專利名稱：：用于生物轉化的植物酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物轉化領域，使用植物酶從價值較低的底物生產調味品、香料、藥物或生物控制劑。更具體地說，本發(fā)明涉及通過使用植物酶而生產萜類化合物的方法。現(xiàn)代化學強烈依賴于催化劑的使用以有效而完全反應，產生最少的廢物。特別是在工業(yè)中生物催化劑(酶、細胞)的使用明顯增加。生物催化劑的最重要特征是(Faber，2000)1.它們非常有效；2.它們是環(huán)境可接受的；3.它們可在溫和條件下操作；4.它們是選擇性的。迄今為止，用于工業(yè)和實驗室應用的采用生物催化的生物轉化中使用的大多數酶得自微生物來源。一少部分酶得自植物來源(Faber，2000)。然而，對化學家和生物學家而言，植物王國是重要來源，因為植物產生各種各樣的化合物(Franssen和Walton，1999)。其基本原理很簡單植物沒有辦法能從其捕食者逃脫，因此它們必須通過化學方法保護其自身。植物產生具有最奇異化學結構的化合物抗腫瘤藥物Taxol(來自短葉紅豆衫(Taxusbrevifolia))、昆蟲取食抑制劑印苦楝子素(來自印度楝樹Azadirachtaindica)及止痛劑嗎啡(來自罌粟(Papaversomniferium))。正是主要因為如這些的化合物的極大重要性，科學研究已經并且仍然感興趣于植物細胞和酶的應用，盡管它們有時具有一些缺點(Walton和Brown，1999)。到目前為止，最重要的次生代謝物是萜類化合物，所述次生代謝物其含多種作為調味品、香料、藥物或生物活性(殺蟲劑、抗微生物劑、驅蟲藥、誘蟲劑等)化合物的組分。萜類化合物屬于類異戊二烯。根據定義，類異戊二烯由所謂的異戊二烯(C5)單位組成。這可以根據類異戊二烯中存在的C原子的數目識別，其通?？梢员?除(C5、C10、C15、C20、C25、C30和C40)，盡管也已經報道了不規(guī)則的類異戊二烯(例如C13、C16)及多萜(Cn)。萜類化合物由單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和多萜(橡膠)等組成。單萜和倍半萜，類異戊二烯家族的C10和C15分支，在食品和化妝品中作為調味品和香料具有經濟學價值，并可能具有抗癌作用和抗微生物性質。還證明單萜和倍半萜具有生態(tài)重要性，例如在植物之間，植物與昆蟲/蜘蛛螨及植物與微生物之間的相互作用和信號傳導(signaling)中。倍半萜內酯是倍半萜的重要亞組，并且已經鑒定了4000多種的不同結構?？梢垣@得關于這些類型的化合物的結構方面和生物學活性的大量信息(例如Picman，1986；Harborne等，1999；Seigler，1995)。倍半萜內酯可以占植物干重的達5％，并主要存在于菊科(Asteraceae)成員中(大約450個物種)，菊科是所有植物家族中最大的一個家族，但倍半萜內酯也存在于其它高等植物家族中如傘形科(Apiaceae)(12個物種)及低等植物如地錢中，例如耳葉苔屬(Frullania)(Harborne等人，1999)。倍半萜內酯可遍在存在于植物中，但最通常與葉、花和直根共生。菊科含有1317個屬及21000個物種。它們主要是草本植物，有時是灌木或樹，通常具有直根，有時具有塊莖。許多菊科含有(精)油器官，如導管或毛狀體，它們中的一些含有膠乳。菊科含有許多經濟植物和裝飾性植物，如向日葵(Helianthusannuus；用以生產種子和葵花油)、洋薊(菊芋(Helianthustuberosus)；其塊莖可食用，還用于生產果聚糖)，及黃花蒿(Artemisiaannua)(用以生產有效的抗瘧藥青蒿素)。還用作食物的是婆羅門參(蒜葉婆羅門參(Tragopogonporrifolius))和鴉蔥(Scorzonerahispanica)的根，朝鮮薊(洋薊(Cynarascolymus))的幼花頭，及萵苣(Lactucasativa)、苣荬菜(Cichoriumendiva)和菊苣及布魯塞爾菊苣(Cichoriumintybus)的葉。另外，有許多裝飾性菊科，例如大麗花屬(Dahlia)、多榔菊屬(Doronicum)、Helenium、萬壽菊屬(Tagetes)、向日葵屬(Helianthus)、紫苑屬(Aster)、矢車菊屬(Centanrea)、非洲菊屬(Gerbera)等。菊科的族中出現(xiàn)倍半萜內酯具有分類學影響。它們是Heliantheae共有的，在Anthemideae、Cichorieae、Cynareae、Senecioneae、Inuleae和Vernonieae中頻繁出現(xiàn)，在Eupatoriaea中很少出現(xiàn)，并且在Astereae、Mutisieae、Tageteae和Arcoteae-Calenduleae中不存在(Seigler，1995)。已經證明含有倍半萜內酯的作物物種例如是Artichoke、Lettuce、Endive、Radicchio、BrusselsEndive、向日葵、JerusalemArtichoke、Artemisiaannua、Matricariarecutita。含有倍半萜內酯的一些野生(或者裝飾性)菊科物種是Lactucavirosa、Achilleaspp.、Ambrosiaspp.Cnicusbenedictus、Artemisiaspp.、Xanthiumspp.、Ivaaxillaris、Partheniumspp.、Heleniumspp.、Hymenoxysodorata、Vernoniaspp.、Vanillosmopsisspp.、Eremanthusspp.、Moquineaspp.、Partheniumspp.、Arnicaspp.、Atractylodismacrocephala、Eupatoriumcannabium、Achilleamillefolium、Tanacetum(Chrysanthemum)vulgare、Inulahelenium和Taraxacumofficinale(Seigler，1995；VanGenderen等人，1996)。含有大量倍半萜內酯的菊科物種的一個實例是菊苣。菊苣的根由于這些倍半萜內酯而非?？唷＞哲氖情_藍花的菊科植物，其遍布于從地中海至東亞的世界各地。自十七世紀以來，已經開始培育(var.sativum)以得到其苦的根，將其烘烤并用于熱“咖啡樣”飲料中。在十九世紀中期，盡管其根的使用被來自阿拉伯咖啡的真正咖啡取代，但在黑暗中生長的菊苣(var.foliosum)的萌芽成為流行的蔬菜(比利時菊苣)?，F(xiàn)今其在比利時、法國北部和荷蘭是普遍的作物(Weeda等人，1991；Vogel等人，1996)。在生長的第一年期間，該植物產生深的直根并在短莖上產生葉叢。在暴露于寒冷環(huán)境中一段時間之后，該植物產生花分生組織。商業(yè)生產包括在達到根適當成熟階段之后收獲該植物，隨后誘導花芽(冷卻貯存)，然后是在黑暗(強制)中的花軸及周圍基生葉的加速和受控發(fā)育。強制的終產物是chicon，葉的小白頭，周圍有黃綠色區(qū)域。這種比利時菊苣以其源于倍半萜內酯的略苦的味道而出名(Pyrek，1985；Seto等人，1988；vanBeek等人，1990；Price等人，1990)。菊苣的主要倍半萜內酯是愈創(chuàng)內酯，但也存在少量的桉葉內酯和大根香葉內酯。菊苣的苦味特別與愈創(chuàng)內酯萵苣苦素、8-脫氧萵苣苦素和lactucopicrin的存在相關。盡管可以獲得關于倍半萜內酯的結構方面和生物活性的大量信息，但關于其生物合成所知甚少。迄今為止，天然存在的倍半萜內酯的最大組是大根香葉內酯組，認為大多數倍半萜內酯由此組進化而來。大根香葉內酯的最簡單成員，(+)-木香烴內酯，一般認為是所有大根香葉內酯衍生的內酯的共同中間體(Geissman，1973；Herz，1977；Fischer等人，1979；Seaman，1982；Song等人，1995)。(+)-木香烴內酯最初由Paul等人(1960)和SomasekarRao等人(1960)從木香(SaussurealappaClarke)分離，后來在各種植物中發(fā)現(xiàn)了其它倍半萜內酯(Fischer等人，1979)。其中萵苣(Lactucasativa)是與菊苣密切相關的，并也含有苦味化合物萵苣苦素和lactucopicrin的一個物種(Takasugi等人，1985；Price等人，1990)。最近，我們已經證明，菊苣中的倍半萜內酯的倍半萜烯化合物主鏈由(+)-大根香葉烯A合酶形成，該酶將FPP環(huán)化為(+)-大根香葉烯A(deKraker等人，1998；Bouwmeester等人，1999b)。這種(+)-大根香葉烯A不進一步轉化為愈創(chuàng)木烷或桉葉烷骨架，表明該分子的官能化先于其環(huán)化。對山道年的生物合成進行的研究(Barton等人，1968)表明，內酯形成先于倍半萜烯化合物環(huán)系的任何其它氧化(Cordell，1976)，而且許多作者已經提出從(+)-大根香葉烯A(8)至(+)-木香烴內酯的生物合成途徑(Geissman，1973；Herz，1977；Seaman，1982；Fischer，1990；Song等人，1995)。在這個假定途徑中，(+)-大根香葉烯A被羥基化為大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醇，其經大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醛進一步氧化為大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸。認為該大根香葉烯酸是在C6位羥基化的，隨后失水導致內酯環(huán)形成，如存在于(+)-木香烴內酯中。不幸地，大根香葉烯是眾所周知的不穩(wěn)定化合物，易受質子誘導的環(huán)化和熱誘導(例如蒸汽蒸餾，GC-分析)的Cope重排的影響(Takeda，1974；Bohlman等人，1983；Reichardt等人，1988；Teisseire，1994；deKraker等人，1998)。(+)-大根香葉烯A與(+)-木香烴內酯之間的中間體無一曾經得到分離，除了大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醛之外，該醛最大難度地從Vernoniaglabra中得到分離，而且不能與其環(huán)化產物木香醛(costal)分離(Bohlman等人，1983)。也許由于這種不穩(wěn)定性，(+)-木香烴內酯的假定生物合成途徑僅僅基于從木香分離Cope重排產物，(-)-欖香-1，3，11(13)-三烯-12-醇和(-)-欖香-1，3，11(13)-三烯-12-醛，及質子誘導的環(huán)化產物木香醇、木香醛和木香酸(Bawdekar和Kelkar，1965；Bawdekar等人，1967；Maurer和Grieder，1977)。倍半萜內酯的生物合成的下一個步驟由細胞色素P450酶催化(DeKraker等人，2001)。細胞色素P450酶(Mr＝50000)主要催化氧化反應，但也催化還原反應。大多數脊椎動物基因組含有細胞色素P450的30多種不同的結構基因(Mathews和vanHolde，1996)，產生了這個大的及多樣性的蛋白質家族。這些蛋白質在能與O2和CO二者結合方面與線粒體細胞色素氧化酶類似，但它們在還原態(tài)并與CO復合時，它們在450nm強烈吸光。450nm的光轉移血紅素中的CO，因此CO結合是光可逆的。因此，細胞色素P450酶呈現(xiàn)通過CO的光可逆抑制(Donaldson和Luster，1991)。植物細胞色素P450單加氧酶系統(tǒng)與網狀組織或prevacuole相關，并因此位于細胞的光膜(微粒體)部分中。細胞色素P450酶參與多種化合物的羥基化。已知兩類細胞色素P450活性參與生物合成途徑及參與外源物的解毒(Donaldson和Luster，1991；Mihaliak等人，1993；Schuler，1996)。這些反應包括類固醇激素生物合成的羥基化，及羥基化的脂肪酸和脂肪酸環(huán)氧化物的合成。另外，細胞色素P450對上千種外源物起作用，包括藥物如苯巴比妥及環(huán)境致癌物質如苯丙芘，苯丙芘是煙草煙霧中的一種成分。外源物質的羥基化通常提高其溶解性，而且是其解毒或代謝和排泄中的步驟。細胞色素P450系統(tǒng)參與多種其它反應，包括環(huán)氧化、過氧化、脫硫、脫烷、脫氨基及脫鹵素。這些反應在肝臟中特別有活性，在肝臟中細胞色素P450的數目是可由外源物誘導的；即，其合成由被這些酶代謝的底物刺激(Mathews和vanHolde，1996)。誘導劑包括藥物如苯巴比妥及其它巴比妥類。組成該酶的活性位點的氨基酸殘基確定給定P450的特異性。它們在不同細胞色素P450之間可能變化；然而，所有這些酶的活性位點的主要成分均是血紅素部分。血紅素部分的鐵離子是催化反應的位點，而且也是CO組合產生強450nm吸收峰的原因(http//www.tcm.phy.cam.ac.uk/～mds21/report/node34.html)。細胞色素P450酶的底物特異性取決于其在生物中的功能動物內代謝物的生物合成或外源物的破壞。負責外源物破壞的酶具有低特異性，以使少量酶可以保護生物而對抗多種外源物。植物中外源物怎樣完成解毒還不清楚。參與植物或動物內代謝物的生物合成途徑的酶一般具有非常高的底物特異性(Donaldson和Luster，1991；Mihaliak等人，1993；Schuler，1996)。許多不同的酶參與復雜的植物代謝物的生物合成途徑。所述酶催化立體和區(qū)域選擇性羥基化、(環(huán))氧化、還原、糖基化、酯化和環(huán)化等等。尤其參與羥基化和氧化的酶在化學中具有強大潛力，因為相應的化學轉化包括毒性試劑和鹵化溶劑的使用，而這由于安全和環(huán)境原因是不合乎期望的(March，2001)。例如，烯丙基羥基化通常使用于二氯甲烷中的二氧化硒進行(Jerussi，1970)。直接導入與碳碳雙鍵相鄰的羰基官能團要求使用有毒的三氧化鉻(March，2001)或者昂貴及高毒性的四氧化釕(例如Petit和Furstoss，1995)。另外，羥基化和氧化酶通常比化學試劑具有更高的區(qū)域和立體選擇性。以下給出了幾個實例。部分由于其在香料和調味品工業(yè)中的重要性，對萜類化合物的羥基化及進一步生物轉化已經進行了特別充分的研究，使用產生精油的物種及其它植物，如Nicotianatabacum的細胞培養(yǎng)物(Suga和Hirata，1990)。立體特異性，例如，已經通過在β-萜品醇及其乙酸鹽的C4發(fā)生的羥基化只形成反式異構體及通過乙酸-α-松油脂的內環(huán)雙鍵的羥基化導致主要形成反式二醇而得到證明(圖4)。毛地黃毒苷是來自Digitalissp.的強心苷。其在11位上的β-羥基化產生更強力的地高辛。這已經通過在生物反應器中從Digitalislanata純化、重建及固定毛地黃毒苷12β-羥化酶(細胞色素P450酶復合物)而得以實現(xiàn)(Petersen和Seitz，1988；Petersen等人，1987)。倍半萜醇和酮由于許多原因而是令人感興趣的一組化合物。已經證明倍半萜醇，例如參與對微生物的抗性Solanaceae，例如，在感染致病真菌時產生倍半萜醇植物抗毒素，并且體外分析已經證明這些倍半萜醇具有強抗真菌活性。許多倍半萜醇在調味品和香料工業(yè)中也是重要的，例如檀香腦，其常用于非常昂貴的檀香精油，及khusimol、廣霍香醇等。倍半萜酮，諾卡酮也是商業(yè)上重要的化合物。由于其極佳的器官感覺性質及特別是其通常的柚子味道，因此諾卡酮是在香料和調味品工業(yè)中廣泛使用的配料。還已證明諾卡酮抑制胃損傷，這是其是一些胃藥的組分的原因(Yamahara等人，1990)。盡管諾卡酮可以使用化學合成而得自朱欒倍半萜或其它底物(Hunter和Brogden，1965；Wilson和Shaw，1978；加拿大專利901601；M.Pesaro等人，1968；Birch，1974；美國專利5847226)，但仍對天然的諾卡酮有大量需求。目前，這種品質只能通過提取含有諾卡酮的天然物質，特別是柚子而獲得，這種方法不經濟。木質素過氧化物酶(來自Phanerochaetechrysosporium)和乳過氧化物酶在一定條件下可以將(+)-朱欒倍半萜轉化為諾卡酮。以這種方式，轉化非常低而且最可能是由于這兩種酶形成的單線態(tài)氧所致(Willershausen和Graf，1991)。還已篩選了一些微生物、細菌和真菌將(+)-朱欒倍半萜轉化為諾卡酮的能力，所有這些均無較大成功(Balfoort，1994)。將來自荷蘭土壤和受感染的當地啤酒的腸細菌屬(Enterobacter)的兩種細菌通過在(+)-朱欒倍半萜上富集培養(yǎng)而分離。這些細菌將(+)-朱欒倍半萜轉化為諾卡酮(12％收率)及許多其它朱欒倍半萜衍生物(Dhavlikar和Albroscheit，1973)。還已經研究了使用微生物將朱欒倍半萜生物轉化為諾卡酮的其它方法，但這些方法無一被證實具有商業(yè)可行性(Dhavlikar等人，1973；Drawert等人，1984)。本發(fā)明涉及生物轉化領域，使用氧化酶，尤其是細胞色素P450相關酶進行，具有高度區(qū)域和對映選擇性，以從較低價值的底物生產調味品、香料、藥物或生物控制劑。