專利名稱：分離大豆蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從含有大豆蛋白的溶液中生產(chǎn)富含7S球蛋白級(jí)分和富含11S球蛋白級(jí)分的方法，以及由該方法制得的大豆蛋白。
背景技術(shù)：
大豆貯藏蛋白在大約pH4.5時(shí)發(fā)生沉淀，且可以相對(duì)容易的與非蛋白組分分離。這種沉淀蛋白是指大豆分離出的蛋白質(zhì)，這種形式的大豆蛋白通常應(yīng)用在食品工業(yè)中。根據(jù)超速離心分析法的沉降常數(shù)，大豆貯藏蛋白進(jìn)一步的分為2S、7S、11S和15S球蛋白。其中，7S球蛋白和11S球蛋白是球蛋白級(jí)分的主要成分(注7S球蛋白和11S球蛋白是根據(jù)沉降方法標(biāo)定的名稱，實(shí)質(zhì)上，分別對(duì)應(yīng)于免疫學(xué)命名系統(tǒng)的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)，并且它們具有不同的性質(zhì)，例如粘度、凝結(jié)力、表面活性等。因此，把大豆蛋白分離成富含7S球蛋白的級(jí)分和富含11S球蛋白的級(jí)分，就能夠開始應(yīng)用兩種蛋白質(zhì)的性質(zhì)，借此可擴(kuò)大蛋白質(zhì)的工業(yè)應(yīng)用。
7S球蛋白和11S球蛋白由幾個(gè)亞基構(gòu)成。7S球蛋白由3個(gè)亞基，即α、α’和β亞基組成。11S球蛋白由一對(duì)酸性多肽(A)和堿性多肽(B)組成，它們都有幾個(gè)亞基。在常規(guī)的大豆蛋白中的這些亞基的組成比例為7S球蛋白比11S球蛋白的比例約1∶2，其由通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的遷移譜帶的光密度面積比所確定。7S球蛋白和11S球蛋白的分子量和電荷狀態(tài)性質(zhì)相似。特別是兩種蛋白不同在于其亞基的組成不同，從而在一定程度上它們的性質(zhì)相互重疊。因此，相互混雜很少的有效分離這些球蛋白是非常不容易的。
已知的分離方法如下所述。也就是說，這些方法包括利用等電離點(diǎn)不同的分離方法在11S球蛋白的等電離點(diǎn)附近時(shí)只有7S球蛋白被提取(JP55-124457A)；利用與鈣鹽反應(yīng)能力不同的分離方法通過在提純中加入小量的鈣來提取富含7S球蛋白的級(jí)分(JP-A-48-56843A)；利用在特定的pH值和離子強(qiáng)度下的溶解度不同的分離方法通過在pH約為1.2-4.0時(shí)氯化鈉或氯化鉀存在的條件下除去不溶的級(jí)分來制備7S球蛋白(JP49-31843A)，通過調(diào)節(jié)經(jīng)過等電離點(diǎn)沉淀之后的漿液的pH值到5.0-5.6，同時(shí)調(diào)節(jié)氯化鈉的濃度到0.01-0.2M來分離7S球蛋白和11S球蛋白(JP58-36345A)，通過調(diào)節(jié)含有蛋白質(zhì)的溶液的離子強(qiáng)度到0.2-0.3和pH值到4.8-5.2來去除不溶解級(jí)分，然后調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度到小于0.2和pH到4.6-5.0來分離7S球蛋白(JP5-43597A)；和利用冷沉淀現(xiàn)象和還原劑等的方法這利用了在低溫下11S球蛋白的溶解度降低現(xiàn)象(意指冷沉淀現(xiàn)象)，在水體系pH為6.5或更高在亞硫酸化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸存在的條件下處理大豆蛋白原料，接著調(diào)節(jié)pH到5.5-7.0和溫度為22℃或更低來分離成溶解的富含7S球蛋白的級(jí)分和不溶解的富含11S球蛋白的級(jí)分(JP61-187755A)。
這些已知的分離方法巧妙地利用了由于pH、離子強(qiáng)度、特定鹽的存在、溫度等造成的7S球蛋白和11S球蛋白的溶解度不同。但是，這些已知的方法不適作工業(yè)規(guī)模的分離方法的問題在于，例如，完全分離需要高離心力。因此，實(shí)踐中仍有問題。例如，在JP61-187755的方法中，冷沉淀現(xiàn)象很大程度上取決于溫度，并且將反應(yīng)混合物降溫至約5℃，這導(dǎo)致的實(shí)際問題在于要利用工業(yè)用的低離心力就要把大量的亞硫酸化合物等加到分離層中，同時(shí)還導(dǎo)致分離精確性的問題，也就是少量的11S球蛋白摻雜在可溶的級(jí)分中。
為了獲得富含7S球蛋白的蛋白質(zhì)，研究了從缺損11S球蛋白的大豆中分離蛋白，例如通過育種制備富含7S球蛋白的種子(BreedingScience，46，11，1996)，還可以發(fā)現(xiàn)它的使用(Breeding Science，50，101，2000)和專利(US6,171,640B1)。
如上所述，已經(jīng)研究和開發(fā)了用于分離富含7S球蛋白的級(jí)分和11S球蛋白的級(jí)分的方法，通過該方法可溶解級(jí)分與不溶解級(jí)分之間的相互混雜降低，通過該方法可以便利地實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。
另一方面，Samoto等人報(bào)道了在源于大豆的蛋白中，有一種與作為細(xì)胞質(zhì)薄膜和蛋白體或油體薄膜(油體結(jié)合蛋白)組分的極性脂類具有高親和力的蛋白質(zhì)成分，其量高達(dá)工業(yè)生產(chǎn)大豆蛋白分離物的大約35％(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))。油體結(jié)合蛋白是主要由膜蛋白構(gòu)成的蛋白質(zhì)組分的通用術(shù)語，特別是那些由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的分子量主要地為34kDa、24kDa和18kDa，并且含有大約10-12％重量的極性脂類的，其可用氯仿乙醇以2∶1混合的極性溶劑混合物提取。
