專利名稱：培育化學(xué)去雄和無籽果實(shí)植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明是一種用除草劑定向殺死或抑制植物特定組織或器官的方法。
背景技術(shù)：
在農(nóng)作物生產(chǎn)中，有時(shí)為了某些特殊要求，需要定向地殺死或者抑制植物特定的組織或器官。例如，用于雜交制種的化學(xué)去雄法就是用化學(xué)殺雄劑特異性地殺死植物的雄性組織，或植物雄配子。在水稻方面，已經(jīng)開發(fā)出幾種化學(xué)殺雄劑如甲基砷酸鋅，甲基砷酸鈉，曾經(jīng)在中國用于化學(xué)殺雄法雜交制種(雜交水稻繁制學(xué)，中國農(nóng)業(yè)出版社1999年第一版312頁)。近幾年又開發(fā)出CHAIII(作物學(xué)報(bào)2001，27(6)823-831)等水稻化學(xué)殺雄劑。在小麥方面，中國西北農(nóng)業(yè)大學(xué)培育了用Genesis化學(xué)殺雄劑進(jìn)行雜交制種的小麥雜交組合“西雜一號”，已經(jīng)進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用(科技日報(bào)2002年1月15日第一版)。但是現(xiàn)有的化學(xué)殺雄劑普遍存在著選擇性較差，對雌性器官有傷害，或者施藥時(shí)期、條件不易控制等缺點(diǎn)，其應(yīng)用前景受到影響。
在棉花方面，應(yīng)用化學(xué)藥劑對棉花生長進(jìn)行化學(xué)打頂，是用化學(xué)藥劑定向抑制其頂端生長組織的一個嘗試。棉花是無限生長作物，為了使棉花生長后期養(yǎng)分集中供應(yīng)于需要的幼鈴，常常采用人工摘除頂端組織的方法(俗稱打頂)，但要耗費(fèi)大量人力。曾經(jīng)試驗(yàn)噴施激素抑制頂端生長組織，但是這種技術(shù)很難控制，常常造成生產(chǎn)損失，因而并未成功地大面積應(yīng)用。
棉花的雜種優(yōu)勢利用目前已經(jīng)得到大面積生產(chǎn)應(yīng)用，但棉花的去雄現(xiàn)在仍然是采用手工剝除雄花的方法，從而使棉花雜交種子的生產(chǎn)成本很高。發(fā)明一種用化學(xué)藥劑殺死棉花雄性組織或器官的技術(shù)，是十分迫切的需要。
生產(chǎn)無籽或少籽的果實(shí)具有巨大的市場潛力?，F(xiàn)在采用三倍體技術(shù)生產(chǎn)無籽西瓜，其種籽生產(chǎn)程序復(fù)雜。實(shí)際上，在種子發(fā)育的早期，如果能定向地殺死其中的幼胚或種子發(fā)育的其他組織，就能生產(chǎn)無籽或少籽的果實(shí)。中國專利申請99194700公開了采用細(xì)胞毒性基因在授粉后早期終止種子發(fā)育的方法，但該方法是不可逆的，因而為了獲得繁殖所需要的種子，還必須采用較復(fù)雜的雜交方法。
在中國專利申請99806006中，孟山都公司公開了一種用非選擇性滅生性除草劑草甘磷定向殺死植物雄性組織或雄配子的方法。該項(xiàng)技術(shù)采用植物雄性組織或雄配子特異啟動子，通過反義技術(shù)抑制外源抗草甘磷基因在花藥或花粉中的表達(dá)，從而在施用草甘磷時(shí)可以定向地殺死植物花藥組織或雄配子，而對植株其他部分無害。這一技術(shù)的不足之處是必須用轉(zhuǎn)基因技術(shù)向植物導(dǎo)入外源的抗草甘磷基因，將在植物中產(chǎn)生異源蛋白，而這在很多情況下對植物生長發(fā)育是不利的，同時(shí)還將受到轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用安全性的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)源的抗除草劑基因的表達(dá)，用內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑，定向地殺死或抑制植物特定組織或器官的技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種使用除草劑殺死或抑制植物特定組織和器官的方法，該種植物對至少一種內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑具有由內(nèi)源抗除草劑基因控制的抗性，該方法包括向該植物的細(xì)胞中導(dǎo)入一種DNA分子，該DNA分子包括一種組織或器官特異性啟動子，和一種和該啟動子可操作地連接的DNA序列，該DNA序列表達(dá)的結(jié)果，阻抑該內(nèi)源抗除草劑基因在該植物特定組織和器官中的表達(dá)；獲得導(dǎo)入了該種DNA分子的轉(zhuǎn)化植株；向該轉(zhuǎn)化植株施用該內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑。
優(yōu)選地，所述的內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑包括選自苯氧羧酸類除草劑、苯甲酸類除草劑、芳氧苯氧丙酸類除草劑、二硝基苯胺類除草劑、三氮苯類除草劑、氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸酯類除草劑、酰胺類除草劑、取代脲類除草劑、磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、環(huán)已烯酮類除草劑、腈類除草劑、吡啶類除草劑、環(huán)狀亞胺類除草劑、磺酰胺類除草劑、嘧啶類除草劑以及部分其他具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性作用的有機(jī)雜環(huán)類除草劑，如快殺稗，仙治，野燕枯等。
優(yōu)選地，所述的植物選自稻、小麥、大麥、玉米、谷子、高粱、棉花、油菜、西瓜、甜瓜、黃瓜、番茄、辣椒、大白菜、甜菜、苜蓿以及紫云英。