更具體而言，本發(fā)明涉及使用植物酶生產生物活性萜類化合物的方法。本發(fā)明提供來源于含有倍半萜內酯的生物，尤其是植物的酶在生物催化中的用途。有機化合物的區(qū)域和立體選擇性氧化仍是有機化學中尚未解決的問題(Faber，2000)。我們研究了含有倍半萜的生物，如菊科物種的氧化酶是否能將例如倍半萜鏈烯轉化為商業(yè)上感興趣的產物。我們發(fā)現(xiàn)了具有令人驚訝的廣泛應用的酶。含有倍半萜內酯的菊科以及其它家族的植物物種也含有其生物合成所需要的酶，因此可用作這些酶的優(yōu)選來源。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供用于諾卡酮合成的酶。諾卡酮是主要發(fā)現(xiàn)于柚子及其它柑橘類水果的化合物。但是，令人驚訝地，我們在此提供諾卡酮合成也可以用酶進行的證據，所述酶并非來源于柑橘類果實，而是來源于另一種含有倍半萜的物種?？紤]到非柑橘類衍生的酶的大量存在，例如來自在菊苣植物或inuline菊苣生長之后保留的菊苣直根或者來自于容易和大量生長的其它菊科物種，如萵苣、向日葵、朝鮮薊、菊苣等等，我們在此提供用于例如調味品、香料、藥物或殺生物劑工業(yè)的酶。除了菊科之外，地錢(Hepaticae)是這些氧化酶的廉價并廣泛存在的來源的另一實例，已經有報道地錢的一些家族含有倍半萜內酯。分離自高等植物的倍半萜內酯基本上無一例外地含有α-亞甲基-γ-內酯基團，其中H-7是α-取向的。地錢產生光學異構系列的倍半萜內酯。然而，來自這些生物的氧化酶可以進行與來自高等植物的酶相似的反應，并且是除高等植物酶之外的有價值的酶。特別地，本發(fā)明提供轉化底物并產生立體和區(qū)域選擇性轉化產物的方法，所述方法包括將所述底物經來源于產生倍半萜內酯的植物物種的酶處理，尤其是其中所述轉化產物是醇、醛/酮或羧酸。此外，轉化產物還可以進一步使用商品酶，如醇脫氫酶，或微生物生物轉化系統(tǒng)而被修飾。考慮到有用的菊科和地錢物種可以容易地生長，本發(fā)明提供了用于生物轉化的便宜的酶或其它生物催化劑(細胞、外植體、組織、發(fā)根或細胞培養(yǎng)物)的來源。特別有用的作物包括Cichoriumspp，萵苣如Lactucaspp.、Helianthusspp.等，但不限于這些。本文提供的方法可以使萜烯轉化為有用的立體和區(qū)域選擇性轉化產物，例如直鏈或支鏈萜醇、醛/酮或羧酸，尤其是當所述底物是倍半萜時。特別地，提供了一種方法，其中所述酶是細胞色素P450單加氧酶，如(+)-大根香葉烯A羥化酶或倍半萜烯化合物內酯(sesquiterpenolide)C2羥化酶。這些酶在菊苣倍半萜內酯生物合成中催化(+)-大根香葉烯A和倍半萜內酯中間體的羥基化。盡管所述酶屬于生物化學途徑，但它們沒有高底物特異性。當化合物，如大根香葉烯A，含有異丙烯取代基，或者如大根香葉烯B，含有異亞丙基取代基，或者如朱欒倍半萜，含有烯丙基C2-位時，出現(xiàn)倍半萜的羥基化。通過這些羥化酶進行的轉化具有高區(qū)域和立體選擇性，這與通常以極低特異性發(fā)生的微生物羥基化相比是個大優(yōu)點。在具體實施方案中，給出了將朱欒倍半萜轉化為商業(yè)上重要的調味品/香料化合物諾卡酮的實施例。底物(+)-朱欒倍半萜被轉化為幾種產物其中兩種是朱欒倍半萜醇(2.61％)和諾卡酮(24.4％)。諾卡酮用作軟飲料和香水的組分。本發(fā)明還提供了一種方法，其中將底物紫穗槐-4，11-二烯-12-醇轉化為抗瘧藥青蒿素或其前體。被羥基化的其它底物包括大根香葉烯A，如可預期的，具有最高轉化率的底物，以及β-芹子烯。被轉化為其相應的醇的其他底物是別異長葉烯(與β-芹子烯相比為1.49％)。紫穗槐二烯被轉化為兩種產物，為74.0和18.7％；第一種是紫穗槐-4，11-二烯-12-醇青蒿素前體，后者的特性未知。發(fā)現(xiàn)其它底物的相對轉化率如下(-)-α-反-香檸檬烯(13.5％)、(-)-β-欖香烯(56.2％)、大根香葉烯A(110％，可能更高)、大根香葉烯B(3.13％和8.60％，順-反異構體)、(+)-γ-古蕓烯(54.9％)、(+)-喇叭烯(7.20％)，及新臭根醇(6.92％)。當所述酶來源于所述菊科物種的提取物時是特別有用的，所述提取物根據本領域已知方法容易地產生。本問還涵蓋使用來自菊科的原膠乳作為酶制劑。在具體實施方式中，給出了來源于菊苣根的酶的實施例。因為菊苣根非常苦，因此將它們視做菊苣栽培的廢品。在荷蘭每年產生大約100000噸菊苣根，但由于其苦味，甚至不可能將其用作牲畜飼料。因此它們提供了本發(fā)明所述酶的大量且廉價的來源。對于工業(yè)方法，本發(fā)明提供了生產含有P450酶的酶提取物的方法。這些可以通過將菊苣根在實施例1所述含有PVPP的提取緩沖液中均化而制備。然后將所得漿液過濾并離心。先低速(20000×g)后高速離心(150000×g)產生高度富集的微粒體沉淀，但在極低速離心(例如2000×g)后獲得的上清液也是活性的，使其更易于適應工業(yè)方法的程序?？梢詫⒊恋砘蛏锨逡涸賾腋∮诤线m的分析緩沖液中，可以向其中加入合適的底物和NADPH或NADPH-再生系統(tǒng)，或者可以根據實施例5將酶固定以提高其效力和壽命。輔因子的循環(huán)進一步提高經濟可行性。在合適的溫度下溫育后，使用制備規(guī)模的柱色譜可以將醇產物容易地提取并與底物分離。合適的底物可以是任何倍半萜碳氫化合物，這些碳氫化合物在與實施例中所述位置相當的位置被羥基化后可以產生令人感興趣的產物，例如朱欒倍半萜、紫穗槐二烯、(-)-α-反-香檸檬烯、γ-古蕓烯、喇叭烯、大根香葉烯A、大根香葉烯B，但不限于這些。從這些底物酶促形成的相應醇可以使用菊苣醇和醛脫氫酶或可商購的脫氫酶進一步氧化為相應的醛/酮或酸(如果這些是更有價值的)。然而，本發(fā)明提供了另一種可能的方法，其中所述酶存在于來源于所述菊科物種的組織或細胞培養(yǎng)物中，例如發(fā)根培養(yǎng)物。菊苣的發(fā)根和細胞培養(yǎng)物可以使用標準方法獲得(發(fā)根培養(yǎng)物Song等人，1995；細胞培養(yǎng)物Dubois等人，1988)。為培養(yǎng)物補給倍半萜如朱欒倍半萜、紫穗槐二烯、(-)-α-反-香檸檬烯、γ-古蕓烯、喇叭烯、大根香葉烯A、大根香葉烯B，但不限于那些物質，優(yōu)選200-1000mg/l。在倍半萜的存在下生長1周后，從培養(yǎng)基和發(fā)根/細胞中提取反應產物。還可以使用重組酶，例如來源于具有編碼本發(fā)明的酶的核酸的轉基因植物或微生物的酶。根據本發(fā)明，可以使用隨機測序菊苣直根的cDNA文庫獲得細胞色素P450cDNA，菊苣直根是這些酶活性最高的器官。PCR方法也是可行的，其中細胞色素P450酶的序列同源性用于設計簡并引物，其可用于產生PCR片段。這些片段用于篩選cDNA文庫以獲得全長cDNA。這些cDNA可以在適合大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵并適于P450表達的大腸桿菌、酵母或任何其它微生物中表達。在這種發(fā)酵方法中，將為轉基因微生物提供期望的倍半萜碳氫化合物底物，例如朱欒倍半萜、紫穗槐二烯、(-)-α-反-香檸檬烯、γ-古蕓烯、喇叭烯、大根香葉烯A、大根香葉烯B，但不限于那些。所產生的醇產物可以連續(xù)或分批提取。還可以給予這些微生物期望的倍半萜碳氫化合物底物的合酶，例如朱欒倍半萜合酶，其可以進一步降低生產成本，及給予醇和/或醛脫氫酶，以生產酮/醛，如在生產諾卡酮，或者當需要時在生產酸的情況中。本發(fā)明還提供可由本發(fā)明的方法獲得的轉化產物。特別感興趣的產物是(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醇，具有類檀香香料性質的相應醛的直接前體，及許多新轉化產物如別異長葉烯醇、紫穗槐-4，11-二烯-12-醇、大根香葉烯B醇、5，11(13)-愈創(chuàng)木二烯-12-醇及喇叭烯醇，所有醇在之前均從未報道過。使用本發(fā)明，可以生產更大量的這些醇，以證實其特性并研究其作為調味品和香料化合物、藥物或殺生物劑的性質，或者生產其相應的醛/酮及羧酸。本發(fā)明還提供來源于菊科物種的分離或重組的酶或酶提取物，在將所述底物經所述酶處理及在生物催化中使用本發(fā)明的這種酶或提取物之后，所述酶或酶提取物能轉化底物并產生轉化產物，例如用于生產調味品或香料化合物、藥物或殺生物劑。本發(fā)明因此提供表達編碼所述氧化酶的基因的微生物在生物轉化中的用途，所述氧化酶分離自產生倍半萜內酯的植物物種。本文還提供表達編碼分離自產生倍半萜內酯的植物物種的所述氧化酶的基因的微生物與在微生物中引起所述底物形成的基因組合使用，并因此形成所述氧化的生物轉化產物。本發(fā)明還提供轉基因的產生倍半萜內酯的植物如菊苣的用途，所述轉基因植物物種表達在植物中引起所述底物形成的基因，如萜烯合酶基因，其在植物中引起所述萜烯形成，并因此形成所述氧化的生物轉化產物，或者所述轉基因植物物種表達朱欒倍半萜合酶，其在植物中引起朱欒倍半萜形成并因此形成諾卡酮，或者所述轉基因植物物種表達紫穗槐-4，11-二烯合酶，其在植物中引起紫穗槐-4，11-二烯形成并因此形成青蒿素或其前體，或者所述轉基因植物物種表達α-反-香檸檬烯合酶，其在植物中引起α-反-香檸檬烯形成，并因此形成(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醇。圖1菊苣的苦味原理。愈創(chuàng)內酯萵苣苦素、8-脫氧萵苣苦素和lactucopicrin是主要的化合物。菊苣的次要倍半萜內酯是愈創(chuàng)內酯11(S)，13-二氫萵苣苦素(a)、11(S)，13-二氫-8-脫氧萵苣苦素(b)、11(S)，13-二氫lactucopicrin(c)、桉葉內酯sonchusideC(d)和cichoriolideA(e)，及大根香葉內酯sonchusideA(f)和cichoriosideC(g)。圖2提出的生物合成途徑，從(+)-大根香葉烯A(1)至(+)-木香烴內酯(5)，經過大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醇(2)、大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醛(3)及大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)。在虛線的右側顯示可以從這些不穩(wěn)定的大根香葉烯形成的化合物熱誘導的Cope重排產物(-)-β-欖香烯(6)、(-)-欖香-1，3，11(13)-三烯-12-醇(7)、(-)-欖香-1，3，11(13)-三烯-12-醛(8)、欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(9)，和去氫-風毛菊內酯(10)；及酸誘導的環(huán)化產物芹子烯(11)(γ-芹子烯通常稱為芹子-4，11-二烯)、木香醇(12)、木香醛(13)，及木香酸(14)。具有下劃線數字的化合物均已在木香中鑒定(+)-大根香葉烯A(1)及大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醛(3)分離自其他植物物種。注意在羥基化后，碳原子12和13的編號倒轉。圖3細胞色素P450復合物的示意圖(取自Meijer，1993)。細胞色素P450也能結合CO而不是O2，CO抑制其催化作用。圖4α-和β-萜品醇及其乙酸酯的化學結構。圖5毛地黃毒苷和地高辛的化學結構。圖6未被來自菊苣根的含有(+)-大根香葉烯A羥化酶的微粒體沉淀轉化的底物，即(-)-(α)-蓽澄茄油烯、(-)-(α)-古蕓烯或大根香葉酮或者幾乎未被轉化的底物，即芋烯。圖7用植物致病真菌生物轉化(+)-γ-古蕓烯產生(1S，4S，7R，10R)-5-guaien-11，13-二醇和(1S，4S，7R，10S)-5-guaien-10，11，13-三醇；將γ-古蕓烯與菊苣微粒體沉淀一起溫育給出(1S，4S，7R，lOR)-5，11(13)-愈創(chuàng)木二烯-12-醇。圖8假定的細胞色素P450通過羥基化及隨后的內酯化而催化大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)轉化為(+)-木香烴內酯(5)。圖9也與菊苣上清液和NADPH一起溫育的各種底物α-和β-木香酸(15)、欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(16)、parthenolide(17)及去氫木香內酯(18)的混合物。圖10A，對20000g來自菊苣根的上清液與NADPH及大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)溫育中形成的產物進行GC-MS分析，顯示去氫風毛菊內酯(dHSausL[7])、風毛菊內酯(SausL[9])及l(fā)eukodin(Leuk[10])的峰。B，這些產物在無NADPH存在下未觀測到。大根香葉烯-l(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(1)以欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(EAc)加上其對映異構體(EAc*)相同被觀測到；內標(i.s.)是1nmol順-橙花叔醇。巨大的前延峰(frontingpeak)是脂肪酸(棕櫚酸和亞油酸)。C，于乙醇中的0.5mM木香烴內酯(2)標準品產生去氫風毛菊內酯(dHSausL[7])的脫尾峰。圖11在NADPH和氧存在下用20000g菊苣上清液從大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)形成的產物。Leukodin(22)以真正的GC峰被檢測到，而木香烴內酯(5)及1l，13-二氫木香烴內酯(20)分別以其Cope重排產物去氫風毛菊內酯(19)和風毛菊內酯(21)被檢測到。圖12木香烴內酯合酶的藍光可逆性CO抑制的證明。將90％N2+10％O2(N2)存在下的酶活性設定為100％，該活性相當于去氫風毛菊內酯(木香烴內酯)、風毛菊內酯(二氫木香烴內酯)和leucodin的峰，分別為0.58、0.27和0.15×內標(1μM)。90％CO+10％O2存在下的抑制通過用藍光(450nm)照射而輕微逆轉。所有溫育均在無FAD和FMN存在下進行。圖13源自(+)木香烴內酯(5)的去氫風毛菊內酯(19)的質譜，所述去氫風毛菊內酯(19)是在標準分析條件下(A)，在18O2存在下(B)，從大根香葉烯酸(4)生產的，或者源自(+)-木香烴內酯標準品(C)。圖14在標準條件下(A)，或在18O2(B)存在下，在酶分析中從大根香葉烯酸(4)產生的leucodin(22)的質譜。C圖顯示leucodin標準品的質譜(C)。圖15酶催化的從大根香葉烯酸(4)形成(+)-木香烴內酯(5)的機理，導致導入18O原子。圖16(+)-木香烴內酯(5)在NADP和O2存在下進一步被酶促轉化為11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)和leucodin(22)。大根香葉烯酸在18O2存在下溫育引起在星號標記的位置導入。還不清楚leucodin(22)是否通過20形成。(+)-木香烴內酯和11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)均可能是菊苣中存在的其它倍半萜內酯的前體；而leucodin(22)僅是遠離11(S)，13-二氫-8-脫氧萵苣苦素的一個羥基化的，后者是菊苣的次要倍半萜內酯。圖17對由菊苣根的微粒體制劑形成的產物進行GC-MS分析，所述菊苣根在有(A)或無(B)NADPH存在下與(+)-朱欒倍半萜(Val)一起溫育。在NADPH存在下溫育產生諾卡酮(Nkatone)、β-諾卡醇(Nkatol)及朱欒倍半萜-12-醇(ValOH)。用Δ標記的峰是β-諾卡醇([M]+202)的GC誘導的脫水產物。用星號標記的峰是倍半萜醇，其大概源自倍半萜雜質(在B圖中用γ標記)的酶轉化，所述雜質存在于用作底物的(+)-朱欒倍半萜市售樣品中。圖18通過β-諾卡醇且不通過α-諾卡醇將(+)-朱欒倍半萜轉化為諾卡酮。圖19在NADP+存在下，由150000g菊苣根上清液將反，反-法呢醇轉化為法呢醛和法呢酸。圖20在菊苣倍半萜內酯生物合成中l(wèi)eucodin形成與通過菊苣酶制劑將(+)-朱欒倍半萜轉化為諾卡酮的相似性。表I在NADPH存在下通過菊苣的微粒體沉淀轉化倍半萜。使用參比物鑒定用星號標記的醇。