專利名稱：一種新型空氣微生物采樣液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
空氣微生物對(duì)人類健康帶來(lái)的危害日益嚴(yán)重并逐步引起各方關(guān)注?？諝馕⑸镏幸环N或多種組分會(huì)對(duì)暴露其中對(duì)象的健康產(chǎn)生影響?？諝馕⑸锱c很多疾病有關(guān)，它們或作為過(guò)敏原引起過(guò)敏反應(yīng)(如真菌孢子)；或作為傳染原引起傳染病(如結(jié)核分枝桿菌)；而且有些較低濃度的空氣微生物就可以引起急性或慢性的健康損害。由于當(dāng)今生活水平和生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)空氣質(zhì)量的要求也愈來(lái)愈高。所以準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)室內(nèi)外環(huán)境空氣中的微生物污染，對(duì)制定環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，消除污染危害和保證人民健康都是十分必要的。
背景技術(shù)：
空氣微生物分析的第一步是必須將空氣中的微生物收集在固體、半固體或液體基質(zhì)中，然后才能進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)、物理學(xué)、和化學(xué)分析。無(wú)論是固體還是液體的采樣基質(zhì)在應(yīng)用時(shí)都會(huì)碰到氣流撞擊的問(wèn)題，在這種沖擊下如何能保證微生物的存活是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題，所以研制一種能夠保證微生物存活和適應(yīng)后續(xù)檢測(cè)的新型采樣液就有著十分重要的意義。微生物尤其是細(xì)菌的生長(zhǎng)速度很快，例如大腸桿菌每20分鐘就能繁殖一代，如果采樣液中含有刺激細(xì)菌繁殖的物質(zhì)，那么細(xì)菌數(shù)目在采樣和遞送至分析和檢測(cè)的幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)會(huì)有驚人的增長(zhǎng)，這就造成了對(duì)采樣樣品的過(guò)高估計(jì)。過(guò)高估計(jì)樣品中的細(xì)菌數(shù)目會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果，這就會(huì)導(dǎo)致人們對(duì)本來(lái)不具危害地區(qū)采取措施，造成人力和財(cái)力的浪費(fèi)。所以選取采樣液時(shí)的一個(gè)準(zhǔn)則是保持樣品完整。既不能刺激生長(zhǎng)，也不能對(duì)樣品造成危害。例如有些報(bào)道使用培養(yǎng)基來(lái)直接采樣，如果是在夏季高溫下進(jìn)行采樣而又未能及時(shí)進(jìn)行分析，則采樣液中的微生物尤其是細(xì)菌就會(huì)很快繁殖，造成一個(gè)不可信的結(jié)果。
目前國(guó)際上對(duì)于空氣微生物采樣液的使用還沒(méi)有一個(gè)普遍認(rèn)可的方案，在使用采樣液時(shí)基本上是各行其是。隨意使用采樣液的后果是可能低估或高估空氣微生物的含量，這就給實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋帶來(lái)了一定困難。例如有人使用的采樣液是最單純的無(wú)菌水，而有人使用一些簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)鹽緩沖液，這些采樣液僅起到一個(gè)收集作用，對(duì)微生物的保護(hù)和穩(wěn)定作用較差，也不能滿足我們?cè)谀承┨厥鈼l件下的需要(比如在冷凍溫度下使用)。保證存活對(duì)于微生物的分離培養(yǎng)和鑒定是十分必要的，因此研制新型空氣微生物采樣液具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種空氣微生物采樣液。
本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明空氣微生物采樣液含有如下組合物0.05mol/L PBS〔磷酸鹽緩沖液〕150-300體積份〔重量體積比為g/ml〕、肌醇10-30重量份、海藻糖10-30重量份、甜菜堿1.0-5.0體積份、甘油100-350體積份、去離子水300-800體積份；采樣液中0.05mol/L PBS 150-300體積份可以用1mol/L Tris-HCl 5-15體積份替代；其中0.05mol/L PBS由40重量份NaCl，1.0重量份KCl，7.2g Na2HPO4，1.2重量份KH2PO4，1體積份(重量體積比為g/L)H2O，pH7.4制成；1mol/L Tris-HCl由121重量份Tris堿，1體積份(重量體積比為g/L)H2O，pH調(diào)至7.4制成；上述組合物加入常規(guī)溶劑制成采樣液。
