一種通過(guò)體胚培養(yǎng)獲得大量小蓬竹再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于竹類植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)體胚培養(yǎng)獲得大量小蓬竹 再生植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小蓬竹[Drepanostachyum luodianense (Yi et R. S. Wang) Keng f.]系禾本科竹 亞科鐮序竹屬，又名"藤竹"、"竹麻"，為一次性開(kāi)花結(jié)實(shí)的合軸叢生竹種。小蓬竹竹桿下 部直立，近實(shí)心，上部垂懸呈蔓狀延伸，外形美觀，具有栽培觀賞價(jià)值，常成小片生長(zhǎng)于海拔 600~1000m的石灰?guī)r裸露石山上，是喀斯特石山地區(qū)的適生性竹種。小蓬竹的適應(yīng)性強(qiáng)， 較能耐干旱和瘠薄，特別是在坡度較大的喀斯特地區(qū)，許多其它樹(shù)種和竹類不能生存或能 生存但長(zhǎng)勢(shì)不好，而小蓬竹在此卻能生長(zhǎng)良好，且在狹小的石溝、石縫中也能良好生長(zhǎng)，具 有良好的生態(tài)效益。小蓬竹在喀斯特生態(tài)系統(tǒng)的水源涵養(yǎng)、水土保持、養(yǎng)分平衡等生態(tài)功能 發(fā)揮中具有重要的作用，且又是重要的經(jīng)濟(jì)竹種，其竹材柔韌，可編織涼椅和農(nóng)具；整桿極 適宜用來(lái)作菜架和蘺笆等用；竹材纖維含量高、強(qiáng)度大，也是優(yōu)良的造紙?jiān)希褐仓晷螒B(tài)優(yōu) 美，是良好的園林綠化竹種，特別適合作梯度綠化。同時(shí)，小蓬竹還具有較大的使用價(jià)值，具 有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。
[0003] 然而小蓬竹是我國(guó)特產(chǎn)竹種，在世界自然保護(hù)聯(lián)盟物種生存委員會(huì)編制的《瀕危 物種紅色名錄》中被定為瀕危種。20世紀(jì)末期，小蓬竹被當(dāng)?shù)卦旒埰髽I(yè)廣泛用作造紙?jiān)希?特別是對(duì)新生幼竹掠奪式的砍伐現(xiàn)象嚴(yán)重，致使小蓬竹無(wú)性系種群嚴(yán)重退化，竹株衰老死 亡，種群數(shù)量急劇減少（劉濟(jì)明.喀斯特適生植物小蓬竹研究I[M].貴陽(yáng)：貴州人民出版 社，2010:95-109.)。據(jù)現(xiàn)有調(diào)查，小蓬竹在貴州省的羅甸縣、平塘縣、紫云苗族布依族自治 縣、長(zhǎng)順縣、望謨、安龍、貞豐、冊(cè)亨及惠水等地的喀斯特山地有分布，于海拔600~1000m的 山坡上成片生長(zhǎng)，種群數(shù)量不斷減少，亟需保護(hù)（金祺，劉濟(jì)明.不同生境條件對(duì)小蓬竹生 長(zhǎng)的影響[J].中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2014, 33 (4) : 52~56)。
[0004] 由于竹類植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，開(kāi)花期無(wú)法預(yù)測(cè)，且大部分竹類植物結(jié)實(shí)率低，種子 獲取十分困難。因此，竹子繁殖主要以一株埋鞭、埋桿、埋節(jié)等傳統(tǒng)方法為主，這些方法具有 消耗種竹多、種苗運(yùn)輸不便、勞動(dòng)強(qiáng)度大、繁殖系數(shù)低等缺點(diǎn)，小蓬竹也是如此。利用生物技 術(shù)可以高效、快速地對(duì)作物品種性狀進(jìn)行遺傳改良，從而為小蓬竹再生植株的培養(yǎng)提供一 種方便、快捷和有效的方法。
[0005] 竹子組織培養(yǎng)方面的研究，最早見(jiàn)于Alexander和Rao (1968)關(guān)于竹子合子胚離 體培養(yǎng)的簡(jiǎn)報(bào)。國(guó)內(nèi)外比較系統(tǒng)開(kāi)展竹子組織培養(yǎng)工作始于20世紀(jì)80年代。1982年， Metha等（1982)在第5屆國(guó)際植物組織細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)議上首次報(bào)道通過(guò)胚性愈傷組織獲 得印度莉竹（Bambusa arundinacea)再生植株。我國(guó)的竹子組織培養(yǎng)工作開(kāi)展得較晚， 20世紀(jì)90年代才開(kāi)始，目前已實(shí)現(xiàn)了簕竹屬（Bambusa)的部分竹種、翠竹（Pleioblastus pygmaea)、人面竹（Phyllostachys aurea)、菲白竹（Pleioblastus fortunei)、小蓬竹 (Drepanostachyum luodianense)等觀賞竹的組培快繁。