優(yōu)選地，所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因選自水稻抗磺酰脲類除草劑Bel.基因、β-氧化酶基因、羥基化酶基因、脫烷基酶基因、棉花脫甲基酶基因、輔酶A基因、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因、稻酰胺水解酶基因、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因、氧化酶基因、雙功能氧化酶基因、細(xì)胞色素P-450酶基因、羧基酯酶基因。
優(yōu)選地，所述的組織或器官特異性啟動子包括在選自植物雄性組織或器官、雄配子、雌性組織或器官、雌配子、頂端分生組織、花、花原基、種子、幼胚、胚乳、果實(shí)等組織或器官中特異表達(dá)的啟動子。特別地，選自煙草絨氈特異啟動子TA29，矮牽?；ǖ腜A1和PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子，蕓苔的SLG基因啟動子，番茄花粉特異性啟動子Lat52，稻Osg6B啟動子，稻PS！花粉特異性啟動子，玉米pZtap絨氈層特異啟動子，種籽儲藏蛋白啟動子，β-菜豆蛋白基因啟動子，大豆球蛋白基因啟動子，大豆β-Conglycinin基因的α亞基的啟動子。
優(yōu)選地，所述的DNA序列編碼所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因表達(dá)的RNA的一段互補(bǔ)的RNA。
優(yōu)選地，所述的DNA序列編碼具有核酶活性的RNA，可以專一性的切割所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
優(yōu)選地，所述的DNA序列編碼通過RNA干擾作用(RNAi)阻抑所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因表達(dá)的一段或幾段RNA。
本發(fā)明還提供一種使用除草劑殺死或抑制植物特定組織和器官的方法，該方法包括向水稻細(xì)胞中導(dǎo)入一種DNA分子，該DNA分子包括一種在水稻雄性組織或器官或雄配子中表達(dá)的特異性啟動子，和一種和該啟動子可操作地連接的DNA序列，該DNA序列表達(dá)的結(jié)果，阻抑水稻羥基化酶基因(gi167562447149-10716 Oryza sativa chromosome 3，BAC OSJNBa0002J24)的表達(dá)。
獲得導(dǎo)入了該種DNA分子的轉(zhuǎn)化水稻植株；向該轉(zhuǎn)化水稻植株施用磺酰脲類除草劑。
優(yōu)選地，所述的DNA序列編碼水稻羥基化酶基因(gi167562447149-10716Oryza sativa chromosome 3，BAC OSJNBa0002J24)序列的一段反義序列。
下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述。
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的除草劑可以分為選擇性除草劑和非選擇性除草劑。在選擇性除草劑中，大部分是屬于內(nèi)吸傳導(dǎo)性的。內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑在施用于植物后，能夠被植株迅速吸收，傳導(dǎo)到植株各部分。在抗性植物中，它們被迅速代謝為無毒產(chǎn)物，而在敏感植物中，它們不能被代謝為無毒產(chǎn)物，或者代謝速度較緩慢，因而表現(xiàn)為選擇性除草效果。這些內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑包括，但不限于(參見《中國農(nóng)田雜草化學(xué)防治》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1996年第一版)1.苯氧羧酸類除草劑。
2.苯甲酸類除草劑。
3.芳氧苯氧丙酸類除草劑。
4.二硝基苯胺類除草劑。
5.三氮苯類除草劑。
6.氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸酯類除草劑。
7.酰胺類除草劑。
8.取代脲類除草劑。
9.磺酰脲類除草劑。
10.咪唑啉酮類除草劑。
11.環(huán)已烯酮類除草劑。
12.腈類除草劑。
13.吡啶類除草劑。
14.環(huán)狀亞胺類除草劑。
15.磺酰胺類除草劑。
16.嘧啶類除草劑。
17.部分其他有機(jī)雜環(huán)類除草劑，如快殺稗，仙治，野燕枯等。
抗性植物對這些內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑的代謝作用，是由于其內(nèi)源的抗性基因表達(dá)的結(jié)果。除草劑進(jìn)入植物體內(nèi)后，在專用酶的催化作用，經(jīng)過各種各樣的生物化學(xué)反應(yīng)，改變藥劑的分子結(jié)構(gòu)。由于不同植物內(nèi)源基因表達(dá)的酶的種類和量的不同，而表現(xiàn)為除草劑的選擇性。抗性植物對內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑的解毒酶促反應(yīng)，包括但不限于以下類型1.β-氧化反應(yīng)。這是通過β-氧化酶進(jìn)行的。薊等雜草體內(nèi)含β-氧化酶，能將2甲4氯丁酸大量轉(zhuǎn)化為有活性乙甲4氯，故表現(xiàn)敏感，而豆科作物中β-氧化酸活性低，故表現(xiàn)抗性。
2.羥基化。芳環(huán)羥基化是常見的除草劑代謝反應(yīng)。取代脲類除草劑、雜環(huán)類除草劑苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑等在抗性類植物體內(nèi)的主要代謝解毒作用就是羥基化作用。羥基化酶是抗性植物的主要解毒酶之一。芳氧苯氧丙酸類除草劑在抗性植株體內(nèi)其苯氧基環(huán)被羥基化，然后形成葡萄糖苷軛合物而解毒。
