一種能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥 狀的接種鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥黑胚病是指小麥巧粒表面有不同形狀和程度的黑色、褐色等癥狀，該病不僅 降低小麥巧粒的外觀品質(zhì)，使小麥在市場(chǎng)上的出售級(jí)別降低而影響農(nóng)民收入，而且降低種 子發(fā)芽率，影響面粉品質(zhì)，給小麥生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。
[0003] 小麥黑胚病病因復(fù)雜，受致病菌、環(huán)境因素及品種特性的影響，其嚴(yán)重程度隨品 種、地點(diǎn)、年份及防治措施等因素的不同而變化，各國(guó)報(bào)道的發(fā)病率一般在0.3~66.7%之間 變化（參見：l、Li Q Y, Qin Z, Jiang Y M,化en C C, Duan Z B, and Niu J S. Screening wheat genotypes for resistance to black point and the effects of diseased kernels on seed germination. J Plant Dis Protect, 2014, 121 (2): 79-88； 2、Fernandez, M. R., Sissons, M., Conner, R. L., Wang, H., amd Clarke, J. M. 2011. Influence of biotic and abiotic factors on dark discoloration of durum wheat kernels. Crop Sci. 51:1205-1214;3、代君麗，于巧麗，袁虹霞，邢小萍，張 猛，孫炳劍，李洪連.河南省小麥黑胚病菌的分離鑒定及致病性測(cè)定.植物病理學(xué)報(bào)， 2011, 41(3), 225-231.)〇
[0004] 小麥黑胚病是巧粒病害，在巧粒灌漿期發(fā)生發(fā)展，因?yàn)榍闪Ｍ庥蟹f殼包被，不能及 時(shí)觀察黑胚病的癥狀形成情況，如果去掉穎殼又會(huì)對(duì)巧粒生長(zhǎng)造成嚴(yán)重傷害甚至造成巧粒 脫落，運(yùn)給小麥黑胚病抗病機(jī)理研究、菌與寄主互作、病害防治等研究工作帶來(lái)了一定的困 難。目前，針對(duì)小麥黑胚病接菌鑒定方法的報(bào)告，都是在小麥穗部直接噴灑接菌，進(jìn)行或者 不進(jìn)行保濕處理，成熟后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率(參見：3、代君麗，于巧麗，袁虹霞等.植物病理學(xué)報(bào)， 2011，41(3)，225-231;4、康業(yè)斌，劉順通，成玉梅，段愛菊.小麥對(duì)黑胚病的抗性及黑胚 對(duì)產(chǎn)量損失的影響，植物保護(hù)，1999,3:25-27)。因?yàn)榉f殼的阻隔，運(yùn)些鑒定方法都無(wú)法及時(shí) 的直接觀察接菌后巧粒癥狀形成情況，而且由于沒(méi)有直接將菌接在巧粒上，降低了致病菌 的侵染效果，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。因此，非常有必要探索一種小麥黑胚病接菌鑒定的方 法，使致病菌直接侵染小麥巧粒、提高侵染效果確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定真實(shí)可靠，又能直接觀察 黑胚病的癥狀形成情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)直接噴灑接菌方法不能及時(shí)觀察癥狀產(chǎn)生，W 及菌與巧粒由于穎殼阻隔導(dǎo)致鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性降低的不足，本發(fā)明提供一種能夠及時(shí)觀察 小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法。本發(fā)明首先在小麥抽穗后、巧粒未發(fā)育前將穎殼剪掉一 部分，待巧粒滿仁后再噴灑接菌套袋保濕鑒定，不僅使噴灑的致病菌抱子可W直接與巧粒 接觸，而且可W及時(shí)觀察巧粒上黑胚病癥狀發(fā)生的情況，同時(shí)根據(jù)該浸染情況可W及時(shí)對(duì) 小麥作出合理的防治措施。由此，本發(fā)明首次提供了一種剪殼接菌鑒定小麥黑胚病的方法， 不僅可W及時(shí)觀察癥狀的產(chǎn)生情況，而且使鑒定結(jié)果更穩(wěn)定可靠;并且根據(jù)浸染情況可W 及時(shí)對(duì)小麥作出合理防治。
[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供一種能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，所述接種鑒定方法包 括W下步驟： a、 小麥穗部剪殼處理及雜菌隔離:在小麥抽穗后，用綴子將小麥穗上部及下部的小穗 各去掉3個(gè)，用剪刀將剩下小穗的穎殼從上面剪去1/2,并將麥芒剪掉，然后用硫酸紙袋將去 殼的小麥穗罩上W隔離雜菌； b、 小麥黑胚病致病菌的培養(yǎng):將小麥黑胚病致病菌接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中， 在25°C條件下暗培養(yǎng)12天； C、小麥黑胚病致病菌抱子懸浮液的制備:用蒸饋水沖洗步驟b培養(yǎng)得到的致病菌菌落， 然后經(jīng)過(guò)濾、離屯、、調(diào)整抱子濃度后得到抱子懸浮液，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?d、 噴灑接菌及套袋保濕:在小麥巧粒滿仁時(shí)，將步驟C制備的抱子懸浮液搖勻后均勻噴 灑在步驟a中剪殼處理的穗子上，噴灑后用塑料袋將穗子罩上保濕5天； e、 小麥黑胚病癥狀觀察:接菌后每天觀察步驟d接種處理巧粒上病菌的侵染情況W及 巧粒黑胚病癥狀的形成； f、 鑒定結(jié)果記錄:小麥成熟時(shí)收獲驚干，將步驟d接種處理的穗子手工脫粒，統(tǒng)計(jì)黑胚 病巧粒占巧?？倲?shù)的百分比即為黑胚率，作為小麥黑胚病鑒定的結(jié)果。