底物產物相對轉化率a結構KI結構KI140916881.5±0.1別異長葉烯別異長葉烯醇*1482165074.0±2.8紫穗槐-4，11-二烯紫穗槐-4，11-二烯-12-醇*172018.7±1.2紫穗槐-4，11-二烯醇1440172013.5±0.2(-)-α-反-香檸檬烯(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醇*1397167356.2±2.6(-)-β-欖香烯(-)-欖香-1，3，11(13)-三烯-12-醇*1512b1673-110.0±5.1c1806b(+)-大根香葉烯A大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯12-醇*1566b1694d3.1±0.1大根香葉烯B大根香葉烯B醇和1700d8.6±0.81479176054.9±1.5(+)-γ-古蕓烯5，11(13)-愈創(chuàng)木二烯-12-醇150417877.2±0.4(+)-喇叭烯喇叭烯醇163119096.9±2.4新臭根醇4β-H-桉葉-11(13)-烯-4，12-二醇14921778100±4.5(+)-β-芹子烯(+)-β-木香醇*a100％轉化相當于β-芹子烯的羥基化率，其產生6.3×內標(在每個分析中均為2.5nmol順-橙花叔醇)的β-木香醇峰大小。b這些大根香葉烯的Kovats′指數在150℃的注入口溫度下確定；基于它們在250℃的注入口溫度下測定的Cope重排產物進行定量測定。c該轉化率是欖香三烯-12-醇、木香醇、欖香三烯-12-醛和欖香三烯-12-酸的總和。dKovats′指數在250℃的注入口溫度下確定，可能屬于Cope重排產物?！u基化可能發(fā)生在這些烯丙基位置之一上。表II加入50μM(+)-大根香葉烯A或50μM(+)-α-蓽澄茄油烯對羥基化的影響。底物產物a抑制率(％)±SD大根香葉烯α-蓽澄茄油烯A別異長葉烯別異長葉烯醇100.0100.0紫穗槐-4，11-二烯紫穗槐-4，11-二烯-12-醇84.9±0.1-9.2±2.5紫穗槐-4，11-二烯醇(KI1720)84.9±1.0-2.3±1.5(-)-β-反-香檸檬烯(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醇89.2±1.830.2±4.5(-)-β-欖香烯(-)-欖香-1，3，11(13)-三烯-12-醇90.4±1.219.5±1.8大根香葉烯B大根香葉烯B醇(KI1694)100.032.6±3.6大根香葉烯B醇(KI1700)100.027.3±10(+)-γ-古蕓烯(+)-γ-古蕓烯醇88.0±0.9-5.6±0.2(+)-喇叭烯喇叭烯醇100.035.5±1.9新臭根醇4β-H-桉葉-11(13)-烯-4，12-二醇67.5±1.93.4±4.5(+)-β-芹子烯(+)-β-木香醇60.3±3.40.4±2.0a將在對照溫育中產生的倍半萜醇的量設定為100％，與表I所示那些相似。表III(+)-γ-古蕓烯所用溶劑對酶活性的影響溶劑酶活性a±SD己烷＜0.1戊烷0.47±0.07異丙醇1.76±0.16乙醇1.87±0.01DMSO1.80±0.09aγ-古蕓烯醇相對于內標(5nmol順-橙花叔醇)的峰高表IV對(+)-木香烴內酯合酶活性的要求添加酶活性百分比a±SD無添加0±01mMNADPH100±81mMNADH7±21mMNADPH+1mMNADH109±231mMNADP++NAD+1±11mMNADPH+氬氣0±0a100％酶活性相當于去氫風毛菊內酯、風毛菊內酯和leucodin峰大小的總和，所述峰大小分別為0.35、0.19和0.09×內標(在所有分析中均為1nmol順-橙花叔醇)。表V11(S)，13-二氫木香烴內酯和leucodin生物合成中的吡啶核苷酸輔因子依賴性吡啶核苷酸輔因子酶活性百分比±SD二氫木香烴內酯Leucodin(22)(20)1mMNADPHa100±3a100±10無15±10±01mMNADH14±20±01mMNADPH+1mMNADH107±465±191mMNADP++1mMNAD+18±30±0a100％酶活性相當于風毛菊內酯和leucodin峰大小分別為1.34和0.42×內標(在所有分析中均為1nmol順-橙花叔醇)表VI關于11，13-二氫木香烴內酯和leucodin生物合成的抑制實驗分析條件a酶活性百分比±SD二氫木香烴內酯Leucodin(22)(20)空氣(≈80％N2+20％O2)b100±9b100±3380％CO+20％O2140±48±1氬氣134±60±0標準c100±3c100±10細胞色素C(100μM)105±50±0DMSO(1％)d100±5d100±10甲吡酮(100μM)87±1170±16克霉唑(10μM)119±90±0咪康唑(10μM)100±50±0氨茶苯并三唑(10μM)75±886±33a所有溫育均在1mMNADPH再生系統(tǒng)和黃素存在下進行。b100％酶活性相當于風毛菊內酯和leucodin峰大小分別為1.63和0.34×內標(在所有分析中均為1nmol順-橙花叔醇)c100％酶活性相當于風毛菊內酯和leucodin峰大小分別為1.34和0.42×內標(在所有分析中均為1nmol順-橙花叔醇)d100％酶活性相當于風毛菊內酯和leucodin峰大小分別為1.43和0.18×內標(1nmol順-橙花叔醇)表VII在NADPH存在下通過菊苣的微粒體沉淀轉化(+)-朱欒倍半萜底物產物相對轉化率a結構KI結構KI150017772.6±0.1(+)-朱欒倍半萜朱欒倍半萜-12-醇e182024.4±1.1諾卡酮a100％轉化相當于β-芹子烯的羥基化率，其產生的β-木香醇峰大小為6.3×內標(在每個分析中均為2.5nmol順-橙花叔醇)。e檢測的化合物的質譜與FirmenichSA(瑞士)提供的朱欒倍半萜-12-醇的質譜相同。具體實施方案實施例1使用分離自菊苣根的酶生物轉化倍半萜研究存在于菊苣根中的大根香葉烯A羥化酶羥基化除大根香葉烯A之外的其它底物的能力。栽培菊苣(CichoriumintybusL.，cvFocus)的新鮮根在夏末期間自荷蘭Veenendaal的栽培者獲得。將菊苣根切成小片，在液氮中冷凍并貯存于-80℃。材料和方法(+)-大根香葉烯A分離自木香(DeKraker等人，2001b)。別異長葉烯、(-)-α-古蕓烯、(+)-γ-古蕓烯和(+)-喇叭烯購自Fluka。ICNBiomedicals提供(-)-α-蓽澄茄油烯。化合物(-)-苧烯和(+)-苧烯分別購自Merck和Janssen。紫穗槐-4，11-二烯由B.J.M.Jansen博士(Bouwmeester等人，1999a)合成。大根香葉酮分離自Geraniummacrorrhizum的天然油，大根香葉烯B由D.P.Piet博士(Piet等人，1995)合成。(-)-α-反-香檸檬烯和(-)-β-欖香烯得自W.A.Knig教授(HamburgUniversity)。新臭根醇由R.P.W.Kesselmans博士(Kesselmans，1992)合成。(+)-β-芹子烯分離自芹菜油并由T.A.vanBeek博士提供。將底物以10mM的濃度溶解于乙醇中。別異長葉烯醇經其相應的醛通過SeO2從別異長葉烯制備，根據Umbreit和Sharpless(1977)的方案進行。向于30mLCH2Cl2中的77mgSeO2和68mg水楊酸的溶液中，加入100mg別異長葉烯。在室溫下攪拌，在前幾個小時內使反應混合物轉變?yōu)辄S色并沉淀紅色固體。通過GC-MS與TLC監(jiān)測反應，并在2.5天后通過加入60ml脫鹽水結束反應。將反應混合物用45ml乙醚提取，隨后用30ml鹽水洗滌有機相。在提取期間紅色沉淀保留在水相中。在干燥及蒸發(fā)后，有機相產生214mg粗固體，在用戊烷-CH2Cl2(3∶1)于二氧化硅上進行閃蒸色譜后，產生31mg別異長葉烯醛，一種強烈氣味的化合物(衫木樣)。1HNMR(200MHz，C6D6)δ0.71(s，3H，Me)，0.90(s，3H，Me)，δ0.93-2.04(m，13H)，δ5.42(s，1H，CH2＝C)，δ5.73(s，1H，CH2＝C)，δ9.35(s，1H，CH＝O)。13CNMR(50MHz，C6D6)δ15.0(q)，δ19.6(q)，δ20.5(t)，δ22.2(t)，δ32.3(t)，δ36.3(t)，δ38.7(t)，δ45.1(t)，δ46.1(s)，δ47.1(s)，δ47.7(s)，δ50.8(d)，δ133.5(t)，δ157.0(s)，δ193.9(d)。EIMS(70eV)m/z218[M]+(41)，203(48)，189(32)，185(30)，175(42)，161(68)，147(53)，145(37)，133(35)，119(46)，107(42)，105(80)，95(33)，93(46)，91(100)，81(37)，79(65)，77(64)，55(43)，53(34)，41(74)，39(45)。將15mg醛加入于0.5ml乙醚中的1.8mgLiAlH4溶液中。將灰色的懸浮液在室溫下攪拌17.5小時，并在小心加入一匙Na2SO4·10H2O后再攪拌半小時。向混合物中加入1.5ml脫鹽水，隨后用1ml乙醚提取3次。將乙醚通過充填有二氧化硅和一匙尖MgSO4的具有玻璃纖維塞子的巴斯德移液管。蒸發(fā)溶劑，產生17mg別異長葉烯醇。1HNMR(200MHz，C6D6)δ0.77(s，3H，Me)，δ0.91(s，3H，Me)，0.96-1.63(m，13H)，δ3.96(m，2H)，δ4.95(d，1H，J＝1.3Hz)，δ5.30(dd，1H，J＝3.26Hz，1.55Hz)。13CNMR(50MHz，C6D6)δ15.1(q)，δ19.7(q)，δ20.7(t)，δ22.3(t)，δ32.4(t)，δ37.5(t)，38.7(t)，44.0(t)，δ46.1(s)，δ47.8(s)，δ48.2(s)，δ51.6(d)，δ63.4(t)，δ107.9(t)，δ155.9(s)。EIMS(70eV)m/z220[M]+(5)，189(35)，187(36)，163(30)，161(56)，160(37)，159(30)，147(36)，145(38)，133(32)，131(37)，119(44)，107(61)，105(91)，95(94)，93(57)，91(100)，81(53)，79(60)，77(52)，67(39)，55(45)，41(62)。紫穗槐-4，11-二烯-12-醇從100mg青蒿酸制備。將該酸溶解于6ml無水乙醚中并通過加入重氮甲烷而酯化，混合1小時。對反應混合物進行GC-MS分析顯示甲基酯和另一種化合物(3∶1)，可能是未與環(huán)丙基連接的甲基酯。在除去酯后，將8.6mg混合物溶解于20ml乙醚-THF(1∶1)中，在-60℃和干燥氮氣流下冷卻2小時。隨后將混合物在-30℃下與過量LiAlH4一起攪拌1小時，之后通過加入Na2SO4·10H2O來結束反應。將溫度提高至室溫，并將反應混合物再攪拌半小時。在用MgSO4干燥過夜后，將混合物通過瓷漏斗過濾并除去溶劑。分離期望的醇并通過在硅膠平板上進行制備薄層色譜而純化，使用石油醚-乙酸乙酯混合物(3∶1)作為洗脫劑(Rf0.7)。紫穗槐-4，11-二烯-12-醇以與4-紫穗槐烯-12-醇(9∶1)的混合物獲得，總收率為14％。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.87(d，3H，Me15，J＝6.0Hz)，δ1.50(brs，3H，Me14)，δ1.0-2.2(m，11H)，δ2.47(m，1H，H6)，δ4.10(s，2H，H12)，δ4.83(brs，1H，H13′)，δ5.04(brs，1H，H13)，δ5.18(brs，1H，H4)。EIMS(70eV)m/z220[M]+(6)，202(35)，189(66)，187(34)，145(40)，132(52)，131(36)，121(100)，119(81)，105(51)，93(74)，91(70)，81(47)，79(77)，77(50)，55(41)，41(47)。從菊苣根提取(+)-大根香葉烯A羥化酶為了制備含有細胞色素P450酶，包括(+)-大根香葉烯A羥化酶(deKraker等人，2001a)的粗酶提取物，將25g深冷(-80℃)的菊苣根方塊通過Sorvall混合儀與2.5gPVPP和40ml提取緩沖液混合。在整個程序期間，將植物材料盡可能保持在冰上。在5次幾秒鐘的混合后，將漿液轉移至具有額外10ml提取緩沖液的粗棉布上。將該粗棉布擰干并將濾液在4℃和20000g下離心(Sigma2K15)20分鐘。將上清液倒入充填有玻璃纖維的漏斗上。將濾液分入8ml離心管中，隨后在4℃和150000g下離心(CentrikonT-2070，KontronInstruments)90分鐘。將所得微粒體沉淀(約6)在-80℃和氬氣中貯存。在溫育之前，將10沉淀倒入30ml分析緩沖液中，所述緩沖液由25mMTris(pH7.5)、2mMDTT、1mM抗壞血酸、5μMFAD、5μMFMN和10％(v/v)甘油組成。將酶懸浮液分成1ml等分，并與5μl底物溶液在1mMNADPH再生系統(tǒng)存在下溫育，所述再生系統(tǒng)由1mMNADPH、5mM葡糖-6-磷酸和1.2IU葡糖-6-磷酸脫氫酶組成(均來自Sigma)。在每個分析中底物的初始濃度為45μM，所有底物均平行兩份。在空白分析中不加入NADPH再生系統(tǒng)，以使細胞色素P450酶(包括(+)-大根香葉烯A-羥化酶)無活性。60分鐘后，通過在冷凍機中在-20℃下貯存而結束溫育。將酶分析物在加入5μM順-橙花叔醇(Fluka)后，使用于戊烷中的1ml20％(v/v)乙醚提取兩次。有機相過濾通過具有玻璃纖維塞子的(二甲基氯硅烷處理的，Chrompack)巴斯德移液管，所述移液管含有0.4g二氧化硅和少量無水MgSO4。將移液管用1.5ml乙醚淋洗，并將提取物在氮氣流下濃縮為約50μl。通過GC-MS分析濃縮的提取物，如DeKraker等(2001a)所述。為了研究底物的酶促羥基化是否由(+)-大根香葉烯A羥化酶催化，在50μM(+)-大根香葉烯A或50μM(-)-(α)-蓽澄茄油烯存在下進行各種底物(50μM)的標準溫育，以排除倍半萜鏈烯對酶活性的任何可能的一般負面影響。在對照溫育中加入5μl乙醇而不是(+)-大根香葉烯A或(-)-(α)-蓽澄茄油烯的乙醇溶液。結果(測試底物的轉化)大多數測試的底物被羥基化(見表I)，其分子量相應提高16amu。不含有異丙烯基或異亞丙基側鏈的(-)-(α)-蓽澄茄油烯和(-)-(α)-古蕓烯未被轉化(圖6)。大根香葉酮作為底物也不被接受。(+)-苧烯和(-)-苧烯發(fā)生一些轉化，但是量少因而未進行進一步研究。在表I中描述了倍半萜在NADPH及含有(+)-大根香葉烯A羥化酶的微粒體沉淀存在下被轉化為倍半萜醇。各種反應的轉化率相對于與β-芹子烯的羥基化而表示，將芹子烯的羥基化設定為100％并相當于β-木香醇峰大小為6.3×內標(在每個分析中均為2.5nmol順-橙花叔醇)。加入的50nmolβ-芹子烯的約30％被羥基化。不是所有形成的羥基化產物均可被鑒定，因為參比樣品或預期的倍半萜醇的質譜不可獲得。紫穗槐-4，11-二烯溫育紫穗槐-4，11-二烯產生兩種醇。主要產物鑒定為紫穗槐-4，11-二烯-12-醇，其得自異丙烯基側鏈的羥基化。雖然假設在橋頭原子處不發(fā)生烯丙基羥基化，但較早洗脫的醇的結構未知，其是紫穗槐-4，11-二烯-2-醇或紫穗槐-4，11-二烯-14-醇。EIMS(70eV)m/z220[M]+(12)，189(77)，162(46)，147(38)，121(45)，119(60)，107(58)，105(68)，95(41)93(75)，91(72)，81(100)，79(70)，77(48)，55(52)，43(49)，41(52)。(-)-α-反-香檸檬烯溫育(-)-α-反-香檸檬烯產生(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醇。EIMS(70eV)m/z220[M]+(＜1)，145(10)，132(28)，131(10)，121(11)，120(14)，119(75)，107(29)，105(22)，95(10)，94(15)，93(100)，81(14)，79(33)，77(31)，68(17)，67(11)，55(29)，53(11)，43(36)，41(28)，39(14)。將溫育的戊烷-乙醚提取物與MnO2一起振搖過夜產生一種化合物，其與存在于木香油(Maurer和Grieder1977)中的(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醛具有相同的保留時間和質譜。(+)-γ-古蕓烯溫育(+)-γ-古蕓烯產生未知的倍半萜醇。EIMS(70eV)m/z220[M]+(35)，189(36)，187(37)，161(39)，147(31)，146(35)，145(55)，133(33)，131(64)，121(41)，119(54)，117(31)，105(81)，95(41)，93(58)，91(100)，81(92)，79(71)，77(54)，67(38)，55(49)，41(59)。將酶分析的戊烷-乙醚提取物與1匙MnO2一起攪拌過夜給出完全轉化為醛或酮([M+]218)。因為這種試劑對α，β-不飽和醇是特異性的(March，1992)，而且唯一的其它可用的烯丙基位置是在叔碳原子上，所述生物化學羥基化必須在(+)-γ-古蕓烯的異丙烯基側鏈中發(fā)生，產生1S，4S，7R，10R-5，11(13)-愈創(chuàng)木二烯-12-醇。(+)-大根香葉烯A根據前述結果，(+)-大根香葉烯A轉化為大根香葉-1(10)，4，11-三烯-12-醇，但有些未預期的隨后氧化為(產生的大根香葉烯醇的約15％)大根香葉-1(10)，4，11-三烯-12-醛，而且也清楚地檢測到大根香葉-1(10)，4，11-三烯-12-酸。