常規(guī)的分離方法只關(guān)注7S和11S球蛋白，而在一般情況下沒有注意到污染各個(gè)級(jí)分的油體結(jié)合蛋白，因?yàn)楫?dāng)使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析時(shí)，油體結(jié)合蛋白不能像7S和11S球蛋白那樣確實(shí)地被確定而常常被忽視。換句話說，只用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來確定純度通常要比實(shí)際純度高。為了獲得真正高純度的7S或11S球蛋白，應(yīng)該考慮到油體結(jié)合蛋白的作用。因此，常規(guī)的分離成7S球蛋白/11S球蛋白兩個(gè)級(jí)分的分離方法，僅作為7S球蛋白和11S球蛋白之間的比例來處理級(jí)分的純度。然而，各級(jí)分與油體結(jié)合蛋白都相關(guān)，并且在許多情況下，實(shí)際的情況是純度稍低的相對(duì)粗制的級(jí)分，其蛋白組成的特點(diǎn)在于含有大量的油體結(jié)合蛋白。
而本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種只需通過酸性條件下熱處理實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的7S球蛋白和11S球蛋白的分離的方法(WO02/28198A1)，作為深入研究的結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)通過結(jié)合調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度與在酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理，可以降低分離含有7S球蛋白的可溶解級(jí)分和含有11S球蛋白的不溶解級(jí)分的pH，從而進(jìn)一步促進(jìn)可溶解級(jí)分與不溶解級(jí)分的分離。
本發(fā)明提供了一種分離7S球蛋白和11S球蛋白的新的分離方法，特別是，本發(fā)明的目的之一是一種高度精確有效的分離方法，其可以以工業(yè)規(guī)模實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一目的是提供具有較少油體結(jié)合蛋白污染和高純度的7S球蛋白和11S球蛋白的特點(diǎn)的蛋白分級(jí)。
專利文獻(xiàn)1JP55-124457A專利文獻(xiàn)2JP48-56843A專利文獻(xiàn)3JP49-31843A專利文獻(xiàn)4JP58-36345A專利文獻(xiàn)5JP5-43597A專利文獻(xiàn)6JP61-187755A專利文獻(xiàn)7US6,171,640B1專利文獻(xiàn)8WO02/28198A1非專利文獻(xiàn)1K.Yagasaki等，Breeding Science，46，11，1996非專利文獻(xiàn)2K.Yagasaki等，Breeding Science，50，101，2000非專利文獻(xiàn)3M.Samoto等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940，1998發(fā)明詳述本發(fā)明涉及(1)生產(chǎn)大豆蛋白的方法，其包括在酸性條件下熱處理含有大豆蛋白的溶液，然后在離子強(qiáng)度為0.02或更高和pH為4.5或更高但低于5.6的條件下將其分為可溶解級(jí)分和不可溶級(jí)分；(2)根據(jù)(1)的方法，其中含有大豆蛋白的溶液是脫脂大豆蛋白的水漿液、從該漿液獲得的脫脂大豆豆?jié){、酸沉大豆蛋白的漿液或大豆蛋白分離物的溶液；(3)根據(jù)(1)的方法，其中酸性條件為pH3.8-6.8；(4)根據(jù)(1)的方法，其中熱處理在30-75℃進(jìn)行；(5)根據(jù)(1)的方法，其進(jìn)一步包括從通過方法(1)中的分離獲得的可溶解級(jí)分中分離出7S球蛋白，其中所述7S球蛋白的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.5或更高，并且所述7S球蛋白的固體內(nèi)容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的極性脂類的含量為1％重量或更低；(6)通過方法(5)獲得的7S球蛋白，其中7S球蛋白的固體內(nèi)容物中肌醇六磷酸的含量為1.2％重量或更低；(7)根據(jù)方法(1)的方法，其還包括從通過方法(1)中的分離獲得的不溶解級(jí)分中分離出11S球蛋白，其中所述11S球蛋白的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.7或更高，并且所述11S球蛋白的固體內(nèi)容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)在所述的11S球蛋白成分中提取的極性脂類的含量為2％重量或更低；(8)通過方法(7)獲得的11S球蛋白，其中11S球蛋白的固體內(nèi)容物中肌醇六磷酸的含量為1.2％重量或更低；實(shí)施本發(fā)明的最佳方式與僅通過在酸性條件的熱處理實(shí)現(xiàn)7S球蛋白和11S球蛋白的工業(yè)化分離的方法(WO02/28198A1)相比，本發(fā)明方法的特點(diǎn)在于用于分離開含有7S球蛋白的可溶解級(jí)分和含有11S球蛋白的不溶解級(jí)分的pH可以通過結(jié)合調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度與在酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理降低，從而進(jìn)一步促進(jìn)可溶解級(jí)分與不溶解級(jí)分的分離。