3.脫烷基反應(yīng)。滅草隆等取代脲類除草劑在棉花植株體內(nèi)通過脫甲基作用而解毒。脫甲基酶、輔酶A以及DPIP等參與分解滅草隆，棉花植株內(nèi)這些酶活性很強(qiáng)，故表現(xiàn)高度抗性，而玉米、高梁等敏感植株體內(nèi)這類酶活性最低。
4.S-氧化作用。硫代氨基甲酸脂類除草劑在抗性植物體內(nèi)通過S-氧化作用而氧化為砜，然后形成谷胱甘肽軛合物而解毒。
5.水解作用。水稻葉片中的酰胺水解酶含量是稗草中的60倍，因而能迅速水解酰胺類除草劑敵稗，表現(xiàn)抗性，而稗草敏感。
6.軛合作用。在植物體內(nèi)除草劑參與的軛合反應(yīng)主要有葡萄糖軛合反應(yīng)(由葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶參與)，谷胱甘肽軛合反應(yīng)(由谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶參與)和氨基酸軛合反應(yīng)。在玉米體內(nèi)通過谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)的谷胱甘肽軛合作用是三氮苯類除草劑喪失活性的重要途徑。
抗性植物對除草劑的抗性，由該植物的內(nèi)源抗性基因控制。本發(fā)明中術(shù)語“植物內(nèi)源抗除草劑基因”，是指一種植物基因組中天然存在的基因，該基因影響對至少一種內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑的抗性；抑制該基因的活性表達(dá)，將導(dǎo)致該植物對該種除草劑抗性的喪失或減弱。一種植物對一種除草劑的內(nèi)源抗除草劑基因可能不止一個，而是一系列基因共同作用的結(jié)果。但是抑制其中的一個基因，就可能導(dǎo)致該植物對該種除草劑抗性的喪失或減弱。術(shù)語“植物內(nèi)源抗除草劑基因”包括，但不限于稻Bel.基因，β-氧化酶基因，羥基化酶基因，脫烷基酶基因，棉花脫甲基酶基因，輔酶A基因，葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因，稻酰胺水解酶基因，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，氧化酶基因，雙功能氧化酶基因，細(xì)胞色素P-450酶基因，羧基酯酶基因。
有多種公知的技術(shù)可以鑒定和分離植物內(nèi)源抗除草劑基因，或者獲得該基因的表達(dá)信息
通過人工誘變技術(shù)，可以誘發(fā)植物基因突變。如果誘變獲得植物對除草劑反應(yīng)突變體，就可以通過對突變體的比較分析，發(fā)現(xiàn)和分離植物抗除草劑基因。利用除草劑反應(yīng)突變體及其誘變親本，采用mRNA差別顯示技術(shù)，是對突變基因進(jìn)行分離和克隆的有效手段之一(Peng Liang and Arthur B.Pardee，Science，257967-971(1992))。
采用T-DNA，或轉(zhuǎn)座子，或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入法獲得植物突變體，稱為DNA標(biāo)簽法。如果插入導(dǎo)致植物對除草劑反應(yīng)突變，也可以發(fā)現(xiàn)和分離植物內(nèi)源抗除草劑基因。
對于前述已知導(dǎo)致植物抗除草劑的解毒酶基因，可以分離和分析該酶的序列，設(shè)計(jì)簡并引物，直接從基因組中分離出該基因；或者通過生物信息學(xué)的方法，通過候選基因克隆目標(biāo)抗除草劑基因。
也可以不必通過分離和克隆植物內(nèi)源抗除草劑基因而獲得該基因的結(jié)構(gòu)和功能的信息。例如，利用除草劑抗性喪失突變體及其誘變親本，采用mRNA差別顯示技術(shù)，可以獲得該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序列信息。又例如，利用已經(jīng)公開的植物基因組資料，通過生物信息學(xué)的方法，可以獲得已知導(dǎo)致植物抗除草劑的解毒酶基因的蛋白質(zhì)或DNA序列信息。
植物的特定的內(nèi)源基因的表達(dá)，可以通過多種公知的技術(shù)進(jìn)行阻抑。本發(fā)明中術(shù)語“阻抑植物基因表達(dá)”，包括阻抑基因轉(zhuǎn)錄和阻抑翻譯成蛋白質(zhì)。該術(shù)語既包括基因表達(dá)的完全阻抑，也包括基因表達(dá)能力的下降。
可以通過反義技術(shù)阻抑植物特定的內(nèi)源抗除草劑基因的表達(dá)。自從Ecker等人首先證實(shí)在植物細(xì)胞中導(dǎo)入反義RNA的效果(J.R.Ecker and R.W.Dovis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372(1986))以來，反義技術(shù)現(xiàn)已被證明是阻抑植物體內(nèi)靶標(biāo)基因的最通用的方法。這種阻抑可以在多個位點(diǎn)，通過阻抑轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯而阻抑靶標(biāo)基因的表達(dá)。應(yīng)用反義技術(shù)，已經(jīng)成功地對油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因進(jìn)行阻抑，獲得了含油量提高18.9％的轉(zhuǎn)化植株(中國專利申請99124511)。中國專利申請98122875公開了中科院植生所通過種子特異啟動子驅(qū)動杜松烯合成酶基因的反義序列、降低棉籽中棉毒素含量的技術(shù)。中國專利申請00130144公開了中科院發(fā)育所通過反義抑制osRACD基因獲得雄性不育水稻技術(shù)。中國專利申請98807888公開了一種利用有義和反義RNA片段調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)的技術(shù)。一般來說，只要獲得了靶標(biāo)基因的DNA或者轉(zhuǎn)錄的mRNA的部分或全部序列信息，就可以設(shè)計(jì)出編碼該基因的反義RNA的DNA序列，應(yīng)用反義技術(shù)來阻抑該靶標(biāo)基因的表達(dá)?？梢圆槐胤蛛x和克隆植物內(nèi)源抗除草劑基因的全部DNA序列信息，而只依據(jù)該基因的部分DNA或轉(zhuǎn)錄的RNA的部分序列信息而設(shè)計(jì)反義基因。