這表明微粒體沉淀不是完全沒有活性脫氫酶。顯然，產生的大根香葉烯醇的量足以能夠進行這些隨后的反應。此外，盡管使用pH7.5及存在降低任何NADP+存在的NADPH-再生系統(tǒng)，但該脫氫酶仍是活性的。在與β-芹子烯和β-欖香烯一起的溫育中，只測到少量的醛和/或酸。為此原因，將β-芹子烯而不是(+)-大根香葉烯A的轉化設定為100％。大根香葉烯B對大根香葉烯B溫育的GC-MS給出兩種產物，它們具有幾乎相同的質譜和保留時間。Kovats′指數1694，EIMS(70eV)m/z220[M]+(＜1)，202(15)，187(24)，159(20)，147(20)，145(24)，134(22)，133(26)，131(22)，123(19)，121(75)，120(27)，119(100)，109(34)，108(15)，107(48)，106(22)，105(66)，95(38)，94(20)，93(65)，92(17)，91(73)，81(50)，79(52)，77(44)，71(17)，69(28)，68(15)，67(48)，65(17)，57(19)，55(94)，53(34)，43(46)，41(73)，39(32)。Kovats′指數1700，EIMS(70eV)m/z220[M]+(＜1)，202(15)，189(15)，187(21)，159(20)，147(22)，145(23)，137(17)，134(21)，133(28)，131(26)，123(22)，122(15)，121(100)，120(28)，119(91)，117(15)，109(36)，108(18)，107(52)，106(23)，105(77)，95(45)，94(24)，93(86)，92(21)，91(80)，81(61)，79(66)，77(53)，71(21)，69(32)，68(18)，67(55)，65(21)，57(32)，55(69)，53(43)，43(62)，41(91)，39(42)。推測大根香葉烯B的異丙烯基側鏈中的兩個甲基基團均被羥基化，產生幾乎相同的產物。在任何其它位置的羥基化都是不可能的，因為它們將可能也在(+)-大根香葉烯A時觀察到。產物以其Cope重排產物而測定，將注入口溫度從250℃降低至150℃由于柱上Cope重排而產生模糊的加寬峰。(+)-喇叭烯溫育(+)-喇叭烯產生未知的倍半萜醇。EIMS(70eV)m/z220[M]+(12)，187(25)，159(42)，151(29)，147(32)，145(32)，133(26)，131(25)，121(31)，119(62)，107(86)，105(100)，95(40)，93(74)，91(82)，81(53)，79(54)，77(39)，55(38)，43(33)，41(47)。新臭根醇新臭根醇可能在異丙烯基側鏈樣β-芹子烯中羥基化，產生4β-H-桉葉-11(13)-烯-4，12-二醇。EIMS(70eV)m/z238[M]+(＜1)，223(46)，135(76)，93(47)，81(39)，79(47)，71(47)，55(39)，43(100)，41(40)。競爭性抑制實驗在該實驗中所用的微粒體沉淀不只含有(+)-大根香葉烯A羥化酶，還含有存在于菊苣根中的其它膜結合酶。因此，表I中所述的一些轉化也可以由除(+)-大根香葉烯A羥化酶之外的其它氧化酶催化。為了對此進行研究，在50μM(+)-大根香葉烯A存在下溫育不同的底物。還使用50μM(-)-α-蓽澄茄油烯進行溫育，其是一種未羥基化的倍半萜(圖6)，以測試加入任何任意的倍半萜鏈烯對酶活性的影響(見表II)。表II中的結果顯示，所有酶促羥基化均通過加入(+)-大根香葉烯A而被抑制到90％，除了β-芹子烯和新臭根醇之外，它們的羥基化分別被抑制60％和68％。β-木香醇形成的相對小的抑制與所觀測的其幾乎與(+)-大根香葉烯A一樣充分羥基化的結果一致(表I)；β-芹子烯和新臭根醇之間的結構關聯(lián)可能也解釋(+)大根香葉烯A對4β-H-桉葉-11(13)-烯-4，12-二醇形成的較小影響。更令人驚奇的是，(+)-大根香葉烯A也抑制倍半萜醇的形成，所述倍半萜醇不包含異丙烯基或異亞丙基側鏈，如喇叭烯醇。倍半萜的羥基化不受加入(-)-α-蓽澄茄油烯的顯著影響，除了別異長葉烯醇的形成之外，別異長葉烯醇是在正常分析條件下僅少量形成的一種產物。有機溶劑對酶活性的影響在這個實施例中所述實驗開始之前，測試哪種有機溶劑可最佳地用于溶解底物。在己烷、戊烷、異丙醇、乙醇和DMSO中制備10mMγ-古蕓烯儲備液，并將5μl這些溶液加入溫育混合物中?；诒鞩II的結果，選擇乙醇在所有實驗中作為底物的溶劑，而不是通常所用的戊烷(例如Karp等人，1990)。結論來自菊苣根的微粒體酶制劑可以羥基化倍半萜鏈烯，所述倍半萜鏈烯在NADPH存在下在菊苣中不存在(表I)。這些羥基化的大多數發(fā)生在異丙烯基或異亞丙基側鏈上，在一些情況中產生先前未曾描述過的倍半萜醇，例如紫穗槐-4，11-二烯-12-醇和別異長葉烯醇。在一些情況中形成的倍半萜醇的新穎性妨礙其鑒定，而且大根香葉烯B、(+)-γ-古蕓烯和新臭根醇的羥基化產物的結構指定是暫時的或者如對(+)-喇叭烯而言是根本不可能的。不幸地，這些化合物至今仍未足量產生以將其分離而通過1HNMR闡明結構。羥基化的底物優(yōu)選不含任何極性基團，根據如下觀測，即新臭根醇與β-芹子烯相比有效羥基化低15倍，以及如下觀測，即大根香葉酮不被羥基化而大根香葉烯B被羥基化。底物的大小也是重要的，因為苧烯，一種更小的單萜，幾乎不發(fā)生羥基化。在紫穗槐-4，11-二烯的情況中，形成兩種獨特的倍半萜醇產物。在異丙烯基側鏈及更低效地在異亞丙基側鏈處發(fā)生的羥基化由(+)-大根香葉烯A羥化酶催化，該酶存在于菊苣根的微粒體沉淀中。因此，這些羥基化可以被(+)-大根香葉烯A競爭性抑制(表II)。各種非天然底物通過植物次生代謝物的細胞色素P450酶羥基化與植物次生代謝物的酶具有窄的底物特異性的一般見解相矛盾(Donaldson和Luster，1991；Halkier，1996；Schuler，1996；Mihaliak等人，1993；Karp等人，1990)。未知的喇叭烯醇和未知的紫穗槐-4，11-二烯醇(KI1720)的形成不可能發(fā)生在異丙烯基/異亞丙基側鏈中，然而這些反應也被(+)-大根香葉烯A抑制。盡管難以理解，但提示這些反應中涉及(+)-大根香葉烯A羥化酶。特別是(+)-大根香葉烯A對紫穗槐-4，11-二烯-12-醇和未知的紫穗槐-4，11-二烯醇形成的競爭性抑制率相同。紫穗槐二烯-4，11-二烯在異丙烯基側鏈處的羥基化也是令人感興趣的。假設其是抗瘧藥青蒿素在Artemisiaannua中形成的重要步驟，但關于這種植物仍無其報道(Bouwmeester等人，1999a)。一般而言，用于調味品和香料工業(yè)的新物質的產生在關于通過微生物羥基化萜烯的研究中是強大的動力。盡管在一些情況中是成功的，但這些微生物轉化通常產生多種產物，包括環(huán)氧化物和二醇(Lamare和Furstoss，1990；Drauz和Waldmann，1995；Faber，2000)，而且氧化通常在雙鍵處發(fā)生。相反，由菊苣的微粒體沉淀催化的羥基化產生一種，有時是兩種產物，而且出現(xiàn)更多的區(qū)域特異性。例如在(+)-γ-古蕓烯的情況中與植物致病真菌Glomerellacingulata一起溫育產生(1S，4S，7R，10R)-5-guaien-11，13-二醇和(1S，4S，7R，10S)-5-guaien-10，11，13-三醇(Miyazawa等人，1998)，而與菊苣的微粒體沉淀一起溫育產生(1S，4S，7R，10R)-5，11(13)-愈創(chuàng)木二烯-12-醇(圖7)。實施例2鑒定及表征參與大根香葉烯酸轉化為倍半萜內酯的酶(+)-木香烴內酯是大根香葉內酯最根本的結構，并認為其是所有大根香葉烯衍生的倍半萜內酯，其中包括菊苣的愈創(chuàng)內酯、桉葉內酯和大根香葉內酯的母體化合物。非常有可能這種化合物從FPP通過(+)-大根香葉烯A、大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醇和大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)形成(圖2)(DeKraker等人，1998，2001a)。認為這種大根香葉烷酸4在C6位通過細胞色素P450酶而被羥基化，之后內酯化產生(+)-木香烴內酯(5)(圖8)。大根香葉烯酸分離自新鮮的木香(DeKraker等人，2001b)，這使得可以研究倍半萜內酯的內酯環(huán)的形成中的這個最后步驟(Geissman，1973；Fischer等人，1979；Fischer，1990)。認為(+)-木香烴內酯認為是倍半萜內酯生物合成中的分支點，由此分出愈創(chuàng)內酯、桉葉內酯和大根香葉內酯的形成。許多不同的作者假定(+)-木香烴內酯環(huán)化為愈創(chuàng)內酯或桉葉內酯分別由C4-C5環(huán)氧化或C1-C10環(huán)氧化介導(Brown等人，1975；Fischer1990；Teisseire，1994；Piet等人，1995)。或者，已經提出大根香葉內酯的C3羥基化對愈創(chuàng)內酯形成的必需性(Piet等人，1996)材料和方法栽培的菊苣(CichorittmintybusL.，cvFocus)的新鮮根在夏末期間收獲并得自荷蘭Veenendaal的栽培者(J.deMik)。將菊苣根切成小片，在液氮中冷凍并貯存在-80℃下。大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)、(+)-木香烴內酯(5)及去氫木香內酯(圖9、18)分離自木香(DeKraker等人，2001b)。α-和β-木香酸混合物的合成如DeKraker等(2001b)所述，而欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(9)的合成如deKraker等(2001a)所述。leucodin(22)樣品由M.Ando教授(NiigataUniversity，Japan；Ando等人，1994)和ShiYongRyu博士(KoreaResearchInstituteofChemicalTechnology，Yusung，Taejon，韓國)惠贈，他們還提供了其C11-差向異構體蓍草苦素(Ho等人，1998)。11，13-二氫-去氫木香內酯(川木香內酯)由Y.Asakawa教授(TokushimaBunriUniversity，日本)惠贈。Parthenolide(17)購自Sigma，順-橙花叔醇購自Fluka。乙醚(二乙醚)和戊烷在使用之前再蒸餾。11(S)，13-二氫-木香烴內酯(20)的GC標準品從2mg(+)-木香烴內酯(5)制備，將其溶解于1.5mL乙酸乙酯中并與1.5mgNaBH4在0℃下一起攪拌，這是用于還原各種倍半萜內酯的C11-C13環(huán)外雙鍵的方法(Asakawa等人，1980；Asakawa，1982；Seto等人，1988)。在45分鐘后，通過加入1％HAc和2ml額外的乙酸乙酯來結束反應。有機相過濾通過具有玻璃纖維塞子的巴斯德移液管，所述移液管含有0.45g二氧化硅和少量無水MgSO4。濾液的GC-MS分析顯示，一半(+)-木香烴內酯轉化為11(S)，13-二氫-木香烴內酯，而未檢測到一點其C11-差向異構體。酶分離及分析(+)-木香烴內酯合酶活性菊苣根的無細胞提取物從冷凍的原料制備，該制備以與分離大根香葉烯A羥化酶(實施例1)所述相同的方式進行，但是在提取緩沖液中不加入MgCl2，因為伴隨的(+)-大根香葉烯A合酶活性不是檢測(+)-木香烴內酯合酶活性所必需的。將制備的20000g上清液通過Econo-Pac10DG柱(Biorad)脫鹽為分析緩沖液，所述緩沖液含有25mMTris(pH7.5)、1mM抗壞血酸、5μMFAD、5μMFMN和10％(v/v)甘油。該分析緩沖液中沒有DTT，因為DTT中存在的SH基團可能進行“Michael型加成”，加成至(+)-木香烴內酯的C11-C13環(huán)外雙鍵上(Kupchan等人，1970)。將脫鹽的上清液的1ml等分與3μl15mM大根香葉烯酸(4)在叔丁基甲基醚的溶液中和1mMNADPH-再生系統(tǒng)一起溫育，所述再生系統(tǒng)由1mMNADPH、5mM葡糖-6-磷酸和1.2IU葡糖-6-磷酸脫氫酶組成(均得自Sigma)。溫育還與沸騰的脫鹽上清液一起并在沒有NADPH存在下進行。使用欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(圖2、9)及α-和γ-木香酸的混合物(14)重復進行該實驗，所述混合物可以作為大根香葉烯酸(4)的底物類似物。在30℃下溫育1小時后，將反應物在冷凍機中貯存。在加入作為內標的于乙醇中的0.2mM順-橙花叔醇溶液之后，將溫育物用1mL于戊烷中的20％(v/v)乙醚提取3次。有機相過濾通過具有玻璃纖維塞子(二甲基氯硅烷處理的玻璃纖維；Chrompack)巴斯德移液管，所述移液管含有0.45g二氧化硅和少量無水MgSO4。將該柱用1.5ml乙醚洗滌并在氮氣流下將提取物小心濃縮為大約50μl。將2μl樣品通過GC-MS進行分析，使用注入口溫度為320℃以引起(+)-木香烴內酯(5)的Cope重排。記錄在70eV下從35-300原子質量單位掃描的質譜；GC烘箱溫度如以前描述地程序化(deKraker等人，1998)。表征(+)-木香烴內酯合酶活性為了確定從大根香葉烯酸(4)形成(+)-木香烴內酯(5)是否由細胞色素P450酶催化，測試了各種確定的細胞色素P450抑制劑(細胞色素C、甲吡酮、克霉唑、咪康唑和氨基苯并三唑)對這個反應的影響，以及CO或氬氣的影響。也研究了輔因子依賴性，即加入NAD(P)+或NADH而不是NADPH。以與實施例1中針對大根香葉烯A羥化酶所述相似的方式進行實驗，使用20000g上清液和5μl0.2mM順-橙花叔醇作為內標。使用10％O2加上90％N2(空白)及10％O2加上90％CO的氣體混合物研究CO抑制的藍光逆轉。使用18O2(99％純；IconServices，Mt.Marlon，NY，USA)研究氧導入。將置于(通風的)有間隔蓋子的4.5-mL小瓶中的1ml溫育混合物首先通入氮氣，以除去空氣，隨后通入氧-18。將形成的化合物的質譜與用空氣的標準酶分析中形成的那些化合物的質譜相對比。研究(+)-木香烴內酯的隨后轉化如針對大根香葉烯酸所述用(+)-木香烴內酯(30μM)進行溫育，以測試在大根香葉烯酸溫育期間是否發(fā)生這種化合物的進一步酶促轉化。還溫育Parthenolide(20μM)(圖9、17)，因為其也許是愈創(chuàng)內酯形成的中間體。將去氫木香內酯(20μM)(18)作為還原的模型化合物溫育，所述還原發(fā)生在(+)-木香烴內酯的C11-C13環(huán)外雙鍵上。研究確定的細胞色素P450抑制劑和CO對(+)-木香烴內酯轉化的影響，正如各種吡啶核苷酸輔因子和氬氣的影響一樣。大根香葉烯酸轉化為倍半萜內酯對將20000g菊苣根上清液與大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)一起在NADPH再生系統(tǒng)存在下溫育的戊烷-乙醚提取物進行GC-MS分析，顯示三種產物，它們在不與NADPH一起溫育或在沸騰的上清液中的溫育中檢測不到(圖10A+B)。檢測在注入口溫度為320℃時與標準品的(+)-木香烴內酯(5)共同洗脫的主峰，其為其Cope重排產物去氫風毛菊內酯(10)(圖3C)。底物大根香葉烯酸也以其Cope-重排產物，即欖香烯酸(9)及對映異構體欖香烯酸得到測定(deKraker等人，2001b)。另外兩種產物鑒定為11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)，其Cope重排為風毛菊內酯(21)，及l(fā)eucodin(22)(圖11)。11(S)，13-二氫木香烴內酯和leucodin均是從(+)-木香烴內酯酶促形成的，并因此在(+)-木香烴內酯與20000g上清液和NADPH的溫育中也出現(xiàn)。不能排除在大根香葉烯酸溫育期間形成更多的產物，因為較高氧化的倍半萜內酯的揮發(fā)性可能不足以通過氣相色譜檢測。此外，在菊苣提取物中存在脂肪酸(Sannai等人，1982)使得GC分析變得復雜，因為它們產生大峰在其之下較小的產物峰可能“消失”。底物類似物α-和β-木香酸(14)和欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(9)沒有可檢測的轉化。表征(+)-木香烴內酯合酶為了表征(+)-木香烴內酯合酶，GC-MS對不同濃度的(+)-木香烴內酯的反應優(yōu)選應是線性的。然而，在所用的320℃注入口溫度下，木香烴內酯的GC圖譜(圖10C)未顯示去氫風毛菊內酯(19)的尖峰，而是含有木香烴內酯相關產物如α-和β-環(huán)木香烴內酯的小峰的拖尾。顯然(+)-木香烴內酯與例如大根香葉烯酸(4)相比對Cope重排的耐受性更強。