上述的酸性條件優(yōu)選在pH3.8-6.8，熱處理溫度優(yōu)選為30-75℃，離子強(qiáng)度優(yōu)選為0.02或更高，并且可溶解級(jí)分和不可溶級(jí)分的分離優(yōu)選在pH為4.5或更高但低于5.6的條件下進(jìn)行。由此可以獲得含有更少油體結(jié)合蛋白的富含7S球蛋白的可溶解級(jí)分。能夠通過在大約中性的pH(pH6.5-7.5)的水溶液中的上述的不溶解級(jí)分上施加弱的剪應(yīng)力來選擇性的溶解和分離11S球蛋白并保持油體結(jié)合蛋白不溶，從而溶解或提取不溶解級(jí)分中的11S球蛋白來獲得含有更少油體結(jié)合蛋白的富含11S球蛋白的不溶解級(jí)分。
另外，在本發(fā)明中，具有肌醇六磷酸占蛋白質(zhì)為1.2％或更低的低含量的肌醇六磷酸的蛋白質(zhì)級(jí)分可以通過在生產(chǎn)過程中用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸來獲得。分離效率可以通過在可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分分離之前的實(shí)施肌醇六磷酸酶處理得到進(jìn)一步提高。
通過上述生產(chǎn)方法獲得的可溶解級(jí)分具有的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值為0.5或更高，上述比值為0.8或更高、0.85或更高，或0.9或更高的高純化的7S球蛋白就可以容易地通過適當(dāng)?shù)剡x擇分離可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分的pH來獲得。另一級(jí)分，例如，不溶解的級(jí)分，具有的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值為0.7或更高，并且上述比值為0.8或更高、0.85或更高，或0.9或更高的高純化的7S球蛋白就可以容易地通過適當(dāng)?shù)剡x擇分離可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分的pH來獲得。
其中，7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)或11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值可以從通過依據(jù)光密度分析法用SDS-聚丙烯酰胺電泳測(cè)量遷移譜帶所獲得的相對(duì)應(yīng)的級(jí)分的面積比來確定。
在酸沉的蛋白質(zhì)中的油體結(jié)合蛋白的比例為大約30-35％，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)正是用硫酸鈉從酸沉的蛋白質(zhì)獲得的時(shí)候，其幾乎沒有變性(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))?？紤]到用氯仿和甲醇的比為2∶1(體積比)的混合溶劑提取的極性脂類在酸沉蛋白的成分中的固體含量為3-4％重量和在油體結(jié)合蛋白中的含量為10-12％重量，上述的極性脂類(在下文中有時(shí)簡寫為氯仿-甲醇可提的油份)不均衡地分布在酸沉蛋白的油體結(jié)合蛋白中，并且油體結(jié)合蛋白的量可計(jì)為氯仿-甲醇可提的油份重量的10倍。然而，這種計(jì)算適用于通過己烷等脫脂制備的主要物質(zhì)，至于沒有經(jīng)過己烷提取的主要物質(zhì)，該計(jì)算首先適用于經(jīng)過己烷脫脂的。
本發(fā)明中獲得的富含7S球蛋白的可溶解級(jí)分含有1％或更低的氯仿-甲醇可提的油份，而油體結(jié)合蛋白的含量估計(jì)為10％或更低。從不溶解級(jí)分提取的富含7S球蛋白的級(jí)分含有2％或更低的氯仿-甲醇可提的油份，而油體結(jié)合蛋白的含量估計(jì)為20％或更低。
本發(fā)明所使用的分析方法如下所述。
*粗蛋白質(zhì)通過Kjaldahl方法確定氮含量，并把它乘以系數(shù)6.25轉(zhuǎn)換為粗蛋白質(zhì)的含量。
*不溶解級(jí)分的分離沉淀速率使用由L.U.M.Co.制造的分離特性分析儀LUMiFuge114。含有不溶解級(jí)分的樣品溶液(0.5ml)被放入聚苯乙烯方形空格中，該空格在100G離心分離，并且透光度為20％的界面移動(dòng)的速率定義為分離沉淀速率。
*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)Laemmli的方法(Nature，227，680(1970))，使用凝膠濃度為10％-20％的梯度凝膠分析蛋白質(zhì)。所測(cè)試的蛋白質(zhì)的固體含量為6μg，，并且該凝膠用Coomassie BrilliantBlue R-250染色。
*肌醇六磷酸肌醇六磷酸的量根據(jù)Alii Mohamed方法化驗(yàn)(Cereal Chemistry 63，475-478(1986))。
*氯仿-甲醇可提的油份干燥的樣品中加入大約50倍體積的氯仿和甲醇的混合溶液(體積比，2∶1)，回流溶劑提取的固體成分的重量比確定為氯仿-甲醇可提的油份。
*純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))用光密度計(jì)測(cè)量通過上述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的遷移譜帶。所期望的組分相對(duì)于該譜帶總面積的面積比值定義為純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))。7S球蛋白的含量是指α、α’和β亞基的總含量，而11S球蛋白的含量是指酸性多肽(A)和堿性多肽(B)的總含量。
