專利名稱：抗腫瘤化合物及其制備方法和制藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類源于真菌的具有抗腫瘤活性的醌類化合物及其制備方法，以及它們在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
自從1929年弗萊明從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐富來源，絕大多數(shù)臨床應(yīng)用的抗生素都來源于真菌和細(xì)菌，真菌的代謝產(chǎn)物還有其他的藥用價(jià)值，如抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調(diào)節(jié)劑，酶抑制劑等。由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋真菌能提供陸生真菌無法提供的代謝產(chǎn)物。國際上已從海洋真菌中發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化合物，分別具有抗菌，抗病毒，抗腫瘤和神經(jīng)心血管方面的活性。例如從Acremonium ehrysogenum產(chǎn)生的頭孢菌素，已發(fā)展為一大類半合成抗生素的先導(dǎo)，廣泛應(yīng)用于臨床，還有其他的一些例子見Kerstin Liberra的文章《Marine fungi a profileresource of biologically active natural products？》[Pharmazie 50(1995)，H.9583]，國際上這方面的研究從八十年代以來呈加速發(fā)展的趨勢。
植物內(nèi)源性真菌(Endophytic fungus)生活在高等植物的組織中，對于內(nèi)源性真菌的次級代謝物的研究還較為缺乏，據(jù)保守的估計(jì)內(nèi)源性真菌的種類繁多，大約有1.5×106種，由于數(shù)量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態(tài)關(guān)系，使這類真菌成為潛在的具有產(chǎn)生豐富的次級代謝物的來源。目前對生長于海洋環(huán)境的內(nèi)源性真菌的次級代謝物的研究還未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一類新的來源于海洋真菌的具有潛在藥用價(jià)值的化合物及其提取分離方法，以及它們在制備抗腫瘤藥物中的用途。
發(fā)明人由南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下簡稱真菌1403)的發(fā)酵培養(yǎng)物中提取分離得到3種結(jié)構(gòu)相似的化合物，該3種化合物的結(jié)構(gòu)分別如下列式A、式B和式C所示(以下分別簡稱為化合物A、B和C) 本發(fā)明所用的的真菌1403已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號為CCTCC NOM201018，保藏日為2001年4月23日。
本發(fā)明化合物A、B和C可從真菌1403的發(fā)酵培養(yǎng)液中提取分離而得到，制備方法的具體步驟如下a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(按重量比)為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯化鈉3-5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養(yǎng)5-7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量比)為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化鈉3-5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1-2個(gè)月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝1％-100％為洗脫劑梯度洗脫；e.收集30％-90％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，濃縮得紅色針狀結(jié)晶，即為A、B、C混合物；再經(jīng)聚酰胺柱層析多次分離，即可分開化合物A、B與C。
本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明，化合物A、B與C均能有效抑制腫瘤細(xì)胞株的生長，在以大腸癌細(xì)胞株(LOVO)為靶細(xì)胞的MTT還原法檢測抗腫瘤活性試驗(yàn)中，化合物A、B、C的半數(shù)致死量IC50均低于10μg/ml。所以，化合物A、B或/和C可用于制備抗腫瘤藥物。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
化合物A的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；R5 FABMS305(M+1)，m/z69，1HNMR(500Mz，CDCl3，TMS)12.603(s，)，7.62，7.356(s，H-9)，6.106(s，H-1)，3.914(s，OCH3-16)，3.821(t，5.5，5.5Hz，H-7)，3.083(d，17Hz，H-8a)，2.985(dd，18.5，5Hz，H-5a)，2.920(dd，18.5，5.5Hz，H-5b)，2.786(d，17Hz，H-8b)，1.255(s，CH3-15)，13CNMR(CDCl3)189.775(C-4)，178.557(C-3)，160.238(C-2)，158.612(C-14)，142.888(C-10)，130.891(C-12)，127.442(C-11)，119.267(C-9)，110.324(C-13)，108.591(C-1)，70.649(C-7)，69.551(C-6)，55.808(C-16)，40.358(C-5)，29.091(C-8)，23.981(C-15).IR v/cm-1(KBr)3500.8，3369.1，3031.0，2979.0，2924.9，2853.9，1717.0，1674.6，1618.6，1597.2，1511.9，1479.8，1455.5，1415.6，1370.2，1344.2，321.1，1277，1236.3，1104.1，1076.0，1045.9，985.1，933.7，856.7，818.8，795.2，629.6，456.7。元素分析(w/％，C16H16O6)C63.54(63.15)，H6.208(5.26).
