一種細胞保存液及其用途和保存細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種細胞保存液及其用途，另外提供一種細胞保存方法。本發(fā)明的細胞保存液以0.5g/ml至1.5g/ml的氯化鈉水溶液為主要成分，其中還包含在細胞保存條件下存在的負氫離子類物質(zhì)。本發(fā)明的效果在于能夠使細胞例如干細胞在運輸?shù)冗^程中長期保持高活性率，減少細胞聚集。
【專利說明】
-種細胞保存液及其用途和保存細胞的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種保存細胞的技術，特別地涉及一種細胞保存液及其用途和保存細 胞的方法，該技術能夠使細胞在運輸?shù)冗^程中長期保持高活性率，減少細胞聚團。
【背景技術】
[0002] 各種類型的細胞，特別是干細胞在生命科學研究、藥物篩選測試、組織器官修復研 究等各領域中具有極其重要的用途。例如，間充質(zhì)干細胞（MSC，Mesenchymal stem Cell) 因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復制等特點而日益 受到人們的關注。
[0003] 然而，目前送些細胞，特別是干細胞，例如間充質(zhì)干細胞在科研、工業(yè)和臨床上的 應用還存在一些問題，如運輸不便、臨時儲存不便，運輸過程中細胞活性下降快，細胞容易 積聚成團等。干細胞在運輸過程中需要保持良好活性，并可直接回輸給患者，因此干細胞保 存液需要既能保護細胞活性，又能安全的用于人體靜脈回輸?，F(xiàn)有的干細胞保存液W 0.9% 氯化鋼注射液為主，另外改進的還有葡萄糖氯化鋼注射液等，送些保護液對人體靜脈回輸 是安全的，但細胞經(jīng)長時間運輸后細胞活率很低，干細胞大量死亡，直接影響臨床效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明要解決的問顫
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種細胞保存液及其用途和保存細胞的方法，W便解決現(xiàn) 有技術中存在的細胞經(jīng)長時間運輸后細胞活率低、大量死亡等技術問題。防止在運輸過程 中因溫度、pH、震蕩等因素，細胞活性及活率將會下降。
[0006] 巧于解決問顫的方案
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)：當在包含0. 5g/ml至1. 5g/ml的氯 化鋼水溶液中含有負氨離子類物質(zhì)時，能夠使細胞，特別是干細胞在運輸過程中保持高存 活率，減少細胞聚團。從而完成了本發(fā)明。
[000引具體地，本發(fā)明的一方面，提供一種細胞保存液，其包含0. 5g/ml至1. 5g/ml的氯 化鋼水溶液，另外還含有負氨離子類物質(zhì)。
[0009] 優(yōu)選地，細胞保存液進一步包含待保存的細胞。
[0010] 在優(yōu)選實施方案中，氯化鋼水溶液的濃度為0. 9g/ml。
[0011] 在另外的優(yōu)選實施方案中，負氨離子類物質(zhì)的濃度為2(K)ppb H-至6(K)ppb H-之 間。
[001引在進一步優(yōu)選的實施方案中，細胞保存液中細胞的濃度為2.0Xl05/ml至 2. 0X10*Vml 之間。
[0013] 在此外的優(yōu)選實施方案中，細胞保存液中的細胞選自間充質(zhì)干細胞、單個核細胞、 樹突狀細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞、造血干細胞、肝干細胞和脂肪干細胞組成的組中的 至少之一。特別優(yōu)選選自間充質(zhì)干細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞組成的組中的至少之 ο