*校正純度考慮到其中摻雜的油體結(jié)合蛋白，從上面獲得的純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))計(jì)算校正純度。也就是，由于樣品中除了含有7S球蛋白和11S球蛋白外，還含有對(duì)應(yīng)于氯仿-甲醇可提的油份10倍重量的油體結(jié)合蛋白，假設(shè)A(％)代表純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))，計(jì)算對(duì)應(yīng)于包括7S球蛋白、11S球蛋白和油體結(jié)合蛋白的總蛋白的校正純度校正純度(％)＝(100(％)-氯仿-甲醇可提的油份含量(％)×10)×A(％)/100*離子強(qiáng)度用電導(dǎo)計(jì)(2％/℃，具有溫度轉(zhuǎn)換功能)計(jì)量溶液的導(dǎo)電率，對(duì)應(yīng)于所測(cè)的導(dǎo)電率的NaCl的摩爾濃度定義為離子強(qiáng)度。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例如下所述。
任何市售或通過育種或基因工程生產(chǎn)的缺損特定級(jí)分蛋白的大豆都可以用作本發(fā)明的原料大豆。而含有大豆蛋白的溶液可為任何脫脂大豆的水相漿液(以下稱為脫脂大豆?jié){液)、從該漿液獲得的脫脂豆?jié){、大豆蛋白的酸沉漿液(以下稱為凝乳)或大豆蛋白分離物的溶液。特別優(yōu)選脫脂大豆的水相漿液，由于其可溶解級(jí)分和不溶級(jí)分易于分離。為了分離成富含7S球蛋白級(jí)分和富含11S球蛋白的級(jí)分，優(yōu)選非變性或幾乎沒有變性的大豆蛋白的溶液。
酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理進(jìn)行在pH3.8-6.8，更優(yōu)選pH4.0-6.6，進(jìn)一步優(yōu)選pH4.2-6.2，其溫度為30-75℃，更優(yōu)選35-65℃，進(jìn)一步優(yōu)選40-60℃。0.02或更高的離子強(qiáng)度促進(jìn)可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分的分離。然而，由于為了在分離之后從可溶解級(jí)分等電沉淀7S球蛋白，離子強(qiáng)度應(yīng)調(diào)節(jié)到小于0.2，而分離時(shí)所用的離子強(qiáng)度為0.2或更高，因此為了避免復(fù)雜的分離過程0.02或更高但小于0.2的離子強(qiáng)度被建議使用。當(dāng)在pH4.5或更高但小于5.6的條件下從不溶解級(jí)分分離出可溶解級(jí)分時(shí)，可以獲得富含7S球蛋白的可溶解級(jí)分和富含11S球蛋白的不溶解級(jí)分。可以通過在生產(chǎn)過程中用肌醇六磷酸酶分解包含在大豆蛋白中的肌醇六磷酸進(jìn)一步促進(jìn)富含7S球蛋白的級(jí)分和富含11S球蛋白的級(jí)分的分離，特別是在可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分分離之前的任何步驟中。肌醇六磷酸酶處理可以被簡化和推動(dòng)，當(dāng)該過程與酸性條件下的熱處理同時(shí)進(jìn)行時(shí)。肌醇六磷酸酶處理最優(yōu)化的條件通常是在pH3.5-9.0，20-70℃的溫度下5分鐘-3小時(shí)，每克蛋白質(zhì)大約0.1-100個(gè)單位的肌醇六磷酸酶，盡管該條件會(huì)根據(jù)肌醇六磷酸酶的來源有些變化。1個(gè)單位的肌醇六磷酸酶的活性用從作為底物的肌醇六磷酸在pH5.5和37℃下的酶促反應(yīng)的起始狀態(tài)一分鐘內(nèi)釋放出1μmol磷酸所需的酶的量來定義。
不同于上述熱處理的pH和溫度，熱處理時(shí)間長短對(duì)分離方法中的所經(jīng)歷的困難沒有明顯的影響，因此不夠重要。熱處理過程中pH超出3.8-6.8的范圍，或溫度超出30℃-75℃的范圍會(huì)導(dǎo)致7S球蛋白和11S球蛋白分離困難。
熱處理之后，可在同樣的溫度下進(jìn)行分離，盡管優(yōu)選確保低溫以控制微生物?？梢允褂靡阎姆蛛x操作(例如過濾和離心)來完成分離，特別是用連續(xù)離心機(jī)(例如傾析器)也可以完成簡單的分離。當(dāng)然不排除使用非連續(xù)離心機(jī)例如間歇式離心機(jī)。
本發(fā)明的分離為富含7S球蛋白的可溶解級(jí)分和富含11S球蛋白的不溶解級(jí)分的精確性可以依據(jù)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的譜帶(純度基于SPE標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行評(píng)價(jià)。
然而，因?yàn)榛赟PE標(biāo)準(zhǔn)的純度由于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中油體結(jié)合蛋白的低可染性會(huì)被低估，通過上述等式校正純度(％)＝(100(％)-氯仿-甲醇可提的油份含量(％)×10)×A(％)/100獲得的校正純度被認(rèn)為更接近真實(shí)的純度。
分離之后，可溶解級(jí)分就可用作富含7S球蛋白的級(jí)分或者再經(jīng)過濃縮、中和、滅菌或干燥?？梢酝ㄟ^例如調(diào)節(jié)pH4.0-5.0調(diào)節(jié)其離子強(qiáng)度小于0.2來分離并收集所得的不溶解級(jí)分。通常，用水進(jìn)一步稀釋可溶解級(jí)分，中和，熱滅菌并干燥。可以采用已知的如HTST、UHT處理方法進(jìn)行熱滅菌。當(dāng)然，根據(jù)特定的目的，該級(jí)分可以用例如溶液形式的蛋白酶的酶進(jìn)行處理。