編碼核酶的DNA也可用于阻抑內(nèi)源抗除草劑基因的表達(dá)。核酶是一種具有催化活性的RNA分子。對核酶作RNA切割酶的研究，使得設(shè)計(jì)一種切割特定RNA的核酶成為可能。編碼這種核酶的DNA序列可以和特定啟動子和終止子相連結(jié)，從而可以在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，通過對靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的RNA的專一性切割而阻抑其表達(dá)。
通過轉(zhuǎn)化具有與靶標(biāo)基因序列相同或相似的序列的DNA而進(jìn)行的協(xié)同阻抑也可阻抑內(nèi)源基因的表達(dá)?！皡f(xié)同阻抑”是指將含有與靶標(biāo)內(nèi)源基因序列相同或相似的DNA序列轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)后，導(dǎo)入的外源基因和靶標(biāo)內(nèi)源基因的表達(dá)同時(shí)阻抑的現(xiàn)象?！皡f(xié)同阻抑”現(xiàn)象已經(jīng)在植物中被觀測到(Curr.Biol.6810(1996))。
在蛋白質(zhì)水平上也可以對靶標(biāo)內(nèi)源抗除草劑基因的活性進(jìn)行阻抑。當(dāng)導(dǎo)入的一個外源基因表達(dá)后，植物本身的野生型內(nèi)源基因的活性消失或降低，這個外源基因被稱為“具有顯性失活表型的基因”(J.Biol.Chem.2664673(1991))。這種現(xiàn)象被理解為兩個基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)之間的互相作用，導(dǎo)致了基因效應(yīng)的失活。
在RNA水平上也可以對靶標(biāo)內(nèi)源抗除草劑基因的活性進(jìn)行阻抑。近年來的研究表明，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)被稱為RNA干擾(RNAi)。已有研究表明RNAi能夠在生物體內(nèi)滅活或降低特異性基因的表達(dá)，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。(Sharp PA，and Zamore PD.(2000)RNA Interference.Science 2872431-2433.)本發(fā)明中用于阻抑植物內(nèi)源抗除草劑基因的物質(zhì)不受特別限制，只要該物質(zhì)可在植物細(xì)胞內(nèi)阻抑其內(nèi)源的抗除草劑基因的表達(dá)即可。
植物特異性啟動子，是一類具有在植物特定的組織或器官中專一性表達(dá)的特性的啟動子。目前已經(jīng)有越來越多的特異性啟動子被分離出來，它們可以專一地在葉片、根、花粉、絨氈層、胚胎、內(nèi)皮層、糊粉層、韌層部、塊莖、果實(shí)等組織或器官中表達(dá)(Saito.T.，Biosi.Biotechnol.Biochem.63(4)632(1999)；Guilfoyle T.J.，Genetic Engineering 1915-47(1997)；Zhou X.，Transgenic Res.2(3)141-146(1993)；Klotz K.L，PMB 36(4)509-520(1998)；Cheung Ay，PNAS，93(9)3853-3858(1996)；Mett V.L，Transgenic Res.，5(2)105-113(1996)))。例如，在植物雄性組織或雄配子中特異表達(dá)的啟動子有，煙草絨氈層特異啟動子TA29，矮牽?；ǖ腜A1和PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子，蕓苔的SLG基因啟動子，番茄的LAT基因啟動子，稻Osg6B啟動子，稻PS！花粉特異性啟動子，玉米pZtap絨氈層特異啟動子等等。種籽儲藏蛋白啟動子是以高度的組織特異和階段特異的方式幾乎完全在種籽中表達(dá)。種籽特異性啟動子如β-菜豆蛋白基因啟動子(Bastos，EMBO J.101469-1479(1991))，大豆球蛋白基因啟動子(Lelievre，Plant Physiol.，98387-391(1992))。來自大豆β-Conglycinin基因的α亞基的啟動子，它在種子發(fā)育的早期，在胚乳和胚胎中表達(dá)(美國核酸科學(xué)進(jìn)程832123-2127(1986))。
植物特異性啟動子可以使外源的DNA序列在特定的組織或器官中特異地表達(dá)。本發(fā)明采用向植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種和特異性啟動子可操作地連接的DNA序列并獲得轉(zhuǎn)化植株，通過該DNA序列的表達(dá)阻抑植物內(nèi)源抗除草劑基因在特定的組織或器官中的抗性表達(dá)，從而在施用內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑時(shí)，專一地殺死或抑制植物的特定的組織或器官而對植物的其他組織或器官無害。