[0014] 本發(fā)明的另一方面提供一種保存細胞的方法，其中使用本發(fā)明所述的細胞保存 液。
[0015] 本發(fā)明的其它方面提供細胞保存液在保存細胞中的用途。
[0016] 發(fā)明的效果
[0017] 本發(fā)明的細胞保存液能使細胞，例如人間充質(zhì)干細胞在運輸過程中保持高存活 率，有效清除自由基，減少了細胞之間及細胞與容器之間的黏附，減少臨床輸注人間充質(zhì)干 細胞時血管內(nèi)出現(xiàn)細胞團栓塞的可能性。本發(fā)明的細胞保存液可使細胞，例如人間充質(zhì)干 細胞在4°C~1(TC時在24小時內(nèi)保持高活性及減少細胞聚團，本細胞保存液將有效擴大干 細胞配送區(qū)域范圍，增加臨床使用人間充質(zhì)干細胞的范圍，所用的成分為符合臨床使用的 成分，可滿足臨床使用人間充質(zhì)干細胞及細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK)的需求。
【附圖說明】
[0018] 圖1為人為設定判斷MSC聚集情況的標準，根據(jù)聚集程度的輕重分為四級；-、+、 ++Λ +++〇
[0019] 圖2為間充質(zhì)干細跑的免疫表型分析的流式結果。
[0020] 圖3為CIK細跑的免疫表型分析的流式結果。
[0021] 圖4間充質(zhì)干細胞活性在不同保存液中細胞活性隨時間的變化情況。
[0022] 圖5MSC細胞在不同保存液中其數(shù)量隨時間的變化。
[002引圖6MSC細胞在不同保存液中其活性隨時間的變化。
[0024] 圖7CIK細胞在不同保存液中細胞數(shù)量隨時間的變化。
[0025] 圖8CIK細胞在不同保存液中細胞活性隨時間的變化。
【具體實施方式】
[0026] 本申請中所述的細胞保存液W氯化鋼水溶液為主要成分，同時在氯化鋼水溶液中 含有負氨離子類物質(zhì)。關于本發(fā)明的細胞保存液能夠使細胞，特別是干細胞在運輸過程中 保持高存活率，減少細胞聚團的原因，發(fā)明人認為可能在于負氨離子類物質(zhì)有超強抗氧化 能力，能有效清除細胞內(nèi)的自由基，從而能長時間保持細胞的高存活率，降低細胞功能衰 竭，防止細胞聚團。
[0027] 具體地，本發(fā)明的細胞保存液能夠長時間保持細胞高存活率的原因可能在于，在 細胞內(nèi)有多種產(chǎn)生自由基的途徑。線粒體是內(nèi)源產(chǎn)生自由基的主要場所，是自由基濃度最 高的細胞器，例如，在線粒體氧化磯酸化生成ATP的過程中，大約有1 %~4%的氧轉(zhuǎn)化為 活性氧（reactive 0巧gen species R0巧。自由基，特別是郝些游離存在的自由基，因含有 1個或1個W上不配對電子的分子、離子、原子或原子團，在細胞內(nèi)有很強的氧化反應能力， 易對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等產(chǎn)生傷害，從而引起細胞及機體的損傷。
[0028] 例如，生物膜易受自由基攻擊而發(fā)生過氧化連鎖反應，從而造成生物膜的脂質(zhì)過 氧化損傷。氧自由基是機體內(nèi)的主要自由基，其可引起肝細胞膜、線粒體膜、微粒體膜和溶 酶體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生LP0及其降解產(chǎn)物（醒類及姪類）可加重生物膜的損傷，破壞 膜的穩(wěn)定性和完整性，使其通透性增加，最終導致肝細胞的壞死。此外，紅細胞膜發(fā)生脂質(zhì) 過氧化損傷后，通透性增加，細胞變脆，易發(fā)生溶血；當有化2\化+等存在時，線粒體膜在其 作用下，鄰近的&化會分解為0H，使膜腫脹甚至消失。
