保存的精子量小，難以滿足漁業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)保存的需要。如國內(nèi)洪萬樹等(1996)曾作過鱸魚精子冷凍保存的研究，但未作授精試驗來檢驗精子的凍存效果。在國外魚類精子冷凍保存方面，Dreanno等(1997)曾用0.25ml麥管作為凍存容器進行了大菱鲆精子冷凍保存的研究，但獲得的凍精受精率僅為58％，未報道凍精受精魚苗的孵化率，同時該文報道的方法保存量小，無法滿足精子庫構(gòu)建的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了建立鯉科魚類和重要海水養(yǎng)殖魚類精子批量化冷凍保存的技術(shù)方法，為魚類種質(zhì)保存、遺傳多樣性保護、遺傳育種和漁業(yè)生產(chǎn)提供實用化技術(shù)方法。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的它的精子冷凍保存技術(shù)方法包括精子采集、精子冷凍保存稀釋液的配制、抗凍劑的選用、精子的稀釋與平衡、精子的分裝與冷凍、冷凍精液的解凍與授精。
1、精子采集用毛巾擦干成熟雄魚生殖孔區(qū)域，輕壓腹部，用吸管收集擠出的精液。置于干凈的小瓶中。精液置冰上短期保存，鏡檢后將成活率在80％以上的精液用于保存。
2、精子冷凍保存稀釋液的配制淡水鯉科魚類(如青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊等)精液稀釋液為D-15，其配方為NaCl 135-136.75mM，KCl 6-6.71mM和葡萄糖83-83.33mM；海水魚類大菱鲆精子稀釋液為TS-2，其配方為Tris-Cl 9-11mM，pH 8.0，蔗糖105-115mM，KHCO395-105mM，9-11％胎牛血清(體積比)。鱸魚、牙鲆和石鰈精子稀釋液為MPRS，其配方為NaCl 59.35-61.35mM，NaH2PO41.70-1.90mM，NaHCO32.5-3.5mM，KCl 4.73-5.73mM mM，CaCl2·2H2O 0.63-1.63mM，MgCl2·6H2O 0.63-1.63mM，D-Glucose 50.55-60.55mM。
3、選用抗凍劑上述魚類精子冷凍保存抗凍劑為DMSO，其適宜濃度為8-10％。
4、精子的稀釋與平衡青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊、鱸魚、牙鲆及石鰈精液與在4℃冰箱中預(yù)冷的稀釋液按(體積比)1∶1或1∶2的比例混合后，于4℃冰箱平衡20-30min。而大菱鲆精液則稀釋后直接冷凍，無需平衡期。
5、精子的分裝與冷凍將平衡好的精液稀釋液以1.0-4.5ml分裝于2-5ml凍存管，按照三步降溫模式進行冷凍保存。即在液氮面上方6厘米處平衡10min，在液氮面上平衡5min，然后投入液氮中保存。最佳降溫速率是31℃/min(從16℃到-15℃)和18.6℃/min(從-12℃到-180℃)。
6、冷凍精液的解凍與授精解凍時，先將凍存管從液氮中提出置于液氮蒸氣中平衡5分鐘，然后從液氮罐中拿出，放在37℃水浴中快速解凍。凍精解凍后與鮮卵進行人工授精，做法為將冷凍精液倒于卵子上，攪拌混勻，加少許淡水(鯉科魚類精子)或海水(海水魚類精子)激活精子，使之與卵子受精。授精后將受精卵置于孵化器中孵化。
實施方式一、以海水魚類大菱鲆和鱸魚精液超低溫冷凍保存為例，對本發(fā)明的
1.大菱鲆精液冷凍保存實施例(1)輕壓成熟大菱鲆雄魚腹部，同時用吸管收集無尿污的精液，在顯微鏡下鏡檢。鏡檢方法為用牙簽蘸取少許精子于載玻片上，然后自然海水激活，并立即在顯微鏡下觀察。精子的成活率為精液激活后顯微鏡視野中運動精子占總精子數(shù)的百分率。成活率在85％以上的精液用于實驗。
(2)采集后的大菱鲆精子按1∶2(體積比)比例直接稀釋在4℃下預(yù)冷的含15％DMSO(體積比)的TS-2中，TS-2成分為Tris-Cl 10mM，pH 8.0，蔗糖110mM，KHCO3100mM，胎牛血清15％(體積比)。
(3)精液-稀釋液混合液無需在4℃平衡，分裝于2毫升凍存管(每管1.5ml混合液)后，直接冷凍。
(4)按三步法進行冷凍，即先將凍存管置于液氮面上方6厘米處平衡10min，然后在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中保存。