為了從不溶解的油體結(jié)合蛋白[包括“okara(源自豆?jié){或豆腐生產(chǎn)中的不溶殘?jiān)?”組分，當(dāng)不溶解級(jí)分含有它時(shí)]中分離出11S球蛋白，在分離之后可以使用適當(dāng)?shù)刂行运芤?pH6.5-7.5)從不溶解級(jí)分溶解或提取11S球蛋白。此時(shí)，為了在防止油體結(jié)合蛋白的溶解的同時(shí)選擇性的溶解或提取11S球蛋白，優(yōu)選使用盡可能弱的剪應(yīng)力來溶解或提取11S球蛋白。優(yōu)選離心力在大約4,000G或更高的高G離心分離機(jī)，更優(yōu)選大約5,000G或更高的高G離心分離機(jī)順利地用于從油體結(jié)合蛋白分離提純或溶解11S球蛋白，從而可以在保持11S球蛋白相對(duì)于11S球蛋白和7S球蛋白總量的比例為0.7或更高的同時(shí)，可以獲得固體成分中氯仿-甲醇可提油分的含量為2％或更低的蛋白質(zhì)。
被適當(dāng)?shù)刂行运芤喝芙饣蛱崛〔⑶液?％或更低的氯仿-甲醇可提的油份成分的富含11S球蛋白的級(jí)分就可被用作富含11S球蛋白的級(jí)分或經(jīng)過濃縮、中和、滅菌或干燥。例如可以通過調(diào)節(jié)可溶解級(jí)分的pH為4.5或更高但低于5.6來分離并收集所得的不溶解級(jí)分來進(jìn)行濃縮。該不溶解級(jí)分通常用水進(jìn)一步稀釋、中和和熱滅菌之后的干燥?？梢圆捎靡阎娜鏗TST、UHT處理方法進(jìn)行熱滅菌。當(dāng)然，根據(jù)特定的目的，不溶解級(jí)分可以用例如溶液形式的蛋白酶的酶進(jìn)行處理。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不是用于限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。
實(shí)施例1通過壓榨大豆并用萃取劑，正己烷，提取其中的油來分離并除去油獲得的幾乎沒有變性的脫脂大豆(1重量份，氮溶解指數(shù)(NSI)91)加入抽提水(10重量份，離子交換水)。在22℃用均質(zhì)混勻機(jī)攪拌混合物。通過加入20％的氫氧化鈉保持pH7.5提取40分鐘。然后，抽取物用濾布過濾，接著5,000G離心10分鐘除去不溶解級(jí)分，從而獲得脫脂豆?jié){。用35％的鹽酸調(diào)節(jié)該豆?jié){的pH到4.5，接著4,000G離心10分鐘來獲得酸沉蛋白質(zhì)。離子交換水加到酸沉蛋白質(zhì)中使得蛋白質(zhì)成分的干重為5％，接著該溶液用Polytron(由KINEMATICA AG制造)均化(以下稱為凝乳)。該凝乳的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)至0.14，并在22℃攪拌30分鐘，接著用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)該凝乳的pH到5.3，隨后在22℃攪拌20分鐘。然后加熱該凝乳至50℃，并在50℃攪拌10分鐘之后，立刻冷卻該凝乳至22℃。從加熱開始到冷卻至22℃所需的時(shí)間為25分鐘。在進(jìn)一步在22℃攪拌15分鐘之后，用LUMiFuge114測(cè)定不溶解級(jí)分的分離沉淀速率。同時(shí)，把通過5,000G離心分離5分鐘獲得的溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行化驗(yàn)，確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率(通過用光密度計(jì)測(cè)量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的譜帶獲得的各級(jí)分的面積比)。
不溶解級(jí)分的分離沉淀速率如表1所示，可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表2所示。
對(duì)比實(shí)施例1按照與實(shí)施例1相同方法制備的5％的凝乳的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)節(jié)至0.14。在22℃攪拌30分鐘該凝乳，用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH到5.3，然后在22℃攪拌60分鐘。按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率，接著把通過5,000G離心分離5分鐘獲得的溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行化驗(yàn)來確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
不溶解級(jí)分的分離沉淀速率如表1所示，可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表2所示。
表1不溶解級(jí)分的分離沉淀速率

表27S球蛋白和11S球蛋白的比率

從實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1的結(jié)果可知，含有高純度7S球蛋白的可溶解級(jí)分和含有高純度11S球蛋白的不溶解級(jí)分的分離可以通過酸性條件下加熱該凝乳得到進(jìn)一步的促進(jìn)。