向植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種外源DNA分子，并將導(dǎo)入了該種DNA分子的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為植株，已經(jīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。DNA可以被插入到合適的載體中。載體可以通過多種公知的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中，如聚乙二醇法、電穿孔法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法。導(dǎo)入了DNA分子的細(xì)胞可以通過多種公知的方法培育成植株。因而本發(fā)明的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)施的。
本發(fā)明技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。由于大多數(shù)農(nóng)作物都已經(jīng)開發(fā)出了相應(yīng)的內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑，存在著相應(yīng)的內(nèi)源抗除草劑基因，因此本發(fā)明的技術(shù)可以應(yīng)用在不同的植物上，產(chǎn)生不同的用途。用于禾本科等主要農(nóng)作物，可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)殺雄，生產(chǎn)雜交種子；用于棉花、油菜等無限生長的作物，可以在其生長后期，殺死或抑制其頂端生長組織或多余的花蕾，促進(jìn)需要的果實(shí)和種子的生長，也可以用來殺死或抑制其雄性組織或器官，實(shí)現(xiàn)化學(xué)殺雄；用于苜蓿、紫云英等綠肥牧草作物，可以殺死或抑制其開花結(jié)實(shí)，延長莖葉生長時(shí)間；用于西瓜、甜瓜、黃瓜、番茄、辣椒等果蔬作物，可以殺死或抑制其種子形成，生產(chǎn)無籽或小籽果實(shí)；用于園藝觀賞植物，可以殺死或抑制其種子生長，延長觀賞花期。因此，本發(fā)明的技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1水稻抗磺酰脲類除草劑Bel.基因的鑒定及克隆。
磺酰脲類除草劑農(nóng)得時(shí)、草克星、芐磺隆等是對水稻安全的內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑。水稻對這些除草劑天然的具有抗性。為了鑒定水稻對磺酰脲類除草劑的內(nèi)源抗性基因，采用鈷60-γ射線輻照水稻品種W6154S干種子350戈瑞，繁殖到M2代，分單株收獲M2代種子，每單株種籽一半保留，一半種植成一個M3代株行。在M3代苗期采用千分之一濃度的雜環(huán)類除草劑苯達(dá)松溶液進(jìn)行葉面噴施，從中發(fā)現(xiàn)一個株行8077S被特異性的殺死。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，8077S還對磺酰脲類除草劑農(nóng)得時(shí)、草克星、芐磺隆高度敏感致死。將該株行對應(yīng)保留的種籽進(jìn)行繁殖、雜交和回交，對其M1、M2、M3及BC1代進(jìn)行遺傳分析，明確8077S對除草劑敏感致死突變是一個隱性單基因突變。該基因被命名為bel.。其等位顯性基因Bel.即為水稻抗磺酰脲類除草劑農(nóng)得時(shí)的內(nèi)源抗性基因。
采用8077S和培矮64S雜交的F2代為作圖群體，將Bel.基因定位于水稻第三染色體，距離微衛(wèi)星標(biāo)記RM168約7.1厘摩。
用8077S和其誘變親本W(wǎng)6154S為材料，采用mRNA差別顯示技術(shù)，克隆到mRNA差別條帶。以此為探針從水稻cDNA文庫中篩選，獲得了Bel.基因的克隆。
將獲得的cDNA進(jìn)行測序，得到Bel.基因的部分DNA序列。其中包含一段DNA序列如下序列15′-CGGGGTCATCAGGAGCGGCGGCGGCGTCGGCGGCATCGGCGTCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGGGGAGCCGGCGGGGGGCTGATGCGCACGCGG
CTGCGCCTCCCCGTCGTGCTCCTCTCCTGCTCCCTCTTCTTCCTCGCCGGCTTCTTCGGCTCCATCCTCTTCACCCAGGTAAGCGAGGCGTAGCGACGGCGAGACC-3′實(shí)施例2水稻抗磺酰脲Bel.基因在雄性組織中的反義RNA阻抑和水稻化學(xué)殺雄。
根據(jù)實(shí)施例1中獲得的Bel.基因的一段DNA序列1，設(shè)計(jì)并合成其反義DNA序列2如下序列25′-GCCCCAGTAGTCCTCGCCGCCGCCGCAGCCGCCGTAGCCGCAGCCGCCGCCGCCGCCTCCGCCCCCTCGGCCGCCCCCCGACTACGCGTGCGCCGACGCGGAGGGGCAGCACGAGGAGAGGACGAGGGAGAAGAAGGAGCGGCCGAAGAAGCCGAGGTAGGAGAAGTGGGTCCATTCGCTCCGCATCGCTGCCGCTCTGG-3′采用商購自Gene Company Ltd的表達(dá)盒元件，以稻Osg6B啟動子(該啟動子序列見文獻(xiàn)張曉國等，西北植物學(xué)報(bào)，2000，20(5)701-706)和序列2相連接，參照文獻(xiàn)(張曉國等，作物學(xué)報(bào)，Vol.24(5)629-634)的方法構(gòu)建成質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞并培養(yǎng)成植株。對所轉(zhuǎn)化的植株在幼穗分化3期后噴施5-100mg/L的農(nóng)得時(shí)溶液，即可導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的植株雄性不育。
實(shí)施例3水稻羥基化酶基因的反義RNA阻抑和水稻化學(xué)殺雄。
