一種關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護液及軟骨保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護液及軟骨保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著我國人們生活水平的提高以及體育運動的全面普及，關(guān)節(jié)軟骨損傷患者顯著增多。異體骨軟骨移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損取得了一系列令人鼓舞的進展。軟骨移植是目前治療軟骨病變的十分有前景的修復(fù)方法之一。因為異體軟骨移植材料獲得相對較易且可預(yù)制成任意形狀和大小，便于將正常功能的關(guān)節(jié)軟骨制成各種形狀植于骨缺損處，恢復(fù)軟骨的外形，而且先期實驗證明，證明低溫保存后的軟骨的免疫原性大大降低，從而提高軟骨移植的成活率，達到修復(fù)軟骨損傷的目的，所以比自體移植應(yīng)用前景更佳。而且軟骨移植物經(jīng)過一段時間保存后可擇期完成關(guān)節(jié)重建手術(shù)，并且有充裕的時間進行多項檢測，防止供者可能帶來的病毒或細菌感染，且可降低免疫原性。
[0003]實驗表明，經(jīng)低溫冷凍保存的同種異體骨軟骨移植治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損獲得了滿意的效果，但是生物材料(細胞、組織、器官)脫離供體后實現(xiàn)長時間的保存很難。伴隨著低溫保存技術(shù)的不斷發(fā)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn):在深低溫環(huán)境中的離體生物材料會逐漸減緩其新陳代謝，甚至停止新陳代謝，因此能夠使其得以長期保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種關(guān)節(jié)軟骨移植物玻璃化冷凍冷凍保護液及其保存方法，旨在解決現(xiàn)有的長期持續(xù)保持關(guān)節(jié)軟骨移植物的活性和軟骨細胞成存活率低、體外保存時間短的問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種關(guān)節(jié)軟骨移植物玻璃化保護液及軟骨保存方法，該保護液每100ml包括:99.9%二甲基亞砜150?250ml、乙酰胺110?200g、1，2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇(8000) 10?80g、海藻糖20?100g、余為去離子水。
[0006]進一步，該軟骨玻璃化保護液的pH值為7.30?7.50 ;處理后軟骨塊封裝后在液氮中保存。
[0007]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護液，每100ml含99.9%二甲基亞砜160ml、乙酰胺125g、l，2-丙二醇80ml、聚乙二醇(8000) 30g、海藻糖40g、余為去離子水。
[0008]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護液，每100ml含99.9%二甲基亞砜205ml、乙酰胺155g、l，2-丙二醇100ml、聚乙二醇(8000) 60g、海藻糖60g、余為去離子水。
[0009]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護液，每100ml液含99.9%二甲基亞砜225ml、乙酰胺190g、l，2-丙二醇115ml、聚乙二醇(8000) 70g、海藻糖90g、余為去離子水。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保存方法，方法包括如下步驟:
[0011]步驟一，取99.9%二甲基亞砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇(8000)、海藻糖和去離子水；
[0012]步驟二，將步驟一的原料配制成溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值至7.30?7.50 ;
[0013]步驟三，把新鮮同種異體骨軟骨移植物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3-5次；
[0014]步驟四，將步驟三骨軟骨移植物將骨軟骨塊在4°C下經(jīng)梯度玻璃化溶液:1/3濃度玻璃化保護液、2/3濃度玻璃化保護液、3/3玻璃化保護液等逐級依次浸泡10分鐘，用冷藏管封裝，做好標記，然后直接以最快速度投入液氮中保存。
[0015]本發(fā)明的另一目的在于提供一種骨軟骨移植物玻璃化冷凍保護液及軟骨保存方法在軟骨組織庫的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的另一目的在于提供一種軟骨玻璃化保護液及軟骨保存方法在臨床同種異體骨軟骨移植術(shù)治療關(guān)節(jié)軟骨損傷中應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明提供的玻璃化冷凍保護液及軟骨保存方法，使軟骨細胞存活率在冷凍保存第8周時仍保持在一個較高水平(由傳統(tǒng)組的60%提高到68% )，能夠能有效提高骨軟骨移植物保存效果、延長體外骨軟骨移植物的保存時間，從而為建立軟骨組織庫，擴大同種異體骨軟骨移植修復(fù)軟骨缺損臨床技術(shù)推廣應(yīng)用，為骨軟骨缺損患者的快速康復(fù)帶來福音。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明實施例提供的關(guān)節(jié)軟骨移植物玻璃化冷凍保護液的制備及軟骨保存方法流程圖；
[0019]圖2是本發(fā)明實施例提供的新型軟骨移植物玻璃化冷凍保護液與對照組保護液保存豬關(guān)節(jié)骨軟骨組織在保存第8周時軟骨細胞成存活率示意圖。
【具體實施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0022]本發(fā)明實施例的軟骨玻璃化保護液包括??每100ml骨軟骨移植物保護液包括:99.9%二甲基亞砜150?250ml、乙酰胺110?200g、l, 2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇(8000) 10?80g、海藻糖20?100g、余為去離子水；將原料配制成溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值至7.30?7.50 ;把新鮮同種異體骨軟骨移植物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3-5次；將骨軟骨塊在4°C下經(jīng)梯度玻璃化溶液:1/3濃度玻璃化保護液、2/3濃度玻璃化保護液、3/3玻璃化保護液逐級依次浸泡10分鐘，用冷藏管封裝，做好標記，然后直接以最快速度投入液氮中保存。本發(fā)明的另一目的在于提供一種軟骨玻璃化保護液在骨軟骨組織庫的應(yīng)用。
[0023]如圖1所示，本發(fā)明實施例的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護液及軟骨保存方法包括以下步驟:
[0024]SlOl:取99.9%二甲基亞砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇(8000)、海藻糖、余為去離子水，配制成溶液，攪拌均勻，滴定法調(diào)節(jié)PH值至7.30?7.50 ;
[0025]S102:把新鮮同種異體骨軟骨移植物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3-5次；
[0026]S103:將步驟二骨軟骨移植物將骨軟骨塊在4°C下經(jīng)梯度玻璃化溶液:1/3濃度玻璃化保護液、2/3濃度玻璃化保護液、3/3玻璃化保護液等逐級依次浸泡10分鐘，用冷藏管封裝，做好標記，然后直接以最快速度投入液氮中保存；
[0027]S104:使用時將軟骨塊取出進行復(fù)溫:冷凍骨軟骨塊取出后，立即行37°C水浴復(fù)溫10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分鐘，最后磷酸鹽緩沖液液沖洗3遍。
[0028]本發(fā)明的具體實施例:如圖2所示:
[0029]實施例1:每100ml玻璃化保護液包括:99.9%二甲基亞砜160ml、乙酰胺125g、1，2-丙二醇80ml、聚乙二醇(8000) 30g、海藻糖40g、余為去離子水，將原料配制成溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值