與常規(guī)采樣液相比，本發(fā)明采樣液能夠保持樣品完整，既不刺激空氣微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)具有較好的保護(hù)效果。本發(fā)明采樣液同時(shí)具有一定的抗凍、抗蒸發(fā)能力，可以在零下10攝氏度使用，在夏季使用可具有一定的抗蒸發(fā)性。
采樣是空氣微生物分析和檢驗(yàn)的第一個(gè)步驟，而采樣液是空氣采樣得以實(shí)現(xiàn)的必要條件和手段，采樣液的使用直接關(guān)系到樣品的處理、分析和檢測(cè)效果，因此采樣液研究對(duì)于環(huán)境監(jiān)測(cè)、衛(wèi)生檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查、工程菌污染評(píng)估、空氣過(guò)敏源確定等方面都具有重要的意義。隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)環(huán)境衛(wèi)生愈加重視，對(duì)空氣質(zhì)量要求越來(lái)越高，能夠用于大部分空氣微生物檢測(cè)的新型采樣液會(huì)有一定的需求量。
實(shí)驗(yàn)例1正交實(shí)驗(yàn)選取0.05mol/L PBS(40g NaCl，1.0g KCl，7.2g Na2HPO4，1.2g KH2PO4，1L H2O，pH7.4)或1mol/L Tris-HCl(121g Tris堿，pH調(diào)至7.4)(為了統(tǒng)計(jì)處理方便，這兩種成分以下簡(jiǎn)稱(A)，肌醇(B)，海藻糖(C)，甜菜堿(D)和甘油(E)五種成分作為采樣液的組成部分，每個(gè)成分取三個(gè)濃度，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)測(cè)試靜態(tài)下各種成分對(duì)細(xì)菌的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)來(lái)自正交表L27(313)，每個(gè)成分的三個(gè)濃度即為三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)水平，五種成分即為實(shí)驗(yàn)所涉及的因素?cái)?shù)，即我們實(shí)驗(yàn)中所選用的各種試劑，正交表第一列的1-27代表實(shí)驗(yàn)次數(shù)，即將要進(jìn)行27個(gè)平行實(shí)驗(yàn)(表1，表2)。此外根據(jù)試劑性質(zhì)和工作經(jīng)驗(yàn)，考慮三個(gè)交互作用AB，AC，AE。
表1.27次試驗(yàn)正交安排表試驗(yàn)號(hào)1(A)2(B)5(C)8(E) 11(D)1 1 1 1 1 12 1 1 2 2 23 1 1 3 3 34 1 2 1 2 35 1 2 2 3 16 1 2 3 1 27 1 3 1 3 28 1 3 2 1 39 1 3 3 2 110 2 1 1 1 111 2 1 2 2 212 2 1 3 3 313 2 2 1 2 314 2 2 2 3 115 2 2 3 1 216 2 3 1 3 217 2 3 2 1 318 2 3 3 2 119 3 1 1 1 120 3 1 2 2 221 3 1 3 3 322 3 2 1 2 323 3 2 2 3 124 3 2 3 1 225 3 3 1 3 226 3 3 2 1 327 3 3 3 2 1
表2.正交表中的各個(gè)因素及其水平因素 A(PBS or B C E DTris)水平10.01mol/L 0.5％0.5％ 5％ 0.1mol/L水平20.02mol/L 1％ 1％ 10％ 0.2mol/L水平30.05mol/L 2％ 2％ 30％ 0.5mol/L此正交設(shè)計(jì)針對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和粘質(zhì)沙雷氏菌均同時(shí)開展實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)步驟為，將9.5ml最終配方液體置于大試管內(nèi)，加入0.5ml菌液，室溫放置30min，然后從每個(gè)大試管中取1ml涂布兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)12小時(shí)后計(jì)菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為10ml無(wú)菌去離子水。完畢后用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果選取保護(hù)效果較好的前8種，命名為Samplution PX1，PX2，PD1，PD2，TX1，TX2，TD1和TD2。其中X代表夏用型，D代表冬用型。