化合物B的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；R9 FABMS285(M+1)，m/z105，1HNMR(500Mz，CDCl3，TMS)13.587(s，OH-4)，13.469(s，OH-1，8.233(d，8Hz，H-8)，8.145(s，H-5)，6.706(s，H-3)，4.011(s，CH3-16)，2.554(s，CH3-15).13CNMR(CDCl3)187.656(C-10)，184.669(C-9)，160.638(C-4)，157.464(C-2)，150.168(C-4)，145.126(C-6)，135.509(C-7)，133.221(C-11)，131.802(C-12)，127.304(C-5)，127.055(C-8)，112.684(C-14)，106.890(C-3)，106.163(C-13)，56.637(C-16)，21.936(C-15).IR v/cm-1(KBr)2921.3，2852.4，2666，1708，1593，1464.7，1421，1409，1371，1275.9，1206，1118，959，821，723.8.元素分析(w/％，C16H12O5)C(67.60)，H(4.23).
化合物C的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；R6 FABMS337(M+1)，m/z55，1HNMR(500Mz，CDCl3，TMS)13.345(s，OH-9)，12.615(s，OH-10)，6.457(s，H-3)，4.773(t，4.5，4.5Hz，H-7，OH)，3.917(s，CH3-16)，3.538(t，4.5，4.5Hz，H-5)，2.74(d，18Hz，H-8a)，2.67(d，18Hz，H-8b)，1.235(s，CH3-15).13CNMR(CDCl3)183.290(C-4)，176.456(C-1)，160.869(C-10)，160.869(C-2)，160.225(C-9)，139.469(C-11)，136.818(C-12)，109.770(C-14)，109.631(C-3)，107.315(C-13)，76.307(C-7)，69.195(C-6)，68.238(C-5)，56.751(C-16)，34.764(C-8)，25.460(C-15).IR v/cm-1(KBr)3514，3479，3374，3029，2987，2938，2896，1595，1475，1440，1398，1370，1300，1200，1208，1138，1082，997，948，864，821，632，554，491.元素分析(w/％，C16H16Oa)C56.56(57.14)，H4.617(4.76).θmp232℃。
1.2 MTT裂解液的配制80g的十二烷基磺酸鈉(SDS，華美生物工程公司)溶解在200ml的N-N-二甲基甲酰胺(北京化工廠)中，水浴加熱助溶，加入200ml蒸餾水，用80％乙酸與1N鹽酸(1∶1)混合調(diào)pH至4.7。
1.3 靶細(xì)胞的制備LOVO細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)a.從液氮罐中取出大腸癌細(xì)胞株LOVO細(xì)胞的凍存管，迅速置入37℃水浴中，不停搖動使之迅速溶化，無菌操作移入離心管中；b.加全培養(yǎng)液至10ml，1000rpm離心5s，棄上清；c.重復(fù)以上操作一次；d.以全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5％CO2，37℃培養(yǎng)；e.觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液，分瓶。
1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)、96孔板準(zhǔn)備a.選取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，全培養(yǎng)終止，移入離心管中，加全培至10ml；b.取一滴滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，顯微鏡下計(jì)數(shù)四大格的細(xì)胞總數(shù)、除以4，乘104，即為每毫升培養(yǎng)液所含細(xì)胞數(shù)；c.調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105ml；d.96孔板置超鏡臺內(nèi)在紫外線下照射4hr，距離30cm以內(nèi)。
1.5 化合物A、B與C的配制分別取一定量的化合物A、B、C加入到全培中，調(diào)整濃度為500μg/ml，超聲乳化，過濾除菌，4℃保存。
2 試驗(yàn)方法a.96孔板各孔加入LOVO細(xì)胞180μl(1×105/ml)，5％CO2、37℃培養(yǎng)4hr。
b.加入不同濃度受試對象，對照加全培2μl，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。
c.每孔去除培養(yǎng)液100μl，加入MTT(5mg/ml)各10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4hr。
d.每孔加入MTT裂解液100μl，輕輕振蕩5-10min，使顆粒溶解，過夜。
e.酶聯(lián)免疫儀570nm下測定各孔OD值。
f.計(jì)算抑制率腫瘤細(xì)胞殺傷率％＝(對照組測定的平均OD值-加藥組測定的平均OD值)/對照組測定的平均OD值×100％g.以抑制率對藥物濃度的對數(shù)作圖，求得IC50值以lgc為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，求得IC50值3.試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果顯示化合物A、B、C均能有效抑制LOVO細(xì)胞株生長，其中A、B、C的IC50值均低于10μg/ml。
權(quán)利要求
1.下述結(jié)構(gòu)式A、B、C的化合物
2.權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯化鈉3-5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養(yǎng)5-7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化鈉3-5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1-2個(gè)月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝1％-100％為洗脫劑梯度洗脫；e.收集30％-90％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，濃縮得紅色針狀結(jié)晶，即為A、B、C混合物；再經(jīng)聚酰胺柱層析多次分離，即可分開A、B與C。
3.權(quán)利要求1所述的式A、式B或/和式C化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及式A、式B和式C化合物及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12P7/24GK1347865SQ01127630
公開日2002年5月8日 申請日期2001年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月12日
發(fā)明者林永成, 姜廣策, 吳雄宇, 周世寧, 張積仁, 關(guān)利平, 鐘斯(E.B.G.Jones) 申請人:中山大學(xué)