[0029] 本發(fā)明的細胞保存液中除了包含能夠使細胞保持最佳狀態(tài)的氯化鋼水溶 液外，還含有負氨離子類物質(zhì)，其激活細胞內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)，例如大分子酶促自 由基清除系統(tǒng)，例如包含SOD、過氧化氨酶（catalase, CAT)、谷光甘膚過氧化物酶 (glutathioneperoxides，GSH-Px)等的自由基清除系統(tǒng)。另外，負氨離子類物質(zhì)本身在細 胞內(nèi)還可能具有與小分子抗氧化劑等非酶類清除劑相似的功能，送些小分子抗氧化劑包括 維生素 A和E、抗壞血酸、目-胡蘿h素、尿酸、次氯酸、微量元素化、Se、Mn、化、化等。當脂 質(zhì)過氧化反應鏈遇到S0D，維生素 A、E等抗氧化物后就會終止，從而能夠?qū)崿F(xiàn)長時間保持細 胞活性，防止其功能下降的目的。
[0030] 如本文中所使用的術語"氯化鋼水溶液"，是指氯化鋼在去離子水中溶解后得到的 水溶液。本發(fā)明中可使用任何濃度的氯化鋼水溶液，只要能夠保持細胞的所需的活性或功 能即可。優(yōu)選地，所述濃度可為0. 5g/ml至1. 5g/ml，優(yōu)選0. 6g/ml至1. Og/ml，從保持細 胞與周圍環(huán)境等滲性的觀點，在人細胞的情況下特別優(yōu)選氯化鋼水溶液的濃度為0. 9g/ml。 本文中，本領域內(nèi)已知氯化鋼的濃度單位g/ml也可表示為％，在本文中兩種單位可互換使 用，而沒有任何區(qū)別。另外，需要說明的是0. 9g/ml氯化鋼水溶液在本領域內(nèi)通常還稱作生 理鹽水。
[0031] 如本文中所使用的術語"負氨離子類物質(zhì)"，是指負氨離子W及能夠在細胞保存條 件下，例如0至4°C溫度下產(chǎn)生負氨離子的任何物質(zhì)。負氨離子也可表示為H-，是指形成帶 一個單位負電荷的陰離子氨，也稱為氨負離子或氨化物離子。本發(fā)明可使用任何形式的負 氨離子類物質(zhì)，例如商購可得的含有負氨離子類物質(zhì)的水溶液或通過已知設備例如中國專 利申請?zhí)枮镃N201320780513. X中所述的裝置，依據(jù)其說明書制備的負氨離子類物質(zhì)。
[0032] 另外，本發(fā)明的細胞保存液中負氨離子的濃度沒有任何限定，然而，從細胞保存效 果方面考慮，優(yōu)選lOOppb H-至lOOOppb H-，特別優(yōu)選150ppb H-至SOOppb H-，最優(yōu)選 2(K)ppb H-至6(K)ppb H-。本發(fā)明中的負氨離子的濃度可通過本領域內(nèi)公知的測量手段測 得。例如通過已知設備例如"便攜式溶存水素計"（一夕溶存水素計化NH-1000,根 據(jù)其說明書記載的標準操作步驟測得。
[0033] 如本文所使用的術語"細胞"，具有本領域內(nèi)公知的含義，包含任何類型或來源的 細胞。本文中優(yōu)選動物細胞，例如，鳥類細胞、哺乳動物細胞，特別優(yōu)選人細胞，特別優(yōu)選人 干細胞，例如，人間充質(zhì)干細胞、人單個核細胞、人樹突狀細胞、人細胞因子誘導的殺傷細 胞、人造血干細胞、人肝干細胞和人脂肪干細胞，最優(yōu)選人間充質(zhì)干細胞和細胞因子誘導的 殺傷細胞。另外，本發(fā)明的細胞可W是直接來源于組織、器官等的天然細胞，也可W是培養(yǎng) 細胞，例如，在培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細胞。此外，還可W是人工處理的細胞，例如雜交瘤細胞 等。
[0034] 如本文所使用的術語"細胞活性"是指細胞發(fā)揮其正常功能所需的性質(zhì)、性能等， 并且可通過測量或觀察而確定。本發(fā)明的細胞保存液中可使用上述細胞中的任一種或多種 的組合。