在文獻中，已經注意到內酯環(huán)對大根香葉烯的熱穩(wěn)定性具有強力影響，而且(+)-木香烴內酯的Cope重排是可逆的(Jain等人，1970；Minnaard，1997)。因此，在GC柱上，去氫風毛菊內酯(19)甚至可能進行一定程度的向(+)-木香烴內酯的逆轉反應(Grieco和Nishazwa，1977)。然而通過降低注入口溫度而避免在注入口的Cope重排導致(+)-木香烴內酯在其經過柱遷移期間的Cope重排，并產生寬峰(與實施例1中顯示的大根香葉烯醛的相似)而不是明顯的(+)-木香烴內酯峰。盡管去氫風毛菊內酯GC峰的性質較差，但其與注入的5μM至50μM濃度范圍的(+)-木香烴內酯呈線性。相對于順-橙花叔醇的應答因子是0.15，低于5μM的濃度不可檢測，這意味著在溫育混合物中(+)-木香烴內酯濃度低于0.25μM即0.25nmol是不可檢測的。表征(+)-木香烴內酯合酶的問題更多在于幾乎確實不是所有木香烴內酯的隨后轉化產物均得到檢測。因此，給出的酶活性是去氫風毛菊內酯(19)、風毛菊內酯(21)和leucodin(22)的峰總和，因此是高于木香烴內酯合酶活性的絕對值。欖香烯酸峰(底物峰)的定量測定不是一個選擇，因為其與濃度不呈線性，而且更通常地GC上酸峰的質量差。表IV顯示木香烴內酯合酶依賴于氧和NADPH，而NADH作為還原劑的效力較低。這提示細胞色素P450酶的參與，這通過各種確定的細胞色素P450抑制劑的影響而證實(West，1980；Mihaliak等人，1993)。在細胞色素C(100μM)存在下，測不到大根香葉烯酸(4)的酶促產物；咪康唑(100μM)使可測產物的量降低71％，氨基苯并三唑(100μM)使之降低44％，甲吡酮(1mM)使之降低78％，而克霉唑(100μM)使之降低97％。細胞色素P450酶參與的最有力的證據是CO對酶活性的藍光可逆抑制(West1980；Mihaliak等人，1993)。圖12所示結果顯示CO對(+)-木香烴內酯、11(S)，13-二氫木香烴內酯和leucodin的產生總量的抑制，其可以在一定程度上被藍光逆轉。表征(+)-木香烴內酯的隨后轉化將(+)-木香烴內酯與20000g菊苣根上清液在NADPH存在下溫育，產生11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)和leucodin(22)。在對溫育進行GC-MS分析時未檢測到其它產物，但是與產物峰的強度相比去氫風毛菊內酯的峰高下降強烈提示在GC上檢測不到的其它產物的形成。催化木香烴內酯的11(S)，13-環(huán)外雙鍵還原的酶活性不能進行與去氫木香內酯(18)相同的反應。溫育parthenolide(17)不產生leucodin(22)，但不能排除parthenolide轉化為其它不可測定的倍半萜內酯。Parthenolide自身在GC分析時分解成多個峰，因此在溫育之后對存在的parthenolide的量不能定量測定。為了測試哪種類型的酶可以催化11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)和leucodin(22)的形成，改變吡啶核苷酸輔因子(表V)。這兩種化合物的形成均依賴于NADPH，但在沒有任何輔因子存在下保留一部分(+)-木香烴內酯還原酶活性。表VI顯示leucodin從(+)-木香烴內酯的形成依賴于氧，而11，13-二氫木香烴內酯的形成則不。leucodin的形成受CO的強烈抑制，這提示細胞色素P450酶的參與。因此，除了氨基苯并三唑之外，其還受所有測試的細胞色素P450抑制劑的抑制。導入氧-18在氧-18存在下溫育大根香葉烯酸(4)導致在(+)-木香烴內酯(5)中導入一個18O原子。去氫風毛菊內酯(19)的質譜中分子離子峰從232升高至234amu(圖13)。在風毛菊內酯(21)的質譜中觀測到相似的變化，風毛菊內酯(21)是11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)的Cope重排產物。其離子峰從234變?yōu)?36amu，而[M-Me]+峰從219變?yōu)?22amu。將氧-18(99％)通入酶分析對酶活性沒有任何可測定的負面影響。leucodin的質譜顯示導入兩個18O原子，而且離子峰的質量明顯升高4個單位，從246升高到250amu(圖14)。不幸地，在酶分析中l(wèi)eucodin的GC-峰重疊在亞油酸的拖尾峰上(圖10A)，該拖尾峰污染leucodin的質譜，特別是在較低質量范圍內。結論本結果顯示，菊苣含有一種酶，其將大根香葉1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)轉化為(+)-木香烴內酯(5)，產生存在于倍半萜內酯中的內酯環(huán)。這個步驟是從FPP經由(+)-大根香葉烯A、大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醇和大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-酸(4)至大根香葉烯衍生的倍半萜內酯的假定途徑的最終驗證(Geissman，1973；Fischer等人，1979；Fischer，1990)。(+)-木香烴內酯合酶是細胞色素P450酶，其依賴于NADPH和O2并因此受各種確定的細胞色素P450抑制劑的抑制(West，1980；Mihaliak等人，1993)。酶活性的藍光可逆性CO抑制也可以得到證明，盡管該結果有時被隨后的(+)-木香烴內酯酶促轉化干擾。在氧-18存在下溫育顯示(+)-木香烴內酯中導入一個18O原子，這是細胞色素P-450酶的另一個典型特征(West，1980；Mihaliak等人，1993)。還證實了這樣的機理，其中大根香葉烯酸首先在C6位被羥基化(Fischer等人，1979)，之后大概是由酶介導，該羥基進攻在C12位上的羰基。在產生內酯化期間，發(fā)生氧同位素被導入內酯環(huán)中(圖15)。(+)-木香烴內酯合酶不能轉化底物類似物α-木香酸(圖2、14)，或欖香-1，3，11(13)-三烯-12-酸(9)，這不是意料之外的，因為C6位不是烯丙基。然而，其中C6-位是烯丙基的γ-木香酸(13)也未被轉化，因此顯然環(huán)癸二烯環(huán)系的幾何形狀是反應所必需的。將(+)-木香烴內酯(5)與NADPH和20000g菊苣根上清液一起溫育隨后轉化為11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)和leucodin(22)(圖16)。11(S)，13-二氫木香烴內酯的形成不依賴于氧，但在NADPH存在下明顯增強，而在無NADPH存在下只保留15％的低酶活性。C11-C13環(huán)外雙鍵的還原與enoate還原酶催化的反應類型相似，enoate還原酶是一組分離自Clostridium的鐵-硫黃素蛋白，其在還原劑存在下在厭氧條件下催化α，β-不飽和羧酸的烯鍵的還原(Holland，1992)。木香烴內酯中C11-C13環(huán)外雙鍵的還原立體選擇性地發(fā)生，并且只產生11(S)，13-立體異構體。在C11的立體化學與存在于菊苣中的11(S)，13-二氫倍半萜內酯的立體化學相同(Seto等人，1988；vanBeek等人，1990)。與菊苣相反，一些其它植物物種含有C11-差向異構體如蓍草苦素，其是leucodin的11(R)-差向異構體(Martinez等人，1988；Ho等人，1998)，表明合成這些C11-差向異構體的對映異構選擇性酶應存在于這些其它物種中。該酶呈現(xiàn)至少一些底物特異性，因為去氫木香內酯(18)的C11-C13環(huán)外雙鍵未被還原。leucodin(22)的形成證明愈創(chuàng)內酯源自(+)-木香烴內酯。其形成可能涉及一種以上的酶。未研究leucodin是否源自11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)。Parthenolide(17)不參與leucodin生物合成，但其不能排除11(S)，13-二氫parthenolide參與leucodin生物合成。許多作者已經提示4，5-環(huán)氧化物或C3-羥基化是直接環(huán)化(+)-木香烴內酯向愈創(chuàng)木烷所必需的(Brown等人，1975；Fischer1990；Teisseire，1994；Piet等人，1995，Piet等人，1996)。leucodin從(+)-木香烴內酯的形成可以通過加入確定的細胞色素P450抑制劑或CO而抑制，而11(S)，13二氫木香烴內酯(20)的形成則不。此外，用氧-18進行實驗表明酮基的氧原子也源自分子氧，這至少提示細胞色素P450-酶參與leucodin生物合成(West，1980；Mihaliak等人，1993)?？梢哉J為Leucodin是11(S)，13-二氫-8-脫氧萵苣苦素的前體，后者是菊苣的次要倍半萜內酯(vanBeek等人，1990)?？赡苓@種倍半萜內酯在進行溫育期間也形成，但由于其極性/較低揮發(fā)性而在GC-MS測定中未檢測到。(+)-木香烴內酯和可能的11(S)，13-二氫木香烴內酯(20)可能參與菊苣的其它苦味倍半萜內酯的生物合成。檢測和分析酶促反應混合物中這些化合物包括衍生化和/或其它色譜技術如HPLC的使用。實施例3使用分離自菊苣根的酶將朱欒倍半萜生物轉化為諾卡酮因為在C2位羥基化倍半萜烯化合物骨架的細胞色素P450可進一步氧化這種羥基以形成酮的脫氫酶活性的存在，如實施例2所述，我們決定氧化倍半萜朱欒倍半萜以研究諾卡酮是否形成。合成參比物通過用在5ml無水乙醚(二乙醚)中的20mgLiAlH4還原190mg諾卡酮(Fluka)而制備β-諾卡醇(Shoji等人，1984)。在攪拌該灰色懸浮液一夜后，通過小心加入Na2SO4·10H2O來結束反應。將該混合物再攪拌30分鐘，并通過加入MgSO4干燥。濾出固體物，用蒸餾水洗滌乙醚。在干燥及溶劑蒸發(fā)之后，獲得140mg粗油，其除β-諾卡醇之外還含有4％的α-諾卡醇。EIMS(70eV)m/z220[M]+(33)，177(77)，161(40)，145(52)，131(77)，119(100)，109(41)，107(50)，105(59)，95(46)，93(60)，91(43)，81(45)，79(80)，77(64)，69(47)，67(52)，55(58)，43(55)，41(94)，39(54)。在二氧化硅上用乙醚-戊烷(2∶1)對50mg這種粗油進行閃蒸色譜后，合并沒有任何α-諾卡醇的部分，產生3.6mgβ-諾卡醇。1HNMR(200MHz，C6D6)δ0.83(d，3H，J＝3Hz)，δ0.95(s，3H)，δ0.96-1.47(m，7H)，δ1.75(m，3H)，δ1.93(dt，1H，J＝12.7和2.7Hz)，δ2.07(m，1H)，δ2.20-2.33(m，2H)，δ4.19-4.26(m，1H)，δ4.88(brs，2H)，5.44(brd，1H)。13CNMR(100MHz，DEPT，CDCl3)δ15.7(q)，δ18.4(q)，δ21.1(q)，δ32.8(t)，δ33.4(t)，δ37.8(t)，δ38.5(s)，δ39.8(d)，δ41.3(d)，δ45.1(t)，δ68.1(d)，δ109.2(t)，δ125.9(d)，δ144.9(s)，δ150.2(s)。EIMS(70eV)m/z220[M]+(56)，177(100)，145(31)，135(51)，131(43)，123(38)，121(91)，119(81)，109(42)，107(66)，105(62)，95(49)，93(69)，91(87)，81(39)，79(60)，77(56)，69(45)，67(51)，55(62)，53(42)，43(52)，41(100)，39(55)。通過將反，反-法呢醇(Sigma)溶解于戊烷中并與MnO2一起攪拌而制備反，反-法呢醛和順，反-法呢醛的混合物。用氧化銀(Caliezi和Schinz，1947)將法呢醛氧化為順，反和反，反-法呢酸的混合物。與微粒體沉淀一起溫育含有(+)-大根香葉烯A羥化酶活性的微粒體沉淀和酶懸浮液從深冷的菊苣塊制備，如實施例1所述。將酶懸浮液分成1ml等分并在1mMNADPH再生系統(tǒng)存在下與50μM(+)-朱欒倍半萜一起溫育，所述再生系統(tǒng)由1mMNADPH、5mM葡糖-6-磷酸和1.2IU葡糖-6-磷酸脫氫酶組成。在每個分析中底物的初始濃度為45μM，所有實驗均平行兩份進行。空白分析中不加入NADPH再生系統(tǒng)，以使細胞色素P450酶(包括(+)-大根香葉烯A羥化酶)無活性。在60分鐘后結束溫育，將其貯存在-20℃的冷凍機中。酶分析如實施例1所述進行。結果將(+)-朱欒倍半萜與菊苣根的微粒體沉淀和NADPH一起溫育只產生(圖17)痕量的預期朱欒倍半萜-12-醇([+]-2-[2R]-2-[1，2，3，4，6，7，8，8a-八氫-8α，8αβ-二甲基-2α-萘基]-2-丙烯-1-醇)，通過將其質譜與R.Naf博士(FirmenichSA，日內瓦，瑞士)提供的質譜相對比而鑒定。EIMS(70eV)m/z220[M]+(22)，189(52)，187(41)，161(80)，145(54)，131(49)，21(41)，119(58)，117(39)，107(55)，105(84)，95(44)，93(73)，91(100)，81(47)，79(84)，77(51)，67(39)，55(48)，41(63)。主要產物是諾卡酮(表VII)，而在大多數實驗中，檢測的相應的β-諾卡醇的量少于朱欒倍半萜-12-醇(圖17中所示的色譜是例外)。假定該β-諾卡醇是諾卡酮形成的中間體。為此原因，將100μMβ-諾卡醇在pH10與NAD(P)+和150000g菊苣根上清液一起溫育，如DeKraker等人(2001)所述通過NADP+依賴性脫氫酶轉化(-)-欖香-1，3，11(13)-12-醇和大根香葉-1(10)，4，11(13)-三烯-12-醇那樣進行。在溫育期間，加入的β-諾卡醇在1mMNADP+或1mMNAD+存在下有60％以上轉化為諾卡酮。在沒有這些輔因子存在下，轉化仍總計為25％，而煮沸的酶提取物不轉化β-諾卡醇。在pH7.5，酶活性略微降低，而正如所預期的，150000g沉淀與相應的上清液相比產生的脫氫酶活性低3倍。與α和β-諾卡醇的混合物一起溫育顯示只有β-諾卡醇被轉化(圖18)。為了獲得關于菊苣根中存在的脫氫酶的底物特異性的更多信息，還在NAD+或NADP+存在下將150000g上清液與作為底物的100μM反，反法呢醇一起溫育(圖19)。反，反法呢醇有接近60％轉化為反，反法呢醛和順，反法呢醛的混合物，并且也觀察到少量法呢酸。用Tris、甘氨酸和CAPS緩沖液測試pH7.5至11.0之間的各種pH值；在pH10時觀察到法呢醇最大程度轉化為法呢醛，在pH7.0時酶活性降低為最大酶活性的30％。結論菊苣酶提取物有效地催化(+)-朱欒倍半萜經由β-諾卡醇轉化為諾卡酮(圖17和18)?？赡苓@些反應由參與從(+)木香烴內酯生物合成leucodin(圖20；實施例2)的相同酶催化?；谄渑cleucodin的結構相似性，同樣的轉化可以發(fā)生于(+)-喇叭烯(見實施例2，表I)，但這種化合物僅被羥基化而不轉化為酮。通過菊苣的酶催化的諾卡酮形成經由β-諾卡醇而進行，β-諾卡醇隨后被NAD(P)+依賴性脫氫酶氧化為諾卡酮。這些脫氫酶是起作用的可溶性酶，但顯然在微粒體沉淀中部分結束，只是作為大根香葉烯醇脫氫酶。參與諾卡酮形成的該脫氫酶對β-諾卡醇比對α-諾卡醇具有強優(yōu)先性，這可表明也許在植物中的特異性酶的參與是leucodin的醇前體氧化的原因。一般而言，在150000g菊苣上清液中存在的脫氫酶似乎不具有高度底物特異性作用。除了轉化大根香葉烯醇和欖香烯醇/醛(實施例1)之外，它們也能將反，反法呢醇轉化為法呢醛、法呢酸。法呢醇到法呢醛的NAD(P)+依賴性氧化包括觀察到的法呢醛的異構化，也已經在其它植物粗提物中進行了報道(Chayet等人，1973；Overton和Roberts，1974)。分離的脫氫酶活性是否在體內專門地參與倍半萜內酯生物合成或者(也)具有不同的功能還未知。諾卡酮是一種更值得研究的脂肪族物質，其具有獨特的柚子香味，廣泛用于調味品和香料及食品工業(yè)中。還已證明諾卡酮是抗?jié)兯幬锏闹匾M分(Yamahara等人，1990)。為此原因，已經廣泛研究了轉化較低價值的(+)-朱欒倍半萜的可能性，但是通過化學方法或微生物學方法獲得的收率不令人滿意或者太費力(Dhavlikar和Albroscheit，1973；Kunst等人1975；Lamare和Furstoss，1990)。令人矚目地，現(xiàn)今仍沒有任何直接證據表明在柚子，朱欒倍半萜和諾卡酮的來源中存在生物化學途徑將(+)-朱欒倍半萜經由β-諾卡醇轉化為諾卡酮(delRio等人，1992)。一般而言，用于調味品和香料的新物質的產生對研究微生物對萜烯的羥基化一直是強大的推動力。盡管在一些情況中是成功的，但這些微生物學轉化通常產生多種產物，包括環(huán)氧化物和二醇(Lamare和Furstoss，1990；Drauz和Waldmann，1995；Faber，2000)，而且氧化通常發(fā)生在雙鍵上。這與由菊苣酶提取物催化的朱欒倍半萜高度特異性氧化為諾卡酮形成鮮明對比。實施例4使用菊苣脫氫酶進一步氧化倍半萜醇羧酸是重要的調味品和香料。