(5)大菱鲆精子在液氮中保存1天-1年后解凍以檢驗精子冷凍保存效果或用于授精實驗，解凍時，凍存管首先在液氮蒸汽中平衡5分鐘，接著在37℃水浴中快速解凍，直至凍存管中的精子全部融化，期間所需要的時間為1.5-2min。鏡檢發(fā)現(xiàn)，凍精活率都在70％以上。
(6)在精卵比分別是1000∶1，2000∶1和5000∶1時，分別做凍精和鮮精的授精實驗，以檢驗在各種精卵比的情況下，凍精的受精率與鮮精的也沒有顯著差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精卵比為1000∶1時，凍精的受精率是47.9％±0.35，鮮精的為56.4％±2.33，沒有顯著差異。當精卵比是5000∶1，凍精的受精率是52.1％±0.84，鮮精的是58.9％±16.0，也沒有顯著差異。
為證實凍存的大菱鲆精子能應(yīng)用于實際生產(chǎn)，我們共作了7次大量授精實驗(所用的大菱鲆卵量在100-440ml之間，凍精(精液-稀釋液的混合液)量在1.5-8ml之間，結(jié)果表明，凍精和鮮精在受精率和孵化率上都沒有顯著差異，孵化的魚苗都達到了實際生產(chǎn)中量的要求。下面以其中一次來說明，用1管凍精(1.5ml)與240ml大菱鲆卵授精。凍精的受精率和孵化率分別為76.5％和55.5％，而鮮精對照組為76.5％和44.2％，兩組之間無顯著差異。
2.鱸魚精液冷凍保存實施例
(1)鱸魚精液也是用輕壓成熟雄魚腹部的方法來采集，質(zhì)量評價方法同前，成活率高于80％的鱸魚精子用于冷凍和授精實驗。
(2)將收集的鱸魚精液按1∶1(體積比)比例稀釋在4℃預(yù)冷的含20％DMSO(體積比)的稀釋液中，稀釋液配方名稱為MPRS，組成為NaCl60.35mM，NaH2PO41.80mM，NaHCO33.00mM，KCl 5.23mM CaCl2·2H2O1.13mM，MgCl2.6H2O 1.13mM，D-Glucose 55.55mM.鱸魚精液-稀釋液的混合液在4℃下平衡30min后用于冷凍保存實驗。
(3)平衡30min后的鱸魚精液-稀釋液混合液分裝于2毫升凍存管(每管1.5ml)后立即冷凍，冷凍時，先將凍存管置于液氮面上方6厘米處平衡10min，然后在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中保存。
(4)鱸魚精子在液氮中保存1天-1年后解凍，解凍時先將凍存管從液氮中提出置于液氮蒸氣中平衡5分鐘，接著在37℃水浴中快速解凍。多次鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凍精成活率在70-80％之間。
(5)鱸魚凍精在液氮中保存三天后，解凍授精，當精卵比為20000∶1，40000∶1，80000∶1和320000∶1時，凍精受精率和孵化率與鮮精的都沒有顯著差異。鱸魚精子在液氮中保存一年后，解凍授精，在各種精卵比的情況下，凍精受精率與鮮精的也沒有顯著性差異。說明凍精是完全可以在液氮中長期保存的。
(6)鱸魚凍精大量授精實驗結(jié)果。用在液氮中保存一年的3.5ml鱸魚凍精與230ml鱸魚卵授精，授精后在原腸中期計算受精率，凍精的受精率達84％，孵化率達90％，與鮮精對照組(96.8％±2.3和87.2％±3.1)無顯著差異。
二、以淡水魚類草魚精液超低溫冷凍保存為例，對本發(fā)明的實施方式進行說明
(1)配子收集在草魚人工繁殖盛期，擠壓成熟雄魚的腹部，用吸管收集草魚精液。草魚卵也是通過輕壓成熟雌魚腹部的方式獲得。
(2)精液稀釋在稀釋液中添加20％DMSO后，放在4℃下預(yù)冷，再將采集的精液與上述混合物以1∶1的比例稀釋。所用的稀釋液是D-15，其成分是NaCl 136.75mM，KCl 6.71mM和葡萄糖83.33mM。稀釋后的精液在4℃冰箱中平衡20min后冷凍。
(3)精子冷凍及解凍精液-稀釋液的混合液分裝于2ml凍存管(每管1.5ml)后，首先置液氮面上方6cm處平衡10min，接著在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中。草魚精子在液氮中保存2天-2年后解凍。解凍時先將凍存管在液氮蒸汽中平衡5min，然后在37℃水浴中快速解凍。
(4)在液氮中保存2天的草魚精子授精結(jié)果用在液氮中保存2天的1ml草魚凍精與15ml卵授精，凍精組受精率和孵化率分別是90.2％±4.7，90％±10，對照組為98％±3.2和91％±4.5。兩者無顯著性差異。