[0035] 另外，本發(fā)明的細胞保存液中的細胞濃度不特別限定，然而如果細胞濃度過低，貝U 會不利地影響保存效率，浪費保存液。另一方面，如果細胞濃度過高，則會可能會影響到細 胞的實際使用，在細胞使用時引起額外的操作步驟。從保存液中保存的細胞直接使用，例 女口，直接輸回體內(nèi)，例如活體內(nèi)的觀點，所述細胞濃度可為1. 0 X l〇3/ml至1. 0 X 1〇1%1， 優(yōu)選1. 0X l〇4/ml至1. 0X lOVml，在直接輸回人體的情況下，特別優(yōu)選1. 0X l〇5/ml至 1. 0 X lOVml，最優(yōu)選2. 0 X lOVml至2. 0 X lOVml。關于細胞濃度單位，除非另有說明，則否 指個/ml。例如1.0Xl〇3時，指每ml液體中細胞的個數(shù)為1.0Xl〇3個。
[0036] 關于細胞濃度的測定方法，可使用例如Countess自動細胞計數(shù)儀通過臺盼藍對 死細胞進行染色，結合圖像分析技術，測量細胞存活率和細胞計數(shù)。具體操作可參見其使用 說明書，包括將細胞樣本與臺盼藍混合，滴加于Countess細胞計數(shù)板內(nèi)。相機將采集細胞 計數(shù)板上的細胞圖像，圖像分析軟件則自動對其進行分析，通過臺盼藍染料檢測細胞數(shù)量 和存活率。另外，本計數(shù)儀還可提供下列數(shù)據(jù)：活細胞濃度/mU死細胞濃度/1^，總的細胞 濃度/mU存活率（活細胞數(shù)與全部細胞數(shù)的百分比），平均直徑，細胞圖像圖示數(shù)據(jù)。
[0037] 下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳細說明，但不作為對本發(fā)明的 限制。另外，需要說明的是，除非另作說明，否則本文中使用的實驗材料、試劑、儀器、計數(shù)方 法等一般方法均在本領域內(nèi)通常使用的手段。
[003引實驗例1本發(fā)明的細胞保存液的配制 [00測試驗步驟
[0040] 1. 0. 9 %含負Η離子生理鹽水配制；無菌環(huán)境下取100ml 3 %化C1，用適宜量負Η 離子水（本實驗室根據(jù)說明書中所述裝置自制）稀釋至0.9%，定容。
[0041] 2.將定容好的含負Η離子水進行革蘭氏檢測，內(nèi)毒素檢測，無菌、支原體檢測，確 認沒有內(nèi)毒素、無菌和支原體污染。
[0042] 實驗例2細胞保存液中負氨離子濃度的選擇化OOppb H-，400ppb H-，200ppb Η-)
[0043] 1.根據(jù)上述實驗例1中所述的方法，分別配制負氨離子濃度分別為6(K)ppb Η-， 400ppb H-，200ppb Η-的細胞保存液。
[0044] 2.MSC、CIK細胞的制備
[0045] 本實驗中使用的MSC、CIK(本實驗室由廝帶組織制備的間充質(zhì)干細胞、廝血來源 的細胞因子誘導的殺傷性T細胞）。另外，本文中PBS具有本領域內(nèi)的通常的含義，本實驗 例中 PBS 的組成優(yōu)選為 KC10. 2g/L ;皿2口〇4〇. 2g/L ;NaC18g/L ;胞2冊〇41. 15g/L ;化7. 2-7. 4 ; 滲透壓275+15。
[0046] 1)收集培養(yǎng)的MSCXIK細胞，調(diào)整細胞密度至IXlOVml。吸出培養(yǎng)液，往培養(yǎng)瓶 內(nèi)加入5ml PBS液，輕輕晃動，棄PBS。
[0047] 2)加入膜酶（邁晨科技，貨號；CC012)2ml，37°C 3min，或者室溫，顯微鏡觀察細胞 全部懸浮，加入F002(國產(chǎn)血清來自Solarbio,貨號；f8260,）0. 5ml，終止消化。
[0048] 3)吸取細胞懸液放入15ml離必管，加入7. 5ml PBS洗涂培養(yǎng)瓶，收集洗涂液至 15ml離必管中，離必1000;rpm5min。
[004引 4)離必后，棄上清，加入PBS液10ml，重懸細胞，1000巧m5min洗涂細胞。