例如，各種鏈長的脂肪酸是奶酪調味品所極為特征性的(West，1996)，而更高級的脂肪酸有助于花生的味道和氣味(Hashim等人，1993)。支鏈脂肪酸在羊肉和綿羊奶酪中是重要的調味品(Heinsman，2000；Heinsman等人，submitted)。與大根香葉烯醇轉化為大根香葉烯酸相關的菊苣脫氫酶具有相對低的底物特異性。因此，我們研究了這些脫氫酶是否能夠氧化其它類型的萜烯醇和醛以及線性和支鏈脂肪醇和醛。根據DeKraker等人(2001a)所述方法制備含有脫氫酶的菊苣酶制劑或提取物。在NADP+存在下與醇或醛例如紫穗槐-4，11-二烯-12-醇或相應的醛一起溫育，導致相應的羧酸以高收率形成。在紫穗槐-4，11-二烯-12-醇的情況中，產生青蒿酸和二氫青蒿酸的混合物。顯然，該脫氫酶不僅能將紫穗槐二烯氧化為青蒿酸，而且與木香烴內酯之后的途徑(實施例2)中異丙烯基中雙鍵的還原相關的還原酶能將青蒿酸還原為二氫青蒿酸。因為假定二氫青蒿酸轉化為青蒿素非酶促進行，因此菊苣可以是青蒿素的合適生產生物，或者可用于在其它生物生產青蒿素的基因來源。以相同的方式，辛醇或辛醛及4-甲基辛醇或4-甲基辛醛分別被氧化為相應的辛酸和4-甲基辛酸。由于4-甲基辛酸是手性的，因此我們檢測了產物的立體化學組成，其似乎主要含有R-對映結構體。實施例5使用分離自菊苣根的酶大規(guī)模生物轉化倍半萜制備固定化酶將栽培的菊苣的新鮮根如實施例1所述處理，并將150000g沉淀用于以下實驗。將兩克沉淀懸浮于50ml脫鹽水中，所述脫鹽水含有25mMTrispH7.5、10％甘油、1mM抗壞血酸和2mMDTT。向其中加入10UNADPH再生酶如葡糖-6-磷酸脫氫酶，氫化酶或優(yōu)選甲酸脫氫酶(Seelbach等人，1996)及100g固體載體如DEAE-Sepharose、聚丙烯酰胺或者優(yōu)選Accurel珠。將混合物在4℃下攪拌過夜，之后過濾固定化酶，用含有25mMTrispH7.5、10％甘油和1mM抗壞血酸的脫鹽水洗滌，貯存在4℃下直至使用?；蛘?，將菊苣酶與輔因子循環(huán)酶的混合物在4℃下與疏水膜(扁平膜或中空纖維單元)接觸一夜，之后洗滌該膜并將該膜(含有固定化酶)在4℃下貯存直至使用。固定化酶與倍半萜的反應將固定化酶在室溫下置于生物反應器中并懸浮于500ml脫鹽水中，所述脫鹽水中含有25mMTrispH7.5、10％甘油和1mM抗壞血酸。向此混合物中加入NADPH直至0.3mM，同時加入適量的輔被用物以進行輔因子循環(huán)。通常，當使用葡糖-6-磷酸脫氫酶循環(huán)NADPH時，加入1.5mM葡糖6-磷酸作為輔被用物，而當選擇甲酸脫氫酶時，加入100mM甲酸/甲酸鈉pH7.5。然后，將倍半萜底物(于乙醇中100mM)泵入生物反應器中，速度為0.1ml/min，持續(xù)輕輕攪拌。同時，將氧氣使用薄壁硅管泵入生物反應器中，所述硅管允許無泡沫通氣(Rissom等人，1997)。選擇這種系統(tǒng)是因為已知氣-液界面(如氣泡)通常導致單加氧酶失活。當已經加入50ml底物溶液(5mmol，大約1g倍半萜)時停止泵入，并將反應混合物在室溫下攪拌直至產物濃度不再增加(通過脫機GC監(jiān)測)。這時，濾出固定化酶，通過用戊烷提取含水介質，隨后在二氧化硅上進行色譜(使用石油醚/乙酸乙酯混合物作為溶劑)而獲得產物。以這種方式，可以獲得0.5g純羥基化的倍半萜，但取決于所用的底物，獲得更高收率也是可能的。以這種方式，使用朱欒倍半萜作為底物，也可以獲得諾卡酮，收率為約50％或更高。固定化酶用緩沖液洗滌并可以重復使用多次。在高于環(huán)境溫度下進行酶促反應是可能的，但導致酶制劑的壽命降低。在氫化酶的情況中，當這種酶與菊苣酶單獨固定并使用兩室生物反應器時獲得更有利的結果。所述兩室由高度多孔膜分隔，所述多孔膜對所用的NADP(H)輔因子是滲透性的。一個室中含有固定化氫化酶和薄壁硅管，氫氣從該硅管中泵入。另一個室含有固定化菊苣酶和薄壁硅管，氧氣從該硅管中泵入。以這種方式，這兩種酶均能接近其底物和輔因子，而氫化酶不被氧氣失活?；蛘撸黄鸸潭ㄔ诠腆w珠上的酶可用于補料分批生物反應器中，其中出口裝有疏水膜，以使產物能通過而輔因子及酶保留在反應器中。為此目的，其中兩種酶制劑均固定于膜上的膜反應器是最有利的。使用這種系統(tǒng)，所述酶可以連續(xù)使用，因為它們長期穩(wěn)定，使得易于制備幾百克羥基化的倍半萜或諾卡酮。實施例6菊苣及其它菊科細胞和發(fā)根培養(yǎng)物在生物轉化(倍半)萜中的應用去分化的細胞或愈傷組織、發(fā)根、嫩芽及其它組織的培養(yǎng)物已經廣泛用于生物轉化多種底物。例如葡萄的細胞懸浮培養(yǎng)物能將檸檬醛轉化為橙花醇、香葉醇和乙酸香葉酯。菊科物種也適于這種方法。菊苣的發(fā)根和細胞培養(yǎng)物使用標準方法獲得(發(fā)根培養(yǎng)物Song等人，1995；細胞培養(yǎng)物Dubois等人，1988)。給培養(yǎng)物補加200mg/l的倍半萜如朱欒倍半萜、α-古蕓烯、紫穗槐-4，11-二烯和α-反香檸檬烯。在倍半萜存在下生長1周后，使用戊烷/乙醚將反應產物從培養(yǎng)基和發(fā)根/細胞中提取出來。使用GC-MS表征反應產物。與朱欒倍半萜一起溫育產生有效轉化為諾卡酮。與α-古蕓烯、紫穗槐二烯和α-反-香檸檬烯一起溫育產生以高度區(qū)域選擇性有效轉化為相應的醇，羥基化僅發(fā)生在異丙烯基上。實施例7從柚子、文旦、柑橘和Chamaecyparisnootkatensis分離和表征朱欒倍半萜合酶最近我們已經證明，菊苣中倍半萜內酯的倍半萜烯化合物主鏈由(+)-大根香葉烯A合酶形成，該酶將FPP環(huán)化為(+)-大根香葉烯A(deKraker等人，1998；Bouwmeester等人，1999b)。這些所謂的萜烯合酶催化在所有萜類化合物生物合成途徑中的第一個步驟。所述萜烯合酶是一大組酶，其均轉化遍在的底物二磷酸香葉酯(轉化為單萜)、二磷酸法呢酯(轉化為倍半萜)、二磷酸香葉基香葉酯(轉化為二萜)或鯊烯環(huán)氧化物(轉化為三萜)(Bohlmann等人，1998)。倍半萜呈現(xiàn)異常大的結構多樣性，已經描述了7000多種不同的化合物。與其它萜烯合酶(產生單、二和三萜)相似，倍半萜合酶呈現(xiàn)一定程度的序列相似性，這使它們在大多數情況下被識別為倍半萜合酶，并能夠設計用于PCR中的簡并引物，以產生可用于篩選文庫的片段，或者可以使用RACE-PCR擴展以獲得全長cDNA的片段(Bohlmann等人，1998)。特別是在特定的組織或也隨機測序的富集的文庫中可用于獲得這些(倍半)萜合酶(Bohlmann等人，1998)。朱欒倍半萜合酶基因分離自柚子、柑橘、文旦和Chamaecyparisnootkatensis，使用基于倍半萜合酶之間呈現(xiàn)的序列同源性的簡并引物通過PCR進行(參見例如Bouwmeester等人，1999b)，或者使用推定的分離自柚子的倍半萜合酶的序列信息進行，如Genbank中所公布的信息(AF411120)。a)分離mRNA總RNA分離自柚子、柑橘和文旦白色內皮及C.noothatensis，使用purescriptRNA分離試劑盒(Biozym)進行。使用DNaseI(脫氧核糖核酸酶I，無RNase)從RNA分離物中除去DNA。DNaseI經苯酚/氯仿提取而除去，之后沉淀RNA(用NaAc進行乙醇沉淀)。聚(A)+RNA從20μg總RNA中提取，使用與1mg磁珠(DynalA.S.)偶聯(lián)的2μg聚d(T)25V寡核苷酸進行。將聚(A)+RNA再懸浮于20μl水中。b)cDNA合成逆轉錄反應在50μl反應溶液中進行，所述溶液含有10μl聚(A)+混合物，0.3μg寡(dT)25V、1mM每種dATP、dTTP、dCTP和dGTP、50mMTris-HClpH8.3、80mMKCl、10mMMgCl2，并用12UAMV逆轉錄酶(Pharmacia)催化。在42℃下溫育2小時后終止反應，將cDNA用WizardPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)(Promega)純化。將cDNA再懸浮于50μl水中。c)基于PCR產生探針基于萜類化合物合酶的序列對比，為兩個保守區(qū)設計兩個簡并引物有義引物5′-GAYGARAAYGGIAARTTYAARGA-3′；反義引物5′-CCRTAIGCRTCRAAIGTRTCRTC-3′(Wallaart等人，2001)(引物來自Eurogentec，Seraing，Belgium)(Bouwmeester等人，1999b；Wallaart等人，2001)。在總體積為50μl的溶液中進行PCR，所述溶液含有0.5μM兩種引物的每一種、0.2mMdNTP、1USuperTaq聚合酶/1×PCR緩沖液(HTBiotechnologyLTD，劍橋，英國)和10μlcDNA。將反應混合物在熱循環(huán)儀(Robocycler，Stratagene)中溫育，在94℃下變性1分鐘，在42℃下退火1.5分鐘并在72℃下延長1分鐘，共循環(huán)40次。瓊脂糖凝膠電泳揭示一種550bp的特定PCR產物，BLAST對比顯示與倍半萜合酶具有同源性。將該PCR產物使用WizardPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)(Promega)純化，并使用pGEMT系統(tǒng)亞克隆。將大腸桿菌JM101用這種構建體轉化。使用RACE-PCR獲得全長cDNA。為了功能性表達，將cDNA克隆在框架中亞克隆入表達載體pET11d(Stratagene)中。將構建體和沒有插入體的pET11d(作為陰性對照)轉化入大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene)中，在補加氨芐青霉素的LB瓊脂鋪板上在37℃下生長過夜。將補加氨芐青霉素(100μg/ml)和0.25mM異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)物用這些過夜培養(yǎng)物接種為A600＝0.5并在27℃下生長3小時。通過在2000g下離心8分鐘而收集細胞，并再懸浮于1.2ml緩沖液中，所述緩沖液含有15mMMopso(pH7.0)、10％(v/v)甘油、10mMMgCl2、1mM抗壞血酸鈉和2mMDTT(緩沖液A)。將再懸浮的細胞在冰上超聲4分鐘(5秒開，30秒關)，在4℃下離心5分鐘(14000rpm)并將上清液用于分析。為了確定產物特性，將20μM[3H]-FDP加入0.5mL用含有0.1％tween-20的緩沖液A以1∶1稀釋的酶制劑中。在加入1ml再蒸餾戊烷層之后，將試管小心混合并在30℃下溫育1小時。根據分析，將試管混合，去除有機層并通過用無水MgSO4鍍層的氧化鋁短柱。將分析物用1ml戊烷∶乙醚(80∶20)再提取，將其也經過氧化鋁柱，并柱用1.5ml戊烷∶乙醚(80∶20)洗滌該柱。使用放射性GLC和GC-MS(Bouwmeester等人，1999a，b)進行提取物。放射性-GLC分析顯示，cDNA形成功能性活性蛋白質，其催化一種放射性標記的倍半萜從[3H]-FDP形成。陰性對照(無插入體的載體)不產生放射性。對樣品還通過GC-MS加以分析，使用裝備HP5-MS柱(30m×0.25mmi.d.，0.25mdf)和HP5972AMassSelectiveDetector(Hewlett-Packard)的HP5890系列II氣相色譜儀進行。將烘箱程序化為在初始溫度70℃進行1分鐘，隨后以5℃/分鐘梯度至210℃，最后時間為5分鐘。注入口(無分裂模式)、界面和MS源溫度分別為150、290和180℃，He入口壓力通過電壓控制以實現(xiàn)恒定柱流為1.0mL/分鐘。電離電壓設定為70eV，掃描從30-250amu進行。陰性對照不產生倍半萜，而在有表達產物的分析物中，朱欒倍半萜是主要產物。后者的特性通過分析可信標準品及與可信標準對比質譜而證實。實施例8從菊苣分離編碼倍半萜羥化酶和脫氫酶的基因使用兩種方法從菊苣中分離倍半萜羥化酶和脫氫酶。一種方法基于P450基因和脫氫酶之間存在序列同源性。另一種方法使用隨機測序C.intybus根cDNA文庫，已經證明該文庫是分離生物合成基因的強有力工具(Aharoni，等人，2000)。a)分離mRNA總RNA分離自菊苣根，使用purescriptRNA分離試劑盒(Biozym)進行。使用DNaseI(脫氧核糖核酸酶I，無RNase)從RNA分離物中除去DNA。將該DNaseI經苯酚/氯仿提取而去除，之后沉淀RNA(用NaAc進行乙醇沉淀)。聚(A)+RNA從20μg總RNA中提取，使用與1mg磁珠(DynalA.S.)偶聯(lián)的2μg聚d(T)25V寡核苷酸進行。將聚(A)+RNA再懸浮于20μl水中。b)cDNA合成逆轉錄反應在50μl反應溶液中進行，所述溶液含有10μl聚(A)+混合物、0.3μg寡(dT)25V、1mM每種dATP、dTTP、dCTP和dGTP、50mMTris-HClpH8.3、80mMKCl、10mMMgCl2，并用12UAMV逆轉錄酶(Pharmacia)催化。在42℃下溫育2小時后，將反應終止，用WizardPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)(Promega)純化cDNA。將cDNA再懸浮于50μl水中。c)基于PCR產生探針基于細胞色素P450酶和脫氫酶的序列對比，設計對保守區(qū)(conservedregion)的簡并引物，所述保守區(qū)如ER定向信號、血紅素結合域、螺旋I的中心區(qū)和PERF-基序。PCR在總體積50μl進行，所述總體積中含有0.5μM兩種引物的每一種、0.2mMdNTP、1USuperTaq聚合酶/1×PCR緩沖液(HTBiotechnologyLTD，劍橋，英國)和10μlcDNA。將反應混合物在熱循環(huán)儀(Robocycler，Stratagene)中溫育，在94℃下變性1分鐘，在42℃下退火1.5分鐘并在72℃下延長1分鐘，共40次循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳表明一種特定的PCR產物。d)cDNA文庫構建及篩選使用UniZapXR常規(guī)cDNA文庫設備(Stratagene)構建cDNA文庫。為了進行文庫篩選，凝膠純化200ng經PCR擴增的探針，根據廠商指導，用[α-32P]dCTP隨機標記(Ready-To-GoDNAlabellingbeads(-dCTP)，Pharmacia)，并用于篩選鋪板于大腸桿菌XL1-BlueMRF′(Stratagene)上的cDNA文庫的104個噬斑的復制濾膜。根據標準方法進行取噬斑和雜交。使用第二和第三個雜交循環(huán)分離陽性克隆。根據廠商指導(Stratagene)進行從Uni-Zap載體體內切除pBluescript噬菌粒。另外，對來自cDNA文庫的1500個克隆隨機測序，使用BLAST與數據庫中的序列進行對比。發(fā)現(xiàn)有希望的P450及脫氫酶樣序列，并通過異源表達進一步進行表征。在大腸桿菌和酵母中表達分離的基因為了進行功能性表達，將cDNA克隆亞克隆入合適的表達載體中并轉化入合適的表達宿主中。誘導的細胞通過在2000g下離心8分鐘而得到收集，將其再懸浮于1ml分析緩沖液中。再懸浮的細胞在冰上超聲4分鐘(5秒開，30秒關)，在4℃下離心(14000rpm)5分鐘并將上清液用于分析，或者再懸浮的細胞以完整細胞使用。在這兩種系統(tǒng)中均使用大根香葉烯A、朱欒倍半萜和諾卡醇作為底物。使用GC-MS分析分析物的乙醚提取物(見實施例7)。陰性對照不產生大根香葉烯A醇、諾卡醇或諾卡酮，而在具有這兩種基因的表達產物的分析中分別出現(xiàn)大根香葉烯A轉化為大根香葉烯A醇，朱欒倍半萜轉化為諾卡醇及諾卡醇轉化為諾卡酮。實施例9用朱欒倍半萜或紫穗槐二烯合酶基因轉化菊苣以獲得產生諾卡酮或青蒿素的菊苣菊苣轉化如PCT/EP00/02130(Bouwmeester等人，1999b)所述用攜帶朱欒倍半萜或紫穗槐二烯合酶的構建體轉化菊苣。在再生之后，通過檢測酶提取物中倍半萜合酶活性而篩選轉基因植物的導入的基因的活性。為此，將在液氮中研磨的100mg組織在2mlEppendorf瓶中于1.0ml提取緩沖液中提取，使用塑料探針進一步均化該組織，所述提取緩沖液含有50mMMopso(pH6.8)、20％(v/v)甘油、50mM抗壞血酸鈉、50mMNaHSO3、1％PVP-40、10mMMgCl2和5mMDTT。在提取之后，將樣品在4℃和20000g下離心20分鐘。將0.5mL上清液用緩沖液A(實施例7)稀釋2倍，所述緩沖液A還含有6mM原釩酸鈉(磷酸水解酶活性抑制劑)。在加入20μM3H-FPP和1mL再蒸餾的戊烷覆蓋后，將試管小心混合并在30℃下溫育1小時。對分析物進行提取并使用放射性GC和GC-MS進行分析，如實施例7所述。野生型和GUS-構建體對照均呈現(xiàn)相似的倍半萜合酶活性，這是由于存在內源大根香葉烯A合酶活性所致。轉化體呈現(xiàn)改變的倍半萜譜，除了大根香葉烯A之外，分別具有各種量的朱欒倍半萜和紫穗槐二烯。對一些轉化體而言，在體外產生的倍半萜90％是朱欒倍半萜。使用GC-MS分析轉基因植物的提取物顯示，一方面存在朱欒倍半萜、諾卡醇和諾卡酮，另一方面存在青蒿酸、二氫青蒿酸及青蒿素。