但這些竹種大都通過(guò)以芽繁芽途 徑實(shí)現(xiàn)試管里的離體培養(yǎng)和快速繁殖。現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)通過(guò)以芽繁芽途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)竹子植株的 再生，其技術(shù)已趨于成熟，但通過(guò)體胚誘導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)植株的再生，這方面報(bào)道并不多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明目的是提供一種通過(guò)體胚培養(yǎng)獲 得大量小蓬竹再生植株的方法，能快速、大量獲得小蓬竹再生植株。
[0007] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種通過(guò)體胚培養(yǎng)獲得大量小蓬竹再生植株的方法，具體步驟為：
[0009] 1)將無(wú)菌的小蓬竹叢芽分段接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，愈傷組織形 成后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：以MS 為基本培養(yǎng)基，再附加 2. 0 ~3. Omg/L 2, 4-D、0. 01 ~0· lmg/L TDZ、0. 5 ~1. Omg/LNAA、 100mg/L Vc、30g/L蔗糖、6. 5g/L瓊脂；繼代培養(yǎng)基組成為：以MS為基本培養(yǎng)基，再附加 4.0~5.011^/12,4-0、0.5~1.011^/1了02、10011^/1￥(3、3(^/1蔗糖、78/1瓊脂；
[0010] 2)將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，至有再生叢芽分化形成；分化培養(yǎng) 基組成為：以MS為基本培養(yǎng)基，再附加 L 0~2. Omg/L TDZ、0. 5~L Omg/L NAA、30g/L蔗 糖、6. 5g/L瓊脂；
[0011] 3)將已經(jīng)分化出的再生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基組成 為以MS為基本培養(yǎng)基，再附加 L 0~3. 0mg/L ΝΑΑ，(λ 1~0· 5mg/L IBA ;
[0012] 4)待根生長(zhǎng)至5~10cm時(shí)，進(jìn)行再生苗的移栽；再生苗移栽花盆中后置于植物生 長(zhǎng)室中生長(zhǎng)2周后移至室外。
[0013] 步驟1)中，所述胚性在愈傷組織培養(yǎng)三周后，將其轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中。
[0014] 步驟4)中，所述植物生長(zhǎng)室的生長(zhǎng)條件為：濕度在60%-80%，溫度25±1°C，光 周期為光照14h/黑暗10h。
[0015] 步驟1)中，在小蓬竹愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加的激素為：2, 4-D 3. 0mg/L+TDZ 0. 01mg/L+NAA 1. 0mg/L〇
[0016] 步驟1)中，小蓬竹胚性愈傷培養(yǎng)基中使用的激素為2, 4-D 5. 0mg/L+TDZ 1. Omg/ L〇
[0017] 上述培養(yǎng)基組分中，MS為MS培養(yǎng)基成分（Murashige&Skoog medium，1962， Physiol. Plant 15:473-497)，2, 4-D 為 2, 4-二氯苯氧乙酸，TDZ 為噻二唑苯基脲，NAA 為萘 乙酸，Vc為維生素 C。
[0018] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法，獲得小蓬竹的頻率高，時(shí)間短，非常適 宜于小蓬竹遺傳改良。完成小蓬竹植株再生的時(shí)間最快僅需12周左右。為小蓬竹的快速 繁殖和定向生物技術(shù)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。具有一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是小蓬竹的叢芽外植體圖；
[0020] 圖2是小蓬竹叢芽誘導(dǎo)出的愈傷組織圖；
[0021] 圖3是小蓬竹愈傷組織在繼代增殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)三周后的胚性愈傷組織圖；
[0022] 圖4是小蓬竹胚性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化一個(gè)月后長(zhǎng)出大量芽體圖；
[0023] 圖5是繼代2次后的小蓬竹芽叢圖；
[0024] 圖