根據(jù)已發(fā)表的關(guān)于水稻對磺酰脲和苯達(dá)松抗性機(jī)理的文獻(xiàn)研究，知道羥基化酶是水稻體內(nèi)將磺酰脲和苯達(dá)松代謝為無毒產(chǎn)物的關(guān)鍵酶之一。比較分析實(shí)施例1中所述的8077S和W6154S，可見8077S體內(nèi)的羥基化酶含量大大低于W6154S中的含量。由此推測稻Bel.基因與水稻羥基化酶基因相關(guān)。
結(jié)合Bel.基因定位于水稻第三染色體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過英特網(wǎng)查閱已經(jīng)發(fā)表的水稻基因資料，從美國國家生物中心的基因數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nlh.gov)中查閱到，一個存在于粳稻第三染色體上的編碼類似于脯氨酰羥基化酶α亞基的全基因序列已經(jīng)被克隆(AC090713，gi167562447149-10716 Oryza sativa chromosome 3，BAC OSJNBa0002J24)。該序列見附錄1。根據(jù)這一序列設(shè)計(jì)其反義DNA序列(見附錄2，3，4)，以稻Osg6B啟動子和附錄2，3，4所列的序列之一相連接，構(gòu)建成質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞并培養(yǎng)成植株。對所轉(zhuǎn)化的植株在幼穗分化后噴施5-100mg/L的農(nóng)得時(shí)溶液，結(jié)果導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的植株雄性不育。
實(shí)施例4小麥抗磺酰脲基因在雄性組織中的特異性阻抑和化學(xué)殺雄。
由于禾本科植物基因組的保守性，以及禾本科植物普遍對磺酰脲類除草劑具有抗性，推測小麥中存在和水稻類似的受羥基化酶制約的抗磺酰脲類除草劑機(jī)制。用實(shí)施例3中構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞并培養(yǎng)成植株。對所轉(zhuǎn)化的植株在幼穗分化后噴施5-100mg/L的農(nóng)得時(shí)溶液，即可導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的植株雄性不育。
實(shí)施例5棉花脫甲基酶基因在雄性組織中的反義RNA阻抑和化學(xué)殺雄。
脫甲基反應(yīng)是棉花對取代脲類除草劑滅草隆表現(xiàn)抗性的重要機(jī)制。脫甲基酶是參與這一反應(yīng)的主要酶類?？寺∶藁摷谆富虿@得其DNA序列信息，以此構(gòu)建棉花脫甲基酶基因的反義DNA序列，并和啟動子TA29相連接，構(gòu)建成質(zhì)粒。以這一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞并培養(yǎng)成植株。對所轉(zhuǎn)化的植株噴施滅草隆溶液，即可導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的棉花植株雄性不育。
實(shí)施例6“無籽”瓜。
芳氧苯氧丙酸類除草劑穩(wěn)殺得是對西瓜安全的莖葉處理內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑。采用DNA標(biāo)簽法可以發(fā)現(xiàn)和分離西瓜內(nèi)源抗穩(wěn)殺得基因并獲得其DNA序列信息，以此構(gòu)建西瓜內(nèi)源抗穩(wěn)殺得基因的反義DNA序列，并和啟動子TA29相連接，構(gòu)建成質(zhì)粒。以這一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化西瓜細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞并培養(yǎng)成植株。對所轉(zhuǎn)化的植株噴施穩(wěn)殺得溶液，即可導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的西瓜植株雄性不育。從而獲得“無籽”西瓜。
附錄1從美國國家生物中心的基因數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nlh.gov)中查閱到的一個存在于粳稻第三染色體上的編碼類似于脯氨酰羥基化酶α亞基的全基因序列AC090713.Oryza sativa chro...[gi16756244]＞gi|167562447149-10716 Oryza sativa chromosome 3 BAC OSJNBa0002J24 genomicsequence，complete sequenceATGAAGGGCGGGGTCATCAGGAGCGGCGGCGGCGTCGGCGGCATCGGCGTCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGGGGAGCCGGCGGGGGGCTGATGCGCACGCGGCTGCGCCTCCCCGTCGTGCTCCTCTCCTGCTCCCTCTTCTTCCTCGCCGGCTTCTTCGGCTCCATCCTCTTCACCCAGGTAAGCGAGGCGTAGCGACGGCGAGACCCCCACCCCACCGCCACCCTCGTTTCGTTTGTCGGGTTCTGATCTGGGTGGTGGTTTTTTGGCGCGCGGCTGTGTTGTTCCCGAGGCAGGATCCGCAGGGGGAGGAGGAGCTCGACAC