實施例10在微生物中表達朱欒倍半萜合酶、倍半萜內酯C2羥化酶及相應的脫氫酶以生產諾卡酮將Saccharomycescerevisiae和Pichiapastoris使用S.cerevisaeEasyCompTM轉化試劑盒(Invitrogen)根據廠商指導進行轉化，使用攜帶以下物質的構建體1.朱欒倍半萜羥化酶及一般的商品或菊苣脫氫酶，2.朱欒倍半萜合酶及朱欒倍半萜羥化酶，3.朱欒倍半萜合酶，朱欒倍半萜羥化酶及一般的商品或菊苣脫氫酶。將轉基因細胞生長于反應器中，細胞產物在提取后進行分析。攜帶構建體2和3的轉基因酵母細胞產生諾卡酮，表明酵母脫氫酶氧化所產生的諾卡醇(在2中)。攜帶構建體1的酵母細胞在補給朱欒倍半萜時產生諾卡酮。實施例11在微生物中表達倍半萜合酶及倍半萜羥化酶以生產區(qū)域和立體特異性倍半萜醇將Saccharomycescerevisiae和Pichiapastoris使用S.cerevisaeEasyCompTM轉化試劑盒(Invitrogen)根據廠商指導進行轉化，使用攜帶倍半萜合酶的構建體，例如但不限于紫穗槐二烯合酶、(-)-α-反-香檸檬烯合酶、別異長葉烯合酶、γ-古蕓烯合酶和倍半萜羥化酶cDNA(如實施例8所述獲得)。將轉基因細胞生長于反應器中，細胞產物在提取之后進行分析。轉基因酵母細胞分別攜帶產生紫穗槐二烯-12-醇、(E)-反-香檸檬-2，12-二烯-14-醇，別異長葉烯醇和5，11(13)愈創(chuàng)木二烯-12-醇的構建體。參考文獻AndoM，IbayashiK，MinamiN，NakamuraT，IsogaiK(1994)Studiesonthesynthesisofsesquiterpenelactones，16.Thesynthesisof11β，13-dihydrokauniolide，estafiatin，isodehydrocostuslactone，2-oxodesoxyligustrin，arborescin，1，10-epiaborescin，11β，13-dihydroludartin，8-desoxy-11β，13-dihydrorupicolinB，8-deoxyrupicolinB，3，4-epiludartin，ludartin，kauniolide，dehydroleucodinandleucodin.JNatProd57443-445AharoniA，KeizerLCP，BouwmeesterHJ，ZhongkuiSun，Alvarez-HuertaM，VerhoevenHA，BlaasJ，vanHouwelingenAMML，deVosRCH，vanderVoetH，JansenRC，GuisM，DavisRW，SchenaM，vanTunenAJ，O’ConnellAP(2000)IdentificationoftheSAATgeneinvolvedinstrawberryflavorbiogenesisbyusingDNAmicroarrays.ThePlantCell121-16.AsakawaY(1982)Chemicalconstituentsofhepaticae.InWHerz，HGrisebach，GWKirby，eds，ProgressintheChemistryofOrganicNaturalProductsVol.42.SpringerVerlag，Wien-NewYorkAsakawaY，MatsudaR，TakemotoT(1980)MonoandsesquiterpenoidsfromWiesnerelladenudate.Phytochemistry19567-569.BalkrishnaBL，ChildersWE，PinnickJR，PinnickHW(1981)Oxidationofα，β-unsaturatedaldehydes.Tetrahedron372091-2096BartonDHR，MossGP，WhittleJA(1968)InvestigationsonthebiosynthesisofsteroidsandterpenoidspartIApreliminarystudyofthebiosynthesisofsantoninJChemSoc(C)1813-1818BawdekarAS，KelkarGR(1965)Terpenoids-LXVIIIStructureandabsoluteconfigurationofcosticacid-anewsesquiterpeneacidfromcostusrootoil.Tetrahedron211521-1528BawdekarAS，KelkarGR，BhattacharyyaSC(1967)Terpenoids-CIVCostolfractionofcostusrootoil.Tetrahedron231993-1996BirchAJ(1974)Dihydrobenzenesinsynthesisinterpenenrelatedareas.JAgricFoodChem22162-167BohlmanF，AtesN，JakupovicJ(1983)HirsutinolidesfromSouthAfricanVernoniaspecies.Phytochemistry221159-1162BohlmannJ，Meyer-GauenG，CroteauR(1998)PlantterpenoidsynthasesMolecularbiologyandphylogeneticanalysis.ProceedingsoftheNationalAcademyofScience，USA954126-4133BouwmeesterHJ，WallaartTE，JanssenMHA，vanLooB，JansenBJM，PosthumusMA，SchmidtCO，deKrakerJ-W，KnigWA，F(xiàn)ranssenMCR.(1999a)Amorpha-4，11-dienesynthasecatalysesthefirstprobablestepinartemisininbiosynthesis.Phytochemistry52843-854BouwmeesterHJ，KoddeJ，deKrakerJW(1999b)Sesquiterpenoidsynthasegenesandtheiruseforinfluencingbitternessandresistanceinplants.PatentPCT/EP00/02130BrownED，SutherlandJK，SamTW(1975)Medium-ring1，5-dienes.PartIII.Cyclizationofgermacra-1(10)，4，7-(11)-trieneoxides.JChemSocPerkinTransI，2332-2336CalieziA，SchinzH(1947)ZurKenntnisderSesquiterpeneundAzulenedieCyclisationderFarnesylsure.HelvChimActa322556-2560ChayetL，Pont-LezicaR，George-NascimientoC，CoriO(1973)Biosynthesisofsesquiterpenealcoholsandaldehydesbycellfreeextractsfromorangeflavedo.Phytochemistry1295-101CordellGA(1976)Biosynthesisofsesquiterpenes.ChemRev76425-460DeKrakerJW，F(xiàn)ranssenMCR，deGrootAe，KnigWA，BouwmeesterHJ(1998)(+)-GermacreneAbiosynthesis.Thecommittedstepinthebiosynthesisofbittersesquiterpenelactonesinchicory.PlantPhysiol.1171381-1392.DeKrakerJW，F(xiàn)raussenMCR，DalmMCF，deGrootAe，BouwmeesterHJ(2001a)BiosynthesisofgermacreneAcarboxylicacidinchicoryDemonstrationofacytochromeP450(+)-germacreneAhydroxylaseandNADP+/NAD+-dependentsesquiterpenoiddehydrogenase(s)involvedinsesquiterpenelactonebiosynthesis.PlantPhysiol.1251930-1940.DeKrakerJW，F(xiàn)ranssenMCR，deGrootAe，ShibataT，BouwmeesterHJ(2001b)Germacrenesfromfreshcostusroots.Phytochemistry，58481-487.delRíoJA，A，García-PuigD，PorrasI，García-LidónA，SabaterF(1992)Variationsofnootkatoneandvalencenelevelsduringthedevelopmentofgrapefruit.JAgricFoodChem401488-1490DhavalikarRS，RangachariPN，BhattacharyyaPK(1966)MicrobiologicaltransformationsofterpenesPartIX-Pathwaysofdegradationoflimoneneinasoilpseudomonad.IndianJBiochem3158-164DhavlikarRS，AlbroscheitG(1973)MicrobiologischeUmsetzungvonTerpenenValencen.DragocoReport12250-258DonaldsonRP，LusterDG(1991)MultipleformsofplantcytochromesP-450.PlantPhysiol96669-674DrauzK，WaldmannH(1995)EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis-AComprehensiveHandbook.VCH，Weinheim，667-701FaberK(2000)BiotransformationsinOrganicChemistry.4nded，Springer-Verlag，Berlin，453pages.FischerNH(1990)SesquiterpenelactonesBiogenesisandbiomimetictransformations.InGTowersandHTowers，eds，BiochemistryoftheMevalonicAcidPathwaytoTerpenoids.PlenumPress，NewYork，pp161-201FischerNH，OlivierEJ，F(xiàn)ischerHD(1979)Thebiogenesisandchemistryofsesquiterpenelactones.InWHerz，HGrisebach，GWKirby，eds，ProgressintheChemistryofOrganicNaturalProductsVol.38.SpringerVerlag，Wien-NewYorkFranssenMCR，WaltonNJ(1999)Biotransformations.InNJWalton，DEBrowneds，ChemicalsfromPlants，WorldScientificPublishers，London，277-325GeissmanTA(1973)Thebiogenesisofsesquiterpenelactonesofthecompositae.InVCRuneckles，TJMarby，eds，RecentAdvancesinPhytochemistry，Vol6，AcademicPress，NewYorkandLonden，pp65-95Genderen，Hvan，SchoonhovenLM，F(xiàn)uchsA(1996)Chemisch-ecologischefloravanNederlandenEeninleidingoveraardenecologischebetekenisvansecundaireplantenstoffen，HvanGenderen，LMSchoonhoven，AFuchs，eds.KNNVUitgeverij，Utrecht，298ppGriecoPA，NishazawaM(1977)Totalsynthesisof(+)-costunolide.JOrgChem421717-1720HalkierBA(1996)Catalyticreactivitiesandstructure/functionrelationshipsofcytochromeP450enzymes.Phytochemistry341-21HarborneJB，BaxterH，MossGP(1999)PhytochemicalDictionary.Ahandbookofbioactivecompoundsfromplants，2ndedition.Taylor&FrancisHashimIB，KoehlerPE，KvienCK(1993)Fattyacidcomposition，mineralcontent，andflavorqualityofsouthernrunnerpeanutstreatedwithherbicidesandfungicides.PeanutSci20106-111HeinsmanNWTJ(2000)Lipase-catalyzedkineticresolutionofbrachedchainfattyacidsandtheiresters.PhDthesis，WageningenUnivesrsityHeinsmanNEJT，F(xiàn)ranssenMCR，vanderPadtA，BoomRM，van′tRietK，deGrootAeLipase-mediatedresolutionofbranchedchainfattyacids.Biocatal.Biotransform.，submittedHerzW(1977)Sesquiterpenelactonesinthecompositae.InVHHeywood，JBHarborne，BLTurner，eds，TheBiologyandChemistryoftheCompositae.AcademicPress，London，pp337-357HoC，ChoiEJ，YooGS，KimKM，RyuSY(1998)Desacetylmatricin，ananti-allergiccomponentfromTaraxacumplatycarpum.PlantaMed64577-578HollandHL(1992)OrganicSynthesiswithEnzymes.VCHPublishers，NewYork，pp29-31HunterGLK，BrogdenWBJr(1965)Conversionofvalencenetonootkatone.JFoodSci30876-878JainTC，BanksCM，McCloskeyJE(1970)Dehydrosaussurealactoneandreversibilityinthegermacranolide-copereaction.TetrahedronLett11841-844JerussiAR(1970)Selectiveoxidationswithseleniumdioxide.InSelectiveOrganicTransformations.Wiley-Interscience，p.301-313.KarpF，MihaliakCA，HarrisJL，CroteauR(1990)Monoterpenebiosynthesisspecificityofthehydroxylationsof(-)-limonenebyenzymepreparationsfrompeppermint(Menthapiperita)，spearmint(Menthaspicata)andperilla(Perillafrutescens)leaves.ArchBiochemBiophys276219-226KesselmansRPW(1992)Totalsynthesisofallstereoisomersofeudesm-11-en-14-ol.PhDthesis，WageningenUniversityKnstWMB，vanderLindeLM，WitteveenJG(1975)Recentdevelopmentsinthechemistyoferemophilanes.InternationalFlavoursandFoodAdditives6121-125KupchanSM，F(xiàn)esslerDC，EakinMA，GiacobbeTJ(1970)Reactionsofalphamethylenelactonetumorinhibitorswithmodelbiologicalnucleophils.Science