[0050] 5)離必后，棄上清，加入PBS液10ml，重懸細胞，100化pm5min洗涂細胞。
[0051] 6)離必后，棄上清，加入PBS液10ml，重懸細胞吸取一滴細胞計數(shù)，離必1000巧m 5min洗涂細胞。
[0052] 7)棄PBS液，加入上述配制的負氨離子濃度為-600, -400, -200的細胞保存液，W 使MSC、CIK的細胞濃度和活性率相同。
[0053] 8)將上述制備的細胞置于4°C冷藏箱保存。分別在比、2}1、地、6}1、化后計數(shù)活細胞 的數(shù)量（Countes細胞計數(shù)儀，型號；C10281，測出細胞數(shù)量值），并檢測細胞活性（Countes 細胞計數(shù)儀，型號；C10281，測出細胞活性）。
[0054] 不同保存液中活細胞的變化情況如下表1所示。
[00巧]表1.負氨離子濃度的選擇
[0056]
[005引 表1 (續(xù)）
[0060]
[0061] 注；每次樣本的活性檢測都是取少量樣本在計數(shù)板上再上機檢測，檢測時只計算 該次樣本的活細胞濃度與總細胞濃度，再然后獲得細胞活性等數(shù)據(jù)，所W每次測量時都只 和該次樣本本身比較，得出相應數(shù)據(jù)。
[0062] 如表1所示，在負氨離子濃度為200ppb H-、400ppb H-和eOOppb H-的情況下，活 細胞的存活率W及細胞活性均表現(xiàn)良好。
[0063] 實驗例3本發(fā)明的細胞水溶液對不同濃度的廝帶間充質(zhì)干細胞及CIK細胞活性的 影響。
[0064] 選用負氨離子濃度為6(K)ppb H-的生理鹽水作為本實驗中使用的細胞保存液，并 選用不含負氨離子的生理鹽水作為對照，分析本發(fā)明的細胞保存液對不同細胞濃度的影 響。具體結果如下表2所示。
[0065] 表2.細胞保存液對不同細胞濃度的影響。
[0066]
[006引 表2 (續(xù)） [0070]
[0071] 如表2所示，細胞保存液無論是對不同濃度的CIK還是對不同濃度的MSC細胞均 顯示出優(yōu)異的存活率。而當與相同條件下但不含負氨離子的生理鹽水相比較時，本發(fā)明的 細胞保存液顯示出明顯更加優(yōu)異的存活率。
[0072] 實驗例4負氨離子生理鹽水對廝帶間充質(zhì)干細胞及CIK細胞聚集的影響。
[0073] 具體實驗步驟如下：
[0074] 1.含細胞的保存液的制備
[00巧]1)收集MSCXIK細胞，調(diào)整細胞密度至lOVml。吸出培養(yǎng)液，往培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5ml PBS液，輕輕晃動，棄PBS。
[0076] 2)加入膜酶（邁晨科技，貨號；CC012)2ml，37°C 3min，或者室溫，顯微鏡觀察細胞 全部懸浮，加入F002(Solarbio,貨號；f8260)0. 5ml，終止消化。
[0077] 3)吸取細胞懸液放入15ml離必管，加入7. 5ml PBS洗涂培養(yǎng)瓶，收集洗涂液至 15ml離必管中，離必lOOOrpm 5min〇
[0078] 4)離必后，棄上清，加入PBS液10ml，重懸細胞，100化pm 5min洗涂細胞。
[0079] 5)離必后，棄上清，加入PBS液10ml，重懸細胞，100化pm 5min洗涂細胞。
[0080] 6)離必后，棄上清，加入PBS液10ml，重懸細胞吸取一滴細胞計數(shù)，離必1000巧m 5min洗涂細胞。
[0081] 7)棄PBS液，根據(jù)所需細胞濃度加入適量實驗例1中制備的細胞保存液，PBS溶液 或0. 9 %生理鹽水，并輕輕混勻。
[0082] 2.細胞聚集情況的觀察
[0083] 將上述1中制備的細胞置于4°C冷藏箱保存。分別在比、211、地、6}1、化和12}1后觀 測細胞聚集情況。