GCCGATGAGGAGGGAGCGGCTGATGGAGGCGGCGTGGCCCGGAATGGCGTATGGCGAGTCCGGCGAGCCGGAGCCGTCCTTGATCCCTTACCAGGTCACGCCTCGCTTCGATTTCTCGATTGGTTGCAATGTTGCATTGATGTTGTTTATTTCTGACGGATATTGACGTTTTCTTAGAATAATAGTTTTGGGTTGAGGTGACTAGCATTGGGGCGGTAGTGTTCTTCGTGAATTTTACGTCACGATGAGAATCCTCTGTTCCCATTATTTGTTTTGTTTCGATAGTTGGTTTGTTGTGATGGACACTTGCAGGGGAAGTAATTTGTTTGGTGTAAAGTGCCTGCCAAATCCGAACTTACTCTCTGTATGTATAAAAGAGATTTTGATGTGATGGTGCCACGGTATATTTGCTAGTGGGGAATTCCGAATTCAGGTTGTTGTGAGCATGCAGATGTCGTGTGCTTGAATGTGATGGCTTGATGGTATACTCGTATGCGTGTGGAATGTGTGACCGCCGCGCACCTGTGTTAGTGACATTACATAACTTACGAGTGAAACAAGTTTTTTTTTGTGAGAATCACGTAATGTGCATGACCAAAATCAGTTTGTTTTTCTACCAGTTGAACTAGTCTGTTAATTTGAGGTTTGTAGTACTTCTACTTCACCTATACTCCGTATTGGACAATGTGCACAGGCTGTTGCCTATGTAAGGAAAGTTATTAGCAATAATTGATGGAGCTGCTAGATTTCATGCCCTGTATGGCTGCAACCTGCTTATTTATTGCTCTAAGTAGGTCCTTGGGTTAATTAATATACTTTATTTGATGTGTCCTAGCCCTGAAGAACAGCCCACTAGTCCTTTTACTAAGTATGCGGTGAACTTCTTTTGTGTCTGTGGTATGAGCTTACTTATGTTAAACCACAATCTCAGTTGCATTAATTAATGCTGCTTATCACCTTCTAATTTTCTATTGTAATCTGGTTGGTGGTGCTTTAGTAATGTAAAGTTGACTCTTCTGCAGATTTTGAGTTGGCAACCTCGTGCACTATATTTTCCACAATTTGCAACATCGCAACAGTGCGAAAATATTGTAAAAACTGCTAAACAAAGGCTTATGCCATCGACATTGGCTTTAAGGAAAGGAGAAACTGAGGAGAGCACCAAAGGAATAAGGACAAGGTACTGATTAATTAAAGCCACAAAGTGCTTGCAATAAATAAAAAAGTGAAGATAACCAGGCTAGTGATCATTAGGTAGTTATGGTGGATTTATGATACTTCTATTGTGGTAGTATCATGGAAATTCTAAGCAATCATCTTTTGTTTTGTTTATTTGCTTCCTCTAGTGGGAACACGATACTTGTCTTCAAATTATAACCTCTAAATAAATTTCTTTGGTTCCAAATGGGAATTAGTAATTTATTCTATTTCATGTATTTCTTATTGAAAAGATTTGACATCTCAGAGTGCTTGGTCATATATTTCATTTTGGCATGCTGATCCAATTGTAATATATGCTTCTTGTAGTTGCAGCTTCAGATTTATACTTTGCCATGATCCAACTGGAACCCTTTCAGAAATGACTAGTCATTATGGTCTTATCTAATCTTGCATTGCACTAATGGTAAATTGCTATTGCCAAACAGCTCAGGCACATTTCTAAGTTCTGATGAAGATCCAACCGGAACCCTTGCTGAAGTTGAAAAGAAGATTGCAAAGGCCACCATGATCCCTAGACATCATGGGGAGGTACTCTTTTATGAATTTTGTGATCACGCACAAAATTATAGCACTCCTCTTTCCAATTAGAAGAACCAAAGGAAAATATTCTTTCTAGGATTCCATTCACATGTTCATTACTTAGTTGATTCATTCTTTCTGCTAAGTGCACTGATGCTGGCAGTGGCATCTTGTATCAAAGAAGACCCTTGGAGCTTAAATTGCTCTTTTTCACATGATATTTGCATACGAAGAGTATCTATAAATAACAAAATCATTTTTGTGTAGATATGCAACCTAACTTTAGAAATAAATTACTAACTGTTTGCATTAATGAACTAGAAGCAACATGTTTCTGTGATTTTGTATTGGTCCTTGCAGTACCATAATTTATGCACATTTTAATTCGTTTTTACCCTTTCTTGAAAAGAAATGTTGACAGTGATATAAGAATGCAAACCTTGTGGTGTTCTTCTGTGTAATTGTTAATTTTTTGTCCTCATTAAAGTATTAAACATTTCTATTGCTACCCATATGAAATATAGTTTTCGGATCATTCAGATTATGAAAAGAAATTTTATTTTACCATATTCATTTGTTATGTTACAGCCCTTTAATATCCTGCGCTATGAGATTGGACAGAGGTATGCTTCGCATTATGACGCATTCGACCCAGCTCAGTATGGTCCACAAAAAAGTCAAAGGGTATGCTCCTACATTTGCTTGCATTTTGCCTAACCTATATTTCTCGGTTCTAGATGTCTTGAAGATTGGGCTCTTTTTGTTATTTATGTGAACAGAGGTGCTAAGTCTGCTTAATGGACCACTAGATAGAATAATTTAGGTTGAATGATTTGACAAGAATATAGCTAAGGAACTATTGAAATGCAAATTTTCAGGTCGCGTCTTTCTTGCTTTATCTCACGGATGTTGAAGAAGGCGGAGAAACCATGTTCCCATATGAGGTGAGCATTGAGGATTTTACCATGTATTCCATCAACAGATTCTAATTTGTTCTTTATTGGTTTGCAGAACGGGGAAAACATGGATATAGGGTATGACTATGAAAAGTGCATTGGCTTAAAGGTTAAACCAAGGAAGGGTGATGGTCTCTTGTTTTACTCCCTTATGGTAAATGGCA