實(shí)施例2按照與實(shí)施例1相同方法制備的5％的凝乳的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)節(jié)至0.14。不用調(diào)節(jié)pH(pH大約4.5)，在22℃攪拌30分鐘，加熱至50℃，接著立刻冷卻至22℃。從加熱開始到冷卻至22℃所需的時(shí)間為15分鐘。冷卻后，用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)該凝乳的pH到5.5，接著攪拌15分鐘。按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率，并確定可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表3所示，不溶解級(jí)分的分離沉淀速率如表4所示。
對(duì)比實(shí)施例2按照與實(shí)施例1相同方法制備的5％的凝乳經(jīng)過與實(shí)施例2(pH未調(diào)節(jié)；該凝乳在22℃攪拌30分鐘，加熱至50℃，接著立刻冷卻至22℃。)相同的熱處理，沒有調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度(離子強(qiáng)度0.013)。然后，凝乳的pH用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至5.9(不能獲得具有相似7S球蛋白和11S球蛋白的比率的級(jí)分，除非當(dāng)離子強(qiáng)度低時(shí)提高用于分離可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分的pH)。攪拌15分鐘之后，按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率，并測(cè)量可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表3所示，不溶解級(jí)分的分離沉淀速率如表4所示。
表37S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S11S)

表4不溶解級(jí)分的分離沉淀速率

從實(shí)施例2和對(duì)比實(shí)施例2的結(jié)果可知，從含有11S球蛋白的不溶解級(jí)分分離出含有7S球蛋白的可溶解級(jí)分可以通過提高離子強(qiáng)度和降低分離pH得到進(jìn)一步的促進(jìn)。
從以上實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例的結(jié)果可知，與僅僅在酸性條件下的熱處理或僅僅調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度相比，含有7S球蛋白的可溶解級(jí)分和含有11S球蛋白的不溶解級(jí)分的分離可以通過酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理與調(diào)節(jié)離子的結(jié)合得到進(jìn)一步的促進(jìn)。
實(shí)施例3按照與實(shí)施例1相同方法脫脂的幾乎沒有變性的脫脂大豆1個(gè)重量份加入抽提水(離子交換水，10個(gè)重量份，22℃)(以下稱為脫脂大豆?jié){液)。離子強(qiáng)度用氯化鈉提調(diào)節(jié)至0.17，并且沒有調(diào)節(jié)pH在22℃攪拌器攪拌凝乳30分鐘。然后，pH用35％的鹽酸調(diào)節(jié)至5.3，并將該粗制的凝乳加熱至50℃，攪拌器攪拌10分鐘，接著立即冷卻至22℃。加熱至50℃所需時(shí)間為10分鐘，而冷卻至22℃所需時(shí)間為5分鐘。冷卻后，用35％的鹽酸調(diào)節(jié)該粗制的凝乳的pH至4.8，在22℃額外攪拌10分鐘，按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率。進(jìn)一步的，至于通過5,000G離心5分鐘所得的可溶解級(jí)分，按照與實(shí)施例1相同方法確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。另一方面，水(7倍于脫脂大豆重量)加到不溶解級(jí)分中，并且在22℃通過均質(zhì)機(jī)攪拌30分鐘提取蛋白質(zhì)，同時(shí)其pH通過加入20％氫氧化鈉水溶液保持在7.2，并且通過5,000G離心5分鐘所得的可溶解級(jí)分用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳化驗(yàn)來確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
對(duì)比實(shí)施例3按照與實(shí)施例3相同方法制備的脫脂大豆?jié){液的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)節(jié)至0.17，并且在22℃攪拌漿液30分鐘。然后，脫脂大豆?jié){液的pH用35％的鹽酸調(diào)節(jié)至5.3，接著在22℃攪拌25分鐘。然后，該漿液的pH用20％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至4.8，并在22℃攪拌10分鐘，測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率，并按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表5所示，不溶解級(jí)分的分離沉淀速率如表6所示。
表57S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S∶11S)

表6不溶解級(jí)分的分離沉淀速率

從實(shí)施例3和對(duì)比實(shí)施例3的結(jié)果可知，當(dāng)使用脫脂大豆?jié){液時(shí)可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分的分離也可以通過調(diào)節(jié)酸性條件下的熱處理溫度和離子強(qiáng)度得到促進(jìn)。