[0084] 細胞聚集情況的分析基于W下標準，即當在放大X40倍的顯微鏡（奧林己斯，貨 號CKX-41)下觀察時，在10 μ mX 10 μ m視野中計數(shù)出現(xiàn)5個W上的細胞連接到一起的聚集 情況，其中：
[0085] 表示沒有觀察到細胞聚集成團。
[008引 +;表示觀察到1個W上至2個W下的細胞聚團。
[0087] ++;表示觀察到3個W上至5個W下的細胞聚集成團。
[0088] +++;表示觀察到大于5個細胞聚集成團。
[0089] 結果如下表3所示。
[0090] 表3.細胞聚集情況
[0091]
[0092] 由表3可W看出當使用不含負氨離子的生理鹽水時，隨著時間的推移，細胞出現(xiàn) 聚集情況，MSC細胞甚至當兩小時時開始出現(xiàn)較為嚴重的聚集。另一方面，在本發(fā)明的細胞 保存液的情況中，無論是CIK細胞還是MSC細胞甚至在12小時后也未出現(xiàn)細胞聚集現(xiàn)象。 上述結果表明，本發(fā)明的細胞保存液具有優(yōu)異的抑制細胞聚集的效果。
[0093] 實驗例5細胞表型流式分析
[0094] 為了分析本發(fā)明的細胞保存液對細胞功能的影響，本實驗采用表型流式分析來驗 證細胞特異性的標記，進而說明細胞是否具有良好的成熟度，是否可W發(fā)揮相關的功能。
[0095] 具體步驟如下：
[0096] 1.人廝帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及表型鑒定。
[0097] (1)在體外，將人廝帶用磯酸緩沖液（PB巧反復沖洗，去除殘留的血液，剪碎至約 1mm3的小塊，加入原料重量0. 1 %的膠原酶（sigma, USA)，37°C消化45分鐘；
[009引 似加入原料重量0. 125 %的膜酶（Sigma, USA) 37°C消化45分鐘，在消化過程中 用轉(zhuǎn)子攬拌，加入適量的血清終止膜酶的作用；
[009引 做消化液用篩網(wǎng)過濾，先后用100目及200目的濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織；
[0100] (4)將過濾后的消化液用磯酸緩沖液稀釋，消化液與磯酸緩沖液比例為1 : 10 ;
[0101] (5)離必，獲得細胞，離必機的轉(zhuǎn)速為1500rpm/min離必20min，獲得細胞；
[0102] (6)細胞按1~2Xl〇3cm2接種于培養(yǎng)瓶中，用含DMEM-LG/F12培養(yǎng)基（Sigma， 肥八)，5%胎牛血清（?！?)佑比(3〇6化，肥4)的培養(yǎng)基，置371：，5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4-5天 后換液，棄去非貼壁細胞，W后每3-4天半量換液。待細胞80 %融合，0. 25 %膜酶消化，按 1 : 3傳代。
[0103] (7)貼壁細胞常規(guī)消化后W FITC標記的CD14、CD34、CD44、CD45和HLA DR，陽標 記的〔019、〔090、〔073、〔0105，抗體及其相應同型對照標記細胞，流式細胞儀（。4〔4 0曰1比11' 型，USA)檢測。W上英光標記抗體均購自抓公司扣SA)。
[0104] 2.間充質(zhì)干細胞及CIK細胞在保存液中保存24小時后免疫表型分析。具體步驟 如下：
[0105] 1)每管加入一定量抗體（如抗體帶有英光標記，則需避光操作），對照管內(nèi)加同型 對照抗體。4°c，賠育30min，此步開始避光操作。
[0106] 2)每管加1血磯酸緩沖液（PB巧洗涂2遍，每次離必；100化pm, 5min。
[0107] 5)加流式固定液重懸細胞，200ul/管。4°C避光可W保存1周。
[010引 6)測試前轉(zhuǎn)移到流式檢測管內(nèi)（避光保存）。
[0109] 5)上機測樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）。