表3六次正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果(P1/P2/T1/T2/粘沙/金葡) 存活率％ 存活率提高百分點(diǎn)％管號(hào)(單位CFU) 計(jì)數(shù)結(jié)果/菌總數(shù)×100％ (計(jì)數(shù)-對(duì)照)/菌總數(shù)×100％1335/143/157/242/756/24389.8/77.3/53.2/71.8/99.5/10568.9/48.1/44.1/17.5/33.2/31.02350/138/175/229/748/20593.8/74.6/77.6/68.0/98.4/89.1 72.9/45.4/50.2/13.6/32.1/14.53264/108/141/238/648/18470.8/58.4/47.8/70.6/85.3/79.2 49.9/29.2/38.6/16.3/18.9/4.514266/76 /146/238/666/16971.3/41.1/49.5/70.6/87.6/73.5 50.4/11.9/40.3/16.3/21.3/-1.15265/167/160/261/771/22371.0/90.3/54.2/77.4/100 /97.0 50.1/61.1/45.1/23.1/35.1/22.36307/172/163/265/690/23382.3/93.0/55.3/78.6/90.8/10161.4/63.8/46.1/24.3/24.5/26.77364/161/162/247/739/20797.6/86.5/54.9/73.3/97.2/90.0 76.7/57.8/45.8/19.0/30.9/15.48252/108/118/269/693/22367.6/58.4/40.0/79.8/91.2/97.0 46.6/29.2/30.8/25.5/24.9/22.39336/149/152/277/672/17190.1/80.5/51.5/82.2/88.4/74.3 69.2/51.4/42.4/27.9/22.1/0.010314/141/127/252/752/27784.2/76.2/43.1/74.8/98.9/12063.3/47.0/38.6/20.5/32.6/45.811327/150/165/262/672/21887.7/81.0/55.9/77.7/88.4/94.8 66.8/51.9/41.7/23.4/22.1/20.112240/98 /97 /236/618/19964.3/53.0/32.9/70.0/81.3/86.5 43.4/23.8/24.1/15.7/15.0/11.913258/107/117/235/686/19969.2/57.8/39.7/69.7/90.3/86.5 48.3/28.6/27.1/15.4/23.9/11.914331/146/185/211/683/27388.7/78.9/62.7/62.6/89.9/11967.8/49.7/40.3/8.30/23.6/47.115341/147/179/170/645/19591.4/79.5/60.7/50.4/84.9/84.8 70.5/50.2/40.7/-3.9/18.6/10.216319/157/141/195/739/22785.5/84.9/47.8/57.9/97.2/98.7 64.6/55.7/44.1/3.60/30.9/24.117204/87 /104/235/676/20254.7/47.0/35.3/69.7/88.9/87.8 33.8/17.8/20.3/15.4/22.6/13.018342/129/139/340/756/18691.7/69.7/47.1/100 /99.5/80.9 70.8/40.5/34.6/46.6/33.2/6.2519295/133/125/308/745/21479.1/71.9/42.4/91.4/98.0/93.0 58.2/42.7/35.9/37.1/31.7/18.420346/135/151/289/718/20392.8/73.0/51.2/85.8/94.5/88.3 71.8/43.8/36.6/31.5/28.2/13.621216/99 /91 /240/569/19257.9/53.5/30.8/71.2/74.9/83.5 37.0/24.3/24 4/16.9/0.09/8.8622223/80 /123/190/670/20959.8/43.2/41.7/56.4/88.2/90.9 38.9/14.1/18.0/2.00/21.8/16.323292/139/153/285/745/20078.3/75.1/51.8/84.6/98.0/87.0 57.4/45.9/38.0/30.3/31.7/12.324352/135/143/326/741/18494.4/73.0/48.5/96.7/97.5/80.0 73.5/43.7/36.6/42.1/31.2/5.3825324/151/144/279/679/19686.9/81.6/48.8/82.8/89.3/85.2 66.0/52 4/42.0/28.5/23.0/10.626194/99 /93 /220/558/19652.0/53.5/31.5/65.3/73.4/85.2 31.1/24.3/24.4/11.0/0.07/10.627324/141/130/248/662/16286.9/76.2/44.1/73.6/87.1/70.4 66.0/47.0/38.6/19.3/20.8/-4.1