實(shí)施例4按照與實(shí)施例1相同方法制備的5％的凝乳的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)節(jié)至0.17。在按照與實(shí)施例1相同方法加熱該凝乳之后。(不用調(diào)節(jié)pH用攪拌器在22℃攪拌30分鐘，pH調(diào)節(jié)至5.3，并將該凝乳攪拌器攪拌加熱至50℃，接著立刻冷卻至22℃)。然后，用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH到5.4(用于分離凝乳的pH應(yīng)比此值高，因?yàn)闉榱双@得具有同樣7S球蛋白和11S球蛋白比率的級(jí)分從脫脂大豆豆?jié){和凝乳中分離脫脂大豆豆?jié){，此時(shí)脫脂大豆豆?jié){的離子強(qiáng)度與凝乳的相同)，接著在22℃額外攪拌10分鐘。按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表7所示，不溶解級(jí)分的分離沉淀速率如表8所示。
表77S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S∶11S)

表8不溶解級(jí)分的分離沉淀速率

從實(shí)施例3和實(shí)施例4的結(jié)果可知，如果在含有大豆蛋白的溶液中使用脫脂的大豆?jié){液，使用較高的不溶解級(jí)分的分離沉淀速率更促進(jìn)分離。
實(shí)施例5按照與實(shí)施例1相同方法制備的5％的凝乳的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)節(jié)至0.14，pH未調(diào)節(jié)(pH大約4.5)在22℃攪拌該漿液30分鐘，接著加熱至50℃。升溫至50℃所需的時(shí)間為10分鐘。溫度升到50℃之后，漿液的pH用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至5.3，并額外加熱該漿液20分鐘，接著冷卻至22℃。冷卻所需的時(shí)間為5分鐘。冷卻后，5,000G離心分離該漿液10分鐘來獲得可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分。
所得可溶解的級(jí)分用35％的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.5，3,000G離心10分鐘來獲得沉淀級(jí)分。然后，該沉淀級(jí)分加入水，用20％的氫氧化鈉水溶液中和該混合物，并且凍干來獲得富含7S球蛋白級(jí)分。
另一方面，5倍重量的離子交換水加到由5,000G離心10分鐘來獲得的不溶解級(jí)分，用攪拌器在22℃攪拌30分鐘萃取該混合物，同時(shí)該混合物的pH用20％氫氧化鈉水溶液保持在6.8。然后，該混合物在5,000G離心10分鐘，并且所得的上層溶液的pH用35％的鹽酸調(diào)節(jié)至4.5，接著在3,000G離心10分鐘來獲得沉淀級(jí)分。然后，該沉淀級(jí)分加入水，并且該混合物用20％氫氧化鈉水溶液中和，且凍干來獲得富含11S球蛋白級(jí)分。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定各級(jí)分中7S∶11S的比率、富含7S球蛋白級(jí)分中7S球蛋白的純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))和富含11S球蛋白級(jí)分中11S球蛋白的純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))、氯仿-甲醇可提的油份的量、7S球蛋白的校正純度、11S球蛋白的校正純度和各級(jí)分中肌醇六磷酸的含量如表9所示。表10顯示了按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率。
表9各級(jí)分的組成(單位％)

表10不溶解級(jí)分的分離沉淀速率

從以上結(jié)果可知，含有微量的氯仿-甲醇級(jí)分，或含有微量的油體結(jié)合蛋白的高純化的7S和11S球蛋白級(jí)分可以通過本發(fā)明的方法獲得。
從實(shí)施例1的結(jié)果其中樣品溶液立即冷卻未經(jīng)熱處理之后的保持溫度和從實(shí)施例5的結(jié)果其中熱處理之后保持溫度20分鐘，證明熱處理后保持溫度可以提高分離沉淀速率。
實(shí)施例6按照與實(shí)施例1相同方法制備的5％的凝乳的離子強(qiáng)度用氯化鈉調(diào)節(jié)至0.14，pH未調(diào)節(jié)(pH大約4.5)在22℃攪拌該漿液30分鐘，接著加熱至50℃。加熱所需的時(shí)間為10分鐘。當(dāng)溫度升到50℃時(shí)，漿液的pH用20％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至5.3。然后，肌醇六磷酸酶(Sumizyme PHY，Shin Nihon Chemical Co.Ltd.生產(chǎn))基于脫脂大豆的重量計(jì)以0.2％重量比加入，并且該漿液用攪拌器額外攪拌20分鐘。然后，該漿液冷卻至22℃。冷卻所需的時(shí)間為5分鐘。冷卻之后，該漿液在5,000G離心10分鐘來獲得可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分。所得的可溶解級(jí)分用35％的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.5，3,000G離心10分鐘來獲得沉淀級(jí)分。然后，該沉淀級(jí)分加入水，用20％的氫氧化鈉水溶液中和該混合物，并且凍干來獲得富含7S球蛋白級(jí)分。
