小黃魚精子冷凍保存液及小黃魚精子冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小黃魚精子冷凍保存液及小黃魚精子冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小黃魚(Larimichthys polyactis)是我國重要經(jīng)濟(jì)魚類，在我國沿海均有分布，由于地理隔離已經(jīng)形成了包括山東青島、江蘇啟東、浙江舟山和福建寧德等幾個(gè)地理種群。小黃魚生性敏感，極易受驚，遠(yuǎn)距離運(yùn)輸死亡率極高，難易運(yùn)用常規(guī)方法使不同地理種群進(jìn)行自然交配達(dá)到雜交育種的目的。而魚類精子超低溫凍存則是解決這一難題的有效途徑:將某一地理群體的雄性小黃魚精液進(jìn)行冷凍保存，然后再與另一種群雌性小黃魚進(jìn)行人工授精，即可達(dá)到雜交育種的目的。
[0003]小黃魚精子冷凍保存技術(shù)還在魚類種質(zhì)資源保護(hù)、遠(yuǎn)緣雜交和魚類的雌核發(fā)育、雄核發(fā)育等方面具有應(yīng)用參考價(jià)值。
[0004]不同魚類的精子對(duì)外界環(huán)境的敏感性不同，其冷凍方式和復(fù)溫方法均會(huì)大幅影響精子的活力。目前魚類多采用離心管和麥細(xì)管進(jìn)行冷凍保存，但在降溫和復(fù)溫的過程中，管中心位置的溫度變化與管壁并不同步，會(huì)降低精子復(fù)活后的活力，從而導(dǎo)致受精率和孵化率的下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供小黃魚精子冷凍保存液及小黃魚精子冷凍保存方法的技術(shù)方案。
[0006]所述的一種小黃魚精子冷凍保存液，其特征在于由保存液和抗凍劑組成，所述的保存液由氯化鈉6?10g，氯化鉀0.2?0.6g，氯化鈣0.3?0.7g，檸檬酸鈉0.1?0.4g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML得到；所述的抗凍劑包括甘油和乙二醇；所述的保存液:甘油:乙二醇的體積比為85?95:6?10:1?5。
[0007]所述的一種小黃魚精子冷凍保存液，其特征在于所述的保存液由氯化鈉7?9g，氯化鉀0.3?0.5g，氯化鈣0.4?0.6g，檸檬酸鈉0.2?0.3g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML得到。
[0008]所述的一種小黃魚精子冷凍保存液，其特征在于所述的保存液:甘油:乙二醇的體積比為88?92:7?9:2?4。
[0009]利用一種小黃魚精子冷凍保存液進(jìn)行小黃魚精子的冷凍保存方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)挑選性腺發(fā)育良好的雄性小黃魚，用純水沖洗其生殖孔后擦干，輕壓其腹部，用一次性吸管收集精液；
(2)將收集的小黃魚精液用小黃魚精子冷凍保存液按1:4的比例稀釋，制成混合液；
(3)準(zhǔn)備一塊長10cm，寬5cm的醫(yī)用紗布； (4)將其置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30min；
(5)將5ml的混合液均勻噴在醫(yī)用紗布上，紗布應(yīng)雙面噴灑；
(6)將紗布置于0°C環(huán)境下，保持伸展?fàn)顟B(tài)，穩(wěn)定1min；
(7)將紗布置于-80°C冰箱內(nèi)，保持伸展?fàn)顟B(tài)，穩(wěn)定8min；
(8)將紗布直接投入液氮罐內(nèi)，應(yīng)置于液面以下-196°C冷凍保存，得到小黃魚冷凍精液。