[0110] 6)報告結果。
[0111] 3.實驗結果：
[0112] 結果如圖3所示。廝帶間充質(zhì)干細胞的流式免疫表型檢測結果顯示；廝帶間充質(zhì) 干細胞高表達 CD90、CD44、CD73 和 CD105,不表達 CD14、D：M、CD：M、CD19 和 HLA-DR。而 CD90、 CD44、CD73和CD105表明細胞具有高的成熟度。
[0113] 另外，根據(jù)圖4也可明顯看出CIK細胞也具有高成熟度。
[0114] 實驗例6細胞保存液對細胞活性和活細胞保持率的影響
[0115] 為了分析本發(fā)明的細胞保存液對細胞活性和活細胞保持率的影響，而進行了本實 驗。
[0116] 實驗步驟：具體操作和實驗設計參見上述實驗例1-至3。實驗條件如圖4-8中的 表格所示。
[0117] 實驗結果：
[0118] 如圖4-8的所示。由圖4-8可W看出，本發(fā)明的細胞保存液與PBS或不含負氨離 子的生理鹽水相比均表現(xiàn)出顯著優(yōu)異的細胞活性和細胞存活率。
[0119] 實驗例7本發(fā)明的細胞保存液與其它保存液（PBS/生理鹽水等）的保存細胞的效 果比較
[0120] 具體操作步驟如實驗例1-3所示。
[0121] 具體實驗條件及實驗結果如下表4和5所示。
[0122] 表4.間充質(zhì)干細胞的活細胞數(shù)量隨時間的變化情況
[0123]
[0124] 表5. CIK細胞活細胞數(shù)量隨時間的變化情況
[0125]
[0126] 盡管參考其具體實施方案已詳細描述本發(fā)明，但是對于本領域熟練技術人員來 說，其中在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行各種改變和改進將是顯而易見的。
【主權項】
1. 一種細胞保存液，其包含0. 5g/ml至I. 5g/ml的氯化鈉水溶液，其特征在于還包含在 細胞保存條件下存在的負氫離子類物質(zhì)。2. 根據(jù)權利要求1所述的細胞保存液，其中所述細胞保存液進一步包含要保存的細 胞。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的細胞保存液，其中所述氯化鈉水溶液的濃度為0. 9g/ml。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的細胞保存液，其中所述負氫離子類物質(zhì)的濃度為200ppb H-至 600ppb H-之間。5. 根據(jù)權利要求2或3所述的細胞保存液，其中所述細胞保存液中細胞的濃度為 2. 0 X 105/ml 至 2. 0 X IOfVml 之間。6. 根據(jù)權利要求2或3所述的細胞保存液，其中所述細胞保存液中的細胞選自間充質(zhì) 干細胞、單個核細胞、樹突狀細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞、造血干細胞、肝干細胞和脂肪 干細胞組成的組中的至少之一。7. 根據(jù)權利要求2或3所述的細胞保存液，其中所述細胞保存液中的細胞選自間充質(zhì) 干細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞組成的組中的至少之一。8. -種保存細胞的方法，其中使用權利要求1至7中任一項所述的細胞保存液。9. 根據(jù)權利要求1至7任一項所述的細胞保存液在保存細胞中的用途。
【文檔編號】A01N1/02GK105875588SQ201410587471
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月29日
【發(fā)明人】王亞軍, 杜靜, 馮志磊, 吳瑜瑜, 田利明
【申請人】達國際生物科技(北京)有限公司, 一達國際生物科技(北京)有限公司