另一方面，5倍重量的離子交換水加到經(jīng)5,000G離心10分鐘之后獲得的不溶解級(jí)分，用攪拌器在22℃攪拌該混合物，并被萃取30分鐘，同時(shí)該混合物的pH用20％氫氧化鈉水溶液保持在6.8。然后，該混合物在5,000G離心10分鐘，所得的上層溶液的pH用35％的鹽酸調(diào)節(jié)至4.5，接著在3,000G離心10分鐘來獲得沉淀級(jí)分。然后，該沉淀級(jí)分加入水，并且該混合物用20％氫氧化鈉水溶液中和，且凍干來獲得富含11S球蛋白級(jí)分。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定各級(jí)分中7S∶11S的比率、富含7S球蛋白級(jí)分中7S球蛋白的純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))和富含11S球蛋白級(jí)分中11S球蛋白的純度(SPE標(biāo)準(zhǔn))、氯仿-甲醇可提的油份的量、7S球蛋白的校正純度、11S球蛋白的校正純度和各級(jí)分中肌醇六磷酸的含量如表11所示。表12顯示了按照與實(shí)施例1相同方法測(cè)量不溶解級(jí)分的分離沉淀速率。
表11各級(jí)分的組成(單位％)

表12不溶解級(jí)分的分離沉淀速率

從實(shí)施例5和實(shí)施例6的結(jié)果可知，用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸的伴隨使用促進(jìn)了可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分的分離，從而可能獲得富含7S球蛋白的級(jí)分和富含11S球蛋白的級(jí)分，其都含有更少的肌醇六磷酸。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，依據(jù)本發(fā)明，富含7S球蛋白的可溶級(jí)分和富含11S球蛋白的不溶級(jí)分可以簡單容易地通過結(jié)合調(diào)節(jié)含有大豆蛋白的溶液的離子強(qiáng)度和酸性條件下的熱處理實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的分離。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)大豆蛋白的方法，其包括在酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液，然后在離子強(qiáng)度為0.02或更高并且pH為4.5或更高但低于5.6的條件下將其分成可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中含有大豆蛋白的溶液為脫脂大豆的水漿液、從該漿液獲得的脫脂大豆豆?jié){、酸沉大豆蛋白漿液或大豆蛋白分離物的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的酸性條件為pH3.8-6.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的加熱在30-75℃進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括從由權(quán)利要求1的分離獲得的可溶解級(jí)分中分離出7S球蛋白，其中所述的7S球蛋白的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.5或更高，并且所述7S球蛋白的固體內(nèi)容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的極性脂類的含量為1重量％或更低。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法獲得的7S球蛋白，其中7S球蛋白的固體內(nèi)容物中肌醇六磷酸的含量為1.2重量％或更低。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括從由權(quán)利要求1的分離獲得的不溶解級(jí)分中分離出11S球蛋白，其中所述的11S球蛋白的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.7或更高，并且所述11S球蛋白的固體內(nèi)容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的極性脂類的含量為2重量％或更低。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法獲得的11S球蛋白，其中11S球蛋白的固體內(nèi)容物中肌醇六磷酸的含量為1.2重量％或更低。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種分離7S球蛋白和11S球蛋白的新方法，特別是，可以以工業(yè)規(guī)模實(shí)施的高精確度和效率的分離方法。還意欲獲得含有很少脂類結(jié)合蛋白，并且顯示固有的高純度7S球蛋白和11S球蛋白的特征的蛋白級(jí)分。一種用于生產(chǎn)大豆蛋白的方法，其特征在于包括在pH 3.8－6.8酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液到30－75℃，然后在離子強(qiáng)度為0.02或更高并且pH為4.5或更高但低于5.6的條件下將其分成可溶解級(jí)分和不溶解級(jí)分。
文檔編號(hào)A23J1/14GK1738540SQ20038010867
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者石川正廣, 廣塚元彥 申請(qǐng)人:不二制油株式會(huì)社