[0010]所述的冷凍保存方法，其特征在于所述的小黃魚冷凍精液的使用步驟如下；設(shè)定供箱溫度為43 C，待供箱溫度穩(wěn)定后，將液氣冷凍后的紗布置于一 1000ML燒杯中，放入43°C烘箱3min 1s后取出即可。
[0011]本發(fā)明以紗布為平面，無論是降溫，還是復(fù)溫，精液的溫度變化都很均勻，保證了精子活力的一致性。采用本發(fā)明的冷凍保存液及方法進(jìn)行冷凍保存的精子復(fù)活后能夠保持鮮精活力，利用復(fù)活的精子進(jìn)行受精后，受精率達(dá)到85%以上，孵化率達(dá)到79%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0013]實(shí)施例1:一種小黃魚精子冷凍保存液的制備
該冷凍保存液由小黃魚精子保存液和抗凍劑組成，其中小黃魚精子保存液的配制方法為:氯化鈉Sg，氯化鉀0.4g，氯化鈣0.5g，檸檬酸鈉0.2g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML ;抗凍劑為甘油和乙二醇；將小黃魚精子保存液、甘油和乙二醇按體積比90:8:2的比例混合，即得到小黃魚精子冷凍保存液。
[0014]實(shí)施例2:—種小黃魚精子冷凍保存液的制備
該冷凍保存液由小黃魚精子保存液和抗凍劑組成，其中小黃魚精子保存液的配制方法為:氯化鈉6g，氯化鉀0.2g，氯化鈣0.3g，檸檬酸鈉0.lg，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML ;抗凍劑為甘油和乙二醇；將小黃魚精子保存液、甘油和乙二醇按體積比85:10:5的比例混合，即得到小黃魚精子冷凍保存液。
[0015]實(shí)施例3:—種小黃魚精子冷凍保存液的制備
該冷凍保存液由小黃魚精子保存液和抗凍劑組成，其中小黃魚精子保存液的配制方法為:氯化鈉10g，氯化鉀0.6g，氯化鈣0.7g，檸檬酸鈉0.4g，用滅菌后的超純水溶解，然后定容至1000ML ;抗凍劑為甘油和乙二醇；將小黃魚精子保存液、甘油和乙二醇按體積比92:7:I的比例混合，即得到小黃魚精子冷凍保存液。
[0016]實(shí)施例4:小黃魚精子的冷凍保存方法
(1)挑選性腺發(fā)育良好的雄性小黃魚，用純水沖洗其生殖孔后擦干，輕壓其腹部，用一次性吸管收集精液；
(2)將收集的小黃魚精液用實(shí)施例1制得的小黃魚精子冷凍保存液按1:4的比例稀釋，制成混合液；
(3)準(zhǔn)備一塊長10cm，寬5cm的醫(yī)用紗布；
(4)將其置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30min； (5)將5ml的混合液均勻噴在醫(yī)用紗布上，紗布應(yīng)雙面噴灑；
(6)將紗布置于0°C環(huán)境下，保持伸展?fàn)顟B(tài)，穩(wěn)定1min；
(7)將紗布置于-80°C冰箱內(nèi)，保持伸展?fàn)顟B(tài)，穩(wěn)定8min；
(8)將紗布直接投入液氮罐內(nèi)，應(yīng)置于液面以下_196°C，48h后取出進(jìn)行復(fù)活實(shí)驗(yàn)；
(9)小黃魚冷凍精液的復(fù)活:設(shè)定烘箱溫度為43°C，待烘箱溫度穩(wěn)定后，將該實(shí)施例得到的液氮冷凍后的紗布置于一 1000ML燒杯中，放入43°C烘箱3min 1s后取出，即可；
(10)挑選性腺發(fā)育良好的雌性小黃魚，用純水沖洗其生殖孔后擦干，輕壓其腹部，采集卵子；
(11)取100ML新鮮卵子置于放有解凍后紗布的燒杯中；
(12)向燒杯中加入500ML20°C新鮮海水，期間不停攪拌，使紗布與卵子充分接觸；
(13)30s后取出紗布，擰干；
(14)向燒杯中加水至800ML；
(15)Ih后統(tǒng)計(jì)其受精率為8