168376-377LamareV，F(xiàn)urstossR(1990)Bioconversionofsesquiterpenes.Tetrahedron464109-4132MarchJ(2001)AdvancedOrganicChemistryreactions，mechanismsandstructure.5thed，Wiley-Interscience，NewYork，NY，2083pagesMartínezM，A，Joseph-NathanP(1988).Conformationalanalysisofachillinandleukodin.JNatProd51221-228MathewsCK，VanHoldeKE(1996)Biochemistry.2nded，OregonStateUniversity，TheBenjamin/CummingsPublishingCompanyMaurerB，GriederA(1977)Sesquiterpenoidsfromcostusrootoil(SaussurealappaClarke).HelvChimActa602177-2190MeijerAH(1993)CytochromeP-450andsecondarymetabolisminCatharanthusroseus.Ph.D.thesis，LeidenUniversityMihaliakCA，KarpF，Croteau(1993)CytochromeP-450terpenehydroxylases.InP.J.Leaed，MethodsinPlantBiochemistry，EnzymesofSecondaryMetabolism，Vol9.AcademicPress，Londen，pp261-279Minnaard(1997)Germacrenesesquiterpenessynthesisandroleinbiosynthesis.PhDthesis.WageningenUniversity.MiyazawaM，HonjoY，KameokaH(1998)Bioatransforamtionofthesesquiterpenoid(+)-γ-gurjuneneusingaplantpathogenicfungusGlomerellacingulata，asabiocatalyst.Phytochemstry491283-1285OvertonKH，RobertsFM(1974)Interconversionoftrans，transandcis，transfarnesolbyenzymesfromAndographis.Phytochemistry1395-101PaulA，BawdekarAS，JoshiRS，SomesekarRoaA，KelkarGR，BhattacharyyaSC(1960)TerpenoidsXXexaminationofcostusrootoil.PerfandEssOilRec15115-120PesaroM，BozzatoG，SchudelP(1968)Thetotalsynthesisofracemicnootkatone.ChemCommun1152-1154PetersenM，SeitzHU(1988)ReconstitutionofcytochromeP-450-dependentdigitoxin12β-hydroxylasefromcellculturesoffoxglove(DigitalislanataEHRH.).BiochemJ252537-543PetersenM，AlfermannAW，ReinhardE，SeitzHU(1987)Immobilizationofdigitoxin12β-hydroxylase，acytochromeP-45-dependentenzymefromcellculturesofDigitalislanataEHRH.PlantCellRep6200-203etitF，F(xiàn)urstossR(1995)Synthesisof(1S，5R)-2，8-dioxabicyclo[3.3.0]octan-3-onefromitsenantiomerasubunitofclerodanederivatives.Synthesis1517-1520PicmanAK(1986)Reviewartilenumber7biologicalactivitiesofsesquiterpenelactones.BiochemSystEcol14255-281PietDP，F(xiàn)ranssenMCR，deGrootAe(1996)Biotransformationofallylicallyactivated(E，E)-cyclodeca-1，6-dienolsbyCichoriumintybus.Tetrahedron5211273-11280PietDP，SchrijversR，F(xiàn)ranssenMCR，deGrootAe(1995)BiotransformationofgermacreneepoxidesbyCichoriumintybusL.Tetrahedron516303-6314PriceKR，DuPontMS，ShepherdR，ChanHW-S，F(xiàn)enwickGR(1990)Relationshipbetweenthechemicalandsensorypropertiesofexoticsaladcrops-coloredlettuce(Lactucasativa)andchicory(Cichoriumintybus).JSciFoodAgric53185-192PyrekJST(1985)SesquiterpenelactonesofCichoriumintybusandLeontodonautumnalis.Phytochemistry24186-188ReichardtPB，AndersonBJ，ClausenTP，HoskinsLC(1988)Thermalinstabilityofgermacroneimplicationsforgaschromatographicanalysisofthermallyunstableanalytes.CanJChem671174-1177RissomS，Schwarz-LinekU，VogelM，TishkovVI，KraglU(1997)Synthesisofchiralε-lactonesinatwo-enzymesystemofcyclohexanonemono-oxygenaseandformatedehydrogenasewithintegratedbubble-freeaeration.TetrahedronAsymmetry82523-2526SannaiA，F(xiàn)ujimoriT，KatoK(1982)Studiesonflavorcomponentsofroastedchicoryroot.AgricBiolChem46429-433SchulerMA(1996)PlantcytochromeP450monooxygenases.CritRevPlantSci15235-284SeamanFC(1982)SesquiterpenelactonesastaxonomiccharactersintheAsteraceae.BotRev48124-145SeelbachK，RiebelB，HummelW，KulaMR，TishkovVI，EgorovAM，WandreyC，KraglU(1996)ANovel，EfficientRegeneratingMethodofNADPHUsingaNewFormateDehydrogenase.TetrahedronLett371377-1380SeiglerDS(1995)PlantSecondaryMetabolism.KluwerAcademicPublishers，Boston/Dordrecht/London，759ppSetoM，MiyaseT，UmeharaK，UenoA，HiranoY，OtaniN(1988)SesquiterpenelactonesfromCichoriumendiviaLandC.intybusLandcytotoxicactivity.ChemPharmBull362423-2429ShojiN，UmeyamaA，AsakawaY，TakemotoT，NomotoK，OhizumiY(1984)Structuraldeterminationofnootkatol，anewsesquiterpeneisolatedfromAlpinaoxyphyllaMiquelpossessingcalcium-antagonisticactivity.JPharmSc73843-844SomasekarRoaA，KelkarGR，BhattacharyyaSC(1960)Terpenoids-XXIthestructureofcostunolide，anewsesquiterpenelactonefromcostusrootoil.Tetrahedron9275-283SongQ，Gomez-BarriosML，HopperEL，HjortsoMA，F(xiàn)ischerNH(1995)BiosyntheticstudiesoflactucinderivativesinhairyrootculturesofLactucafloridana.Phytochemistry401659-1665Suga，T.andHirata，T.(1990)Biotransformationofexogenoussubstratesbyplantcellcultures.Phytochemistry292393-2406.TakasugiM，OkinakaS，KatsuiN，MasamuneT，ShirataA，OhuchiM(1985)IsolationandstructureoflettucininA，anovelguaianolidephytoalexinfromLactucasativavar.capitata(Compositae).JChemSocChemCommun621-622Takeda，K(1974)StereospecificCoperearrangementofthegermacrene-typesesquiterpenes.Tetrahedron301525-1534TeisseirePJ(1994)ChemistryofFragrantSubstances.VCHPublishersInc.，NewYork，pp193-289UmbreitMA.SharplessKB(1977)Allylicoxidationofolefinsbycatalyticandstoichiometricseleniumdioxidewithtert-butylhydroperoxide.JAmChemSoc995526-5528vanBeekTA，MaasP，KingBM，LeclercqE，VoragenAGJ，deGrootAe(1990)Bittersesquiterpenelactonesfromchicoryroots.JAgricFoodChem381035-1038VogelG，HartmanHD，KrahnstverK(1994)HandbuchdesspeziellenGemüsebaues.Ulmer，Stuttgart，pp84-144WallaartTE，BouwmeesterHJ，HilleJ，PoppingaL，MaijersNCA(2001)Amorpha-4，11-dienesynthasecloningandfunctionalexpressionofakeyenzymeinthebiosyntheticpathwayofthenovelantimalarialdrugartemisinin.Planta212460-465.WaltonNJ，BrownDE(1999)eds，Chemicalsfromplantsperspectivesonplantsecondarymetabolism.WorldScientificPublishers，Singapore，425pagesWeedaEJ，WestraR，WestraCH，WestraC(1991)Nederlandseoecologischeflorawildeplantenenhunrelaties4.IVN，Amsterdam，pp152-154WestCA(1980)Hydroxylases，monooxygenases，andcytochromeP-450.InDDDavis，ed，TheBiochemistryofPlants，Vol2.AcademicPress，Londen，pp317-342WestS(1996)Flavourproductionwithenzymes.InIndustrialEnzymology，GodfreyTandWestS，eds，2nded，MacmillanPressLtd，London，UK，p.209-225.WilsonCWIII，ShawPE(1978)Syntheaisofnootkatonefromvalencene.JAgricFoodChem261430-1432YamaharaJ，HaoY，TamaiY(1990)Anti-ulcereffectinratsofbittercardamomconstituents.ChemPharmBull383053-305權利要求1.轉化底物并產生轉化產物的方法，所述方法包括將所述底物經來源于含有倍半萜的物種或生物的酶處理。2.權利要求1的轉化底物并產生轉化產物的方法，所述方法包括將所述底物經來源于含有倍半萜的植物物種的酶處理。3.權利要求2的轉化底物并產生轉化產物的方法，所述方法包括將所述底物經來源于含有倍半萜內酯的植物物種的酶處理。4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述物種不是柑橘類物種。5.權利要求1-4任一項的轉化底物并產生轉化產物的方法，所述方法包括將所述底物經來源于菊科物種的酶處理。6.權利要求5的方法，其中所述菊科物種是Cichoriumsp.。7.權利要求5的方法，其中所述菊科物種是Lactucaspp.。8.權利要求1-7的方法，其中所述轉化產物是醇、醛/酮或羧酸。9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述底物是萜烯。10.權利要求9的方法，其中所述萜烯是倍半萜。11.權利要求9的方法，其中所述萜烯是朱欒倍半萜。12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述轉化產物是諾卡酮。13.權利要求1-12任一項的方法，其中所述酶是細胞色素P450單加氧酶。14.權利要求13的方法，其中所述酶是倍半萜C12-羥化酶。15.權利要求13的方法，其中所述酶是大根香葉烯A羥化酶。16.權利要求13的方法，其中所述酶是倍半萜烯化合物C2羥化酶。17.權利要求13的方法，其中所述酶是(+)-木香烴內酯C2羥化酶。18.權利要求13的方法，其中所述酶是脫氫酶。19.權利要求13的方法，其中所述酶是倍半萜醇或醛脫氫酶。20.權利要求1-19任一項的方法，其中所述酶來源于所述物種的提取物。21.權利要求1-19任一項的方法，其中所述酶存在于所述物種的細胞培養(yǎng)物中。22.權利要求1-19任一項的方法，其中所述酶存在于所述物種的器官培養(yǎng)物中。23.權利要求22的方法，其中所述器官培養(yǎng)物是發(fā)根培養(yǎng)物。24.權利要求1-23任一項的方法，其中所述酶是重組酶。25.權利要求24的方法，其中所述酶來源于轉基因植物。26.權利要求1-24任一項的方法，其中所述酶來源于微生物。27.權利要求1-26任一項的方法，其用于生產調味品、香料、藥物或殺生物化合物。28.可由權利要求27的方法獲得的調味品、香料、藥物或殺生物化合物。29.來源于含有倍半萜的物種或生物的分離或純化的酶。30.權利要求29的酶，其來源于含有倍半萜的植物物種。31.權利要求30的酶，其來源于含有倍半萜內酯的植物物種。32.權利要求29-31任一項的酶，其中所述物種不是柑橘類物種。33.權利要求32的酶，其來源于菊科物種。34.權利要求33的酶，其中所述菊科物種是Cichoriumsp.。35.權利要求33的酶，其中所述菊科物種是Lactucaspp.。36.編碼權利要求29-35任一項的酶的分離和/或重組的核酸。37.包含權利要求36的核酸的宿主細胞。全文摘要本發(fā)明提供來源于植物的酶在生物催化中的用途。將氧基團區(qū)域選擇性及立體選擇性導入未活化的有機化合物中對有機化學家而言仍在很大程度上是未解決的問題(Faber，2000)。我們已經證明，菊科物種的酶能夠高區(qū)域選擇性及立體選擇性地將例如倍半萜鏈烯轉化為有商業(yè)價值的產品。文檔編號C12N9/00GK1589327SQ02822822公開日2005年3月2日申請日期2002年9月17日優(yōu)先權日2001年9月17日發(fā)明者亨德里克·揚·鮑梅斯特,揚－威廉·德克拉克爾,馬爾勒斯·舒林克,拉烏爾·約翰·比諾,阿埃德·德赫羅特,莫里斯·查爾斯·勒內·弗蘭森申請人:植物研究國際公司