(5)在液氮中保存2年的草魚精子授精結(jié)果用在液氮中保存2年的1ml草魚凍精與15ml卵授精，凍精組受精率是73.％±3.1，鮮精組的為88.5％±0.6，兩者差異不顯著。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點是(1)稀釋液配方組成較為簡單，試劑來源方便；(2)建立了三步降溫冷凍模式，冷凍保存效果穩(wěn)定、可靠，操作簡單方便，易于推廣；(3)單管精子凍存量從原來的0.25ml麥管增加到1.8ml凍存管，適合于建立精子冷凍庫和在漁業(yè)生產(chǎn)、遺傳育種和種質(zhì)保存中推廣應(yīng)用；(4)本發(fā)明建立的技術(shù)在所試驗的10多種魚類中都獲得穩(wěn)定的結(jié)果，凍精活率穩(wěn)定在65％以上，受精率和孵化率都達到鮮精的水平。
權(quán)利要求
1.一種魚類精子超低溫冷凍保存的實用化方法，其特征在于它的技術(shù)操作方法是，包括魚類精子采集、精子冷凍保存稀釋液的配制、選用抗凍劑、精子的稀釋與平衡、精子的分裝與冷凍、冷凍精液的解凍與授精精液采集用毛巾擦干成熟雄魚生殖孔區(qū)域，輕壓腹部，用吸管收集擠出的精液。置于干凈的小瓶中。精液置冰上短期保存，鏡檢后將成活率在80％以上的精液用于保存。精子冷凍保存稀釋液的配制淡水鯉科魚類(包括青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊等)精液稀釋液為D-15，其配方為NaCl 135-136.75mM，KCl 6-6.71mM和葡萄糖83-83.33mM；海水魚類大菱鲆精子稀釋液為TS-2，其配方為Tris-Cl 9-11mM，pH8.0，蔗糖105-115mM，KHCO395-105mM，9-11％胎牛血清(體積比)；鱸魚、牙鲆和石鰈精子稀釋液為MPRS，其配方為NaCl 59.35-61.35mM，NaH2PO41.70-1.90mM，NaHCO32.5-3.5mM，KCl 4.73-5.73mM，CaCl2·2H2O 0.63-1.63mM，MgCl2·6H2O 0.63-1.63mM，D-Glucose 50.55-60.55mM。選用的抗凍劑為DMSO，其適宜濃度為8-10％；精子的稀釋與平衡青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊、鱸魚、牙鲆及石鰈精液與在4℃冰箱中預(yù)冷的稀釋液按1∶1或1∶2(體積比)的比例混合后，于4℃冰箱平衡20-30min后進行冷凍。而大菱鲆精液則稀釋后直接冷凍，無需平衡期。精子的分裝與冷凍將平衡好的精液、稀釋液1.0-1.8ml分裝于2ml凍存管，按照三步降溫模式進行冷凍保存。即在液氮面上方6厘米處平衡10min，在液氮面上平衡5min，然后投入液氮中保存。最佳降溫速率是31℃/min(16℃到-15℃)和18.6℃/min(從-12℃到-180℃)。冷凍精液的解凍與授精解凍時，先將凍存管從液氮中提出置于液氮蒸氣中平衡5分鐘，然后從液氮罐中拿出，放在37℃水域中快速解凍。凍精解凍后與鮮卵進行人工受精，做法為將冷凍精液倒于卵子上，攪拌混勻，加少許淡水(鯉科魚類精子)或海水(海水魚類精子)激活精子，使之與卵子受精。授精后將受精卵置于孵化器中孵化。
全文摘要
一種魚類精子冷凍保存的實用化方法，通過比較不同稀釋液、抗凍劑和凍存容器的冷凍保存效果，篩選出適宜我國主要鯉科魚類(青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊等)和主要海水魚類(鱸魚、大菱鲆、牙鲆和石鰈等)精子冷凍保存的稀釋液配方、抗凍劑及凍存容器；建立了三步冷凍模式和快速解凍方法。上述11種魚類精子超低溫(－196℃)冷凍保存后的活率穩(wěn)定在65％以上，受精率達80％以上，孵化率達85％以上。建立了上述四種海水魚類精子冷凍庫。用凍存1年的鱸魚凍精授精，共獲魚苗32萬尾；用凍存1年的大菱鲆精子授精獲得大菱鲆魚苗30多萬尾。本方法凍存量大、效果好，無需昂貴的儀器設(shè)備，操作簡單，成本低廉，可用于幾乎所有魚類精子超低溫冷凍保存。
文檔編號A23B4/06GK1596670SQ20041003546
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者陳松林, 季相山 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所