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權(quán)利要求
1.一種使用除草劑殺死或抑制植物特定組織和器官的方法，該種植物對至少一種內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑具有由內(nèi)源抗除草劑基因控制的抗性，該方法包括向該植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種DNA分子，該DNA分子包括一種組織或器官特異性啟動子，和一種和該啟動子可表達(dá)的連接的DNA序列，該DNA序列表達(dá)的結(jié)果，阻抑該內(nèi)源抗除草劑基因在該植物特定組織和器官中的表達(dá)；獲得導(dǎo)入了該種DNA分子的轉(zhuǎn)化植株；向該轉(zhuǎn)化植株施用該內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑。
2.如權(quán)利要求1所述的的方法，其中所述的內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑包括選自苯氧羧酸類除草劑、苯甲酸類除草劑、芳氧苯氧丙酸類除草劑、二硝基苯胺類除草劑、三氮苯類除草劑、氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸脂類除草劑、酰胺類除草劑、取代脲類除草劑、磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、環(huán)己烯酮類除草劑、腈類除草劑、吡啶類除草劑、環(huán)狀亞胺類除草劑、磺酰胺類除草劑、嘧啶類除草劑以及部分其他有機(jī)雜環(huán)類除草劑，如快殺稗，仙治，野燕枯等。
3.如權(quán)利要求1所述的的方法，其中所述的植物選自稻、小麥、大麥、燕麥、玉米、谷子、高粱、棉花、油菜、西瓜、甜瓜、黃瓜、番茄、辣椒、大白菜、甜菜、苜蓿以及紫云英。
4.如權(quán)利要求1所述的的方法，其中所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因選自稻Bel.基因、β-氧化酶基因、羥基化酶基因、脫烷基酶基因、棉花脫甲基酶基因、輔酶A基因、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因、稻酰胺水解酶基因、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因、氧化酶基因、雙功能氧化酶基因、細(xì)胞色素P-450酶基因、羧基酯酶基因。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組織或器官特異性啟動子包括選自在植物雄性組織或器官、雄配子、雌性組織或器官、雌配子、頂端分生組織、花、花原基、種子、幼胚、胚乳、果實(shí)等組織或器官中特異表達(dá)的啟動子。特別的，選自煙草絨氈特異啟動子TA29，矮牽?；ǖ腜A1和PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子，蕓苔的SLG基因啟動子，番茄花粉特異性啟動子Lat52，稻Osg6B啟動子，稻PS1花粉特異性啟動子，玉米pZtap絨氈層特異啟動子，種籽儲藏蛋白啟動子，β-菜豆蛋白基因啟動子，大豆球蛋白基因啟動子，大豆β-Conglycinin基因的α亞基的啟動子。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的DNA序列編碼所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因表達(dá)的RNA的一段互補(bǔ)的RNA。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的DNA序列編碼具有核酶活性的RNA，可以專一性的切割所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的DNA序列編碼通過RNA干擾作用(RNAi)阻抑所述的植物內(nèi)源抗除草劑基因表達(dá)的一段或幾段RNA。
9.一種使用除草劑殺死或抑制植物特定組織和器官的方法，該方法包括向水稻細(xì)胞中導(dǎo)入一種DNA分子，該DNA分子包括一種在水稻雄性組織或器官或雄配子中表達(dá)的特異性啟動子，和一種和該啟動子可操作地連接的DNA序列，該DNA序列表達(dá)的結(jié)果，阻抑水稻羥基化酶基因(AC090713，gi167562447149-10716 Oryza sativa chromosome 3，BAC OSJNBa0002J24)的表達(dá)。獲得導(dǎo)入了該種DNA分子的轉(zhuǎn)化水稻植株；向該轉(zhuǎn)化水稻植株施用磺酰脲類除草劑。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的DNA序列編碼水稻羥基化酶基因(AC090713，gi167562447149-10716 Oryza sativa chromosome 3，BACOSJNBa0002J24)表達(dá)的RNA的一段互補(bǔ)的RNA。
全文摘要
一種使用除草劑殺死或抑制植物特定組織和器官的方法，通過特異性啟動子和反義技術(shù)抑制植物內(nèi)源的抗除草劑基因在特定組織或器官中的表達(dá)，然后施用內(nèi)吸傳導(dǎo)性選擇性除草劑，達(dá)到定向的殺死或抑制植物特定組織或器官的目的。根據(jù)不同的設(shè)計(jì)，可以用作化學(xué)殺雄，化學(xué)打頂，生產(chǎn)無籽西瓜，或者延長營養(yǎng)生長期。
文檔編號C12N15/29GK1664101SQ20041001279
公開日2005年9月7日 申請日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者張集文, 涂巨民 申請人:張集文