[0007] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟b中所述小麥黑 胚病致病菌為小麥根腐平廝蠕抱菌，狗牙根平廝蠕抱菌，幡摔草平廝蠕抱菌和草莖點(diǎn)霉菌 中的至少一種。
[0008] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟b中所述將小麥 黑胚病致病菌接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，具體操作過(guò)程為:首先將PDA培養(yǎng)基進(jìn)行 滅菌，然后冷卻至50~55°C時(shí)，在無(wú)菌條件下加入氨節(jié)青霉素鋼，每IOOmL PDA培養(yǎng)基中氨 節(jié)青霉素鋼用量為10化L，搖勻后倒平板;待培養(yǎng)基凝固冷卻后，用手術(shù)刀片將小麥黑胚病 致病菌菌落切成3mm 2的小塊兒，放于平板的中央，1塊/皿。
[0009] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，PDA培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌 時(shí)的溫度為12rC，滅菌時(shí)間為20分鐘;所述氨節(jié)青霉素鋼的濃度為lOOmg/mL。
[0010] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟C中小麥黑胚病 致病菌抱子懸浮液的制備過(guò)程為： 首先用無(wú)菌蒸饋水(每皿中加入25mL無(wú)菌蒸饋水）沖洗步驟b中PDA平板上培養(yǎng)得到的 致病菌菌落，然后用紗布過(guò)濾至50 mL的離屯、管中，在4°C、4000 r/min的條件下離屯、5min， 去上清液;接著加入10 mL無(wú)菌蒸饋水搖勻再離屯、，去上清液;然后再加入5 mL無(wú)菌蒸饋水， 用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定抱子濃度，根據(jù)測(cè)定的抱子濃度按比例加入無(wú)菌蒸饋水，調(diào)整至抱子濃 度為3 X IO5個(gè)/mL,得到小麥黑胚病致病菌抱子懸浮液。
[0011] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟d中所述小麥巧 粒滿仁時(shí)，是指小麥巧粒發(fā)育為滿仁，即小麥巧粒有1/3~1/4伸出未剪掉穎殼的時(shí)間。
[0012] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟e中接菌后每天 觀察步驟d接種處理巧粒上病菌的侵染情況W及巧粒黑胚病癥狀的形成，根據(jù)浸染情況對(duì) 小麥作出及時(shí)防治。
[0013] 根據(jù)上述的能夠及時(shí)觀察小麥黑胚病癥狀的接種鑒定方法，步驟e中所述觀察采 用兩種方法:一種是直接用肉眼觀察;另一種是分時(shí)間段取樣，制作切片用光學(xué)顯微鏡或掃 描或透射電鏡觀察，W明確黑胚病致病菌的侵染途徑與小麥巧粒組織與菌互作時(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu) 的變化。
[0014] 本發(fā)明的積極有益效果： 1、本發(fā)明技術(shù)方案是在小麥抽穗后，從上部剪掉小穗穎殼的1/2，然后套硫酸紙袋隔離 雜菌，隨著巧粒逐漸發(fā)育，當(dāng)巧粒的1/3-1/4伸出穎殼時(shí)，進(jìn)行致病菌抱子懸浮液噴灑接菌， 塑料袋保濕5天處理，接菌后可W每天觀察巧粒上菌絲的定殖、生長(zhǎng)W及黑胚病的產(chǎn)生情 況。本發(fā)明鑒定方法與直接在穗部噴灑抱子液鑒定相比，可W及時(shí)、直接的觀察到巧粒的發(fā) 病情況，而且增強(qiáng)了鑒定的準(zhǔn)確性。
[0015] 2、本發(fā)明技術(shù)方案中，首先將小麥穗部穎殼剪掉一部分，待巧粒伸出穎殼后再噴 灑接菌，既能保證小麥巧粒正常發(fā)育，又使黑胚病致病菌與巧粒直接接觸，保證了鑒定結(jié)果 的準(zhǔn)確性，而且巧粒有一部分漏在穎殼外，可W直接觀察巧粒的發(fā)病情況;根據(jù)及時(shí)觀察到 的浸染情況，可W對(duì)小麥作出及時(shí)合理的防治措施。
[0016] 3、小麥黑胚病是小麥生產(chǎn)區(qū)的常發(fā)病害，其病原復(fù)雜，嚴(yán)重程度還受環(huán)境影響。在 沒(méi)有準(zhǔn)確鑒定品種抗性的情況下，無(wú)法就小麥對(duì)不同病原的?；共⌒赃M(jìn)行研究。本發(fā)明 所述接菌鑒定方法，首次采用剪掉部分穎殼、可W將抱子液直接噴灑在巧粒表面進(jìn)行鑒定， 使致病菌與巧粒直接接觸，充分保證了接菌效果，提高了鑒定的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，從而保證 了篩選的抗病材料的真實(shí)可靠。
[0017] 4、本發(fā)明方法剪掉一部分穎殼，既保證巧?？蒞正常發(fā)育成熟，又可W使發(fā)育中 的巧粒伸出穎殼外，避免了觀察時(shí)穎殼阻隔的影響，可W直接觀察接菌小麥巧粒上致病菌 抱子的生長(zhǎng)情況與黑胚病的發(fā)生情況，為小麥抗黑胚病機(jī)理研究及菌與寄主植