說(shuō)明大腸桿菌包括P1，P2，T1，T2四次試驗(yàn)，粘質(zhì)沙雷氏菌(表中簡(jiǎn)稱粘沙)和金黃色葡萄球菌(表中簡(jiǎn)稱金葡)各一次。P1，P2，T1，T2，粘沙和金葡六個(gè)對(duì)照0min結(jié)果依次為；373，185，295，337，7602和302 CFU，60min后對(duì)照組結(jié)果依次為78，54，27，183，504和172 CFU。
正交試驗(yàn)結(jié)果表明采樣液與對(duì)照組相比，在靜態(tài)下對(duì)三種細(xì)菌保護(hù)效率平均提高58.2％，40.5％，44.1％，20.5％(大腸桿菌四次實(shí)驗(yàn))，24.7％(粘質(zhì)沙雷氏菌)和15.4％(金黃色葡萄球菌)。SAS統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，成分D在整個(gè)采樣液中所起的顯著性作用比較明顯。AB、AC和AE之間都沒(méi)有明顯的交互作用(表3)。在幾種試劑之間并不存在著交互作用，這意味著幾種試劑可以以任意比例混溶，對(duì)采樣液定型設(shè)計(jì)有很大的方便。
實(shí)驗(yàn)例28種Samplution進(jìn)行抗凍、抗蒸發(fā)和初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。
將冬用型Samplution 10ml置入-20℃冰箱中放置，30min觀察是否結(jié)冰。將10ml Samplution置于10ml錐形管中，37℃放置30min記錄剩余液體量。使用AGI-10采樣器，內(nèi)裝10ml不同配方的采樣液，在室溫下使用打氣機(jī)在7L/min恒定流速下打氣30min。使用大容量采樣器采樣，同時(shí)使用10mlSamplution、PBS和LB肉湯，觀察剩余液體量。
靜態(tài)下Samplution為無(wú)色、無(wú)味、透明均一的液體，pH值約為7.4-7.6，密度在1.1-1.2之間(表4)。靜態(tài)下Samplution在35℃，30min中內(nèi)基本沒(méi)有蒸發(fā)作用，但在動(dòng)態(tài)下即20℃，30min和35℃，30min時(shí)有較大程度的蒸發(fā)作用，與無(wú)菌水相比基本沒(méi)有差別(表5)。但在使用大容量采樣器時(shí)，Samplution抗蒸發(fā)效果就顯示出來(lái)了，它比PBS和肉湯蒸發(fā)作用減少了10％。冬用型Samplution在-20℃時(shí)全部未結(jié)冰，但在-25℃時(shí)有微量結(jié)冰現(xiàn)象。
表4 Samplution的密度和pH值采樣液 PX1 PX2 PD1PD2TX1TX2TD1TD2密度 1.151.151.21 1.21 1.14 1.16 1.21 1.21pH 7.357.277.23 7.27 7.74 7.67 7.67 7.64
表5 Samplution動(dòng)態(tài)下蒸發(fā)量(30min后)采樣液 PX1PX2PD1PD2TX1TX2TD1TD220℃ 1.71.71.41.82.01.72.01.335℃ 1.91.91.82.01.82.02.02.0在經(jīng)過(guò)綜合考慮后，我們淘汰了其中四種采樣液，剩下的4種為PD1(A1B3C3D1E3，即0.01mol/L PBS、2％肌醇、2％海藻糖、0.1mol/L甜菜堿和30％甘油)，PX2(A1B3C3D1E1，即0.01mol/L PBS、2％肌醇、2％海藻糖、0.1mol/L甜菜堿和10％甘油)，TD1(A1B3C3D2E3，即0.01mol/L Tris-HCl、2％肌醇、2％海藻糖、0.2mol/L甜菜堿和30％甘油)，和TX2(A1B3C3D2E1，即0.01mol/L Tris-HCl、2％肌醇、2％海藻糖、0.2mol/L甜菜堿和10％甘油)。
實(shí)驗(yàn)例3實(shí)際應(yīng)用初步應(yīng)用的測(cè)試在500L氣霧室中進(jìn)行，測(cè)試菌株使用大腸桿菌。使用TK-2型氣溶膠發(fā)生器發(fā)生大腸桿菌氣溶膠，發(fā)生5min后利用AGI-10采樣器以7L/min恒定流速采樣(此時(shí)氣溶膠發(fā)生器繼續(xù)發(fā)生氣溶膠)，內(nèi)裝10mlSamplution，采樣時(shí)間為5min。然后從每個(gè)采樣器中取1ml涂布兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)12小時(shí)后計(jì)菌落數(shù)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為10ml無(wú)菌PBS。觀察Samplution對(duì)細(xì)菌回收率。采樣器中剩余液體取一定量進(jìn)行核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，觀察采樣液對(duì)核酸分析的影響。
4種采樣液在動(dòng)態(tài)條件下對(duì)待測(cè)微生物具體保護(hù)效果(以提高百分比計(jì)，括號(hào)中的兩個(gè)數(shù)值，前者為Samplution采樣液中細(xì)菌菌落數(shù)，后者為對(duì)照組菌落數(shù))為PD1(153/47226％)；PX2(111/17553％)；TD1(120/48150％)；TX2(419/114268％)。采樣液對(duì)隨后的核酸檢測(cè)有輕微影響，但可以通過(guò)氯仿抽提或快速核酸抽提技術(shù)消除。甚至在對(duì)照樣品中微生物回收率為0的情況下，Samplution中仍能夠有效回收到較低濃度的微生物。
Samplution對(duì)核酸分析的影響。當(dāng)待測(cè)樣品占擴(kuò)增體系的10％時(shí)，基本不會(huì)影響以后的核酸擴(kuò)增；當(dāng)待測(cè)樣品占擴(kuò)增體系40％或以上時(shí)，會(huì)明顯影響甚至抑制核酸擴(kuò)增；兩種緩沖體系中，PBS系統(tǒng)比Tris系統(tǒng)的影響因素更大。鑒于核酸擴(kuò)增所需樣品量較少，所以采樣液對(duì)核酸擴(kuò)增的影響基本可以忽略。使用酚氯仿抽提或使用快速核酸抽提技術(shù)則可以消除以上所有的抑制因素實(shí)施例10.05mol/L PBS 200ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿1.17g和甘油300ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃ 15min即得采樣液。
實(shí)施例20.05mol/L PBS 200ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿1.17g和甘油100ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃ 15min即得采樣液。
實(shí)施例31.0mol/L Tris-HCl 10ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿2.34g和甘油300ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃15min即得采樣液。
實(shí)施例41.0mol/L Tris-HCl 10ml、肌醇20g、海藻糖20g、甜菜堿2.34g和甘油100ml，全部組合物溶解混勻后定容至1L；置于高壓蒸汽滅菌器中110℃15min即得采樣液。
權(quán)利要求
1.一種空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 150-300體積份、肌醇10-30重量份、海藻糖10-30重量份、甜菜堿0.5-5重量份、甘油100-350體積份，300-800體積份H2O。
2.如權(quán)利要求1所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中PBS可以用5-15體積份1mol/L Tris-HCl替代。
3.如權(quán)利要求1所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 200體積份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿1.17重量份和甘油300體積份，500體積份H2O。
4.如權(quán)利要求1所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 200體積份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿1.17重量份和甘油100體積份，700體積份H2O。
5.如權(quán)利要求2所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物Tris堿1.21重量份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿2.34重量份和甘油300體積份，700體積份H2O。
6.如權(quán)利要求2所述的空氣微生物采樣液，其特征在于該采樣液中含有如下組合物Tris堿1.21重量份、肌醇20重量份、海藻糖20重量份、甜菜堿2.34重量份和甘油100體積份，900體積份H2O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種空氣微生物采樣液，該采樣液中含有如下組合物0.05mol/L PBS 150－300體積份(或1.0mol/L Tris－HCl 5－15體積份)、肌醇10－30重量份、海藻糖10－30重量份、甜菜堿1.0－1.5重量份、甘油100－350體積份，H
文檔編號(hào)C12Q1/24GK1519327SQ0310067
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月21日
發(fā)明者翟俊輝, 陳梅玲, 徐秀芝, 孫振海, 車?guó)P翔 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物