利用礦物成核劑進行冷凍的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及利用礦物成核劑來冷凍容器中的生物實體或制劑的含水質 (water-containingquantity)的方法、該礦物作為成核劑的用途W(wǎng)及在其整個或部分表 面上或表面中具有該礦物的容器。
【背景技術】
[0002] 存在兩種相關的方法用于生物學材料的保藏。在低溫保存中，W冷凍狀態(tài)冷凍并 儲存生物學材料。在冷凍干燥（凍干）中，從冷凍的生物學樣品中除去水，然后將其W干燥 狀態(tài)儲存。冷凍干燥也被用于（例如）藥物的儲存或溶質的樣品化中（patterning)。
[0003] 低溫保存被廣泛應用于保持生物學樣品的長期活力W用于醫(yī)學、生物技術和獸醫(yī) 學。為了在解凍后獲得高活力，必需加入保護性化合物（已知為低溫保存添加劑或低溫保 存劑）并且W受控速率冷卻樣品。對于許多細胞類型，在冷卻過程中通過受控成核來誘發(fā) 冰形成而不是使冰自發(fā)成核是合乎需要的。
[0004] 用于低溫保存的樣品通常被置于例如W下的專用低溫容器中：
[000引?吸管（Straws)，其是直徑為2mm至4mm，長度達140mm，且容量為0. 2ml至0. 5ml 的薄壁管.
[0006]?冷凍管（化yovials)，其是直徑為約12. 5mm且容量為0. 5ml至5. 0ml的短粗 (wide short)管；
[0007] ?用于較大體積的低溫保存的容量為5ml至1000ml的柔性袋；W及
[000引 ?在機器人技術和高通量篩選中使用的微孔板、介質管（matrixtube)和其他SBS 形式。
[0009] 一系列設備可被用于W受控速率來冷凍吸管和冷凍管。該些設備可使用液氮作為 制冷劑或通過機械制冷來冷卻。另外存在一些被動冷卻裝置。該些裝置中的某些使樣品中 的冰受控成核，該可W手動或自動進行。
[0010] 在W受控速率冷凍之后，將樣品在低溫（通常為液氮的溫度（-196°C))下保持冷 凍。在此溫度下，如果細胞能夠在低溫下存活，則其生存力與儲存時間無關。當需要使用時， 將樣品快速解凍（通常處于保持在37°C的水浴中）并除去低溫保存劑。
[0011] 冷凍干燥（凍干）被廣泛用于生物技術、醫(yī)學和獸醫(yī)學領域W長期穩(wěn)定細胞、疫 苗、蛋白和其他生物活性化合物。冷凍干燥也被用于產(chǎn)生結構材料，例如應用于再生醫(yī)學中 (MassieI等（2011),TissueE；ngPartCMethods. 17:765-774)和新型陶瓷制造中的支架 和基質。在冷凍干燥過程中，將含水樣品置于專用容器（通常為玻璃瓶）中并在冷凍干燥 機中的冷卻架上冷凍。冷凍之后，降低局部氣壓并且冷凍樣品中的冰升華。在從樣品除去 水之后，在真空下使瓶升溫冰將其密封?？稍诃h(huán)境溫度下分裝該樣品并通過加入水進行恢 復。
[0012] 在冷凍干燥中，樣品往往會普遍過度冷卻，該會導致樣品之間具有不同的冰晶 結構。冰在接近烙點的溫度下成核會導致樣品具有快速升華的大冰晶。相對而言，其中 冰在遠離烙點的溫度下成核的樣品會具有小的冰晶并且W慢速升華（SearlesJA等 (2001),Journalof化armaceuticalSciences90:860-871)。當處理大量的樣品時， 通常選擇處理條件W適應具有最小冰晶的群（population)的緩慢干燥，導致處理時間 延長并且設備和設施低效使用。冰成核溫度被認為確定處理時間和生物學活性恢復的 關鍵因素(KasperJC,FriessW(2011),EuropeanJournalofPharmaceuticsand Bio地armaceutics78:248-263)。
[0013] 按照常規(guī)低溫保存的哺乳動物胚胎的成功復原依賴于在高的零下溫度（通常 為-7°C)下的受控冰成核。由于大量的過度冷卻而形成細胞內(nèi)冰，其中使冰自發(fā)成核的樣 品具有差的復原（Whittin曲amDG(1977),CibaFoundation52.ElsevierAmsterdamEds KElliotandJWhelanpp97-127)。通過控制冰成核也提高了許多細胞類型（包括哺乳 動物精子和干細胞）的生存力。該通常是通過冷卻低溫容器W使內(nèi)容物低于其烙點并且然 后手動使該低溫容器的外部與制冷工具接觸或機械攬拌該低溫容器來進行的。該一過程通 常被稱作"接種（seeding)"。接種的缺點在于其是一種手動步驟，該意味著能夠被處理的 樣品較少并且需要物理介入（physicalaccess)該樣品。
[0014] 已經(jīng)提出了其他的物理方法來誘導成核。例如在冷凍干燥機中，之后落入樣品中 的水蒸汽的結晶（雪）誘導成核。最近，普萊克斯公司（PraxairCo巧oration)已經(jīng)引進 了 '壓致移動（pressureshift)'工藝，其中用氣氣將冷凍干燥機中的樣品加壓至28psig， 然后冷卻至期望的成核溫度。然后將該壓力降低至IpsigW誘導成核化onstantinidisA K等（2011),Journalof化armaceuticalSciences100:；3453-3470)。然而，該種方法仍 然是試驗性的，成本高昂，難W更新改造并且不適用于小型冷凍干燥機。
[0015] 針對低溫保存樣品的冰成核，已經(jīng)考察了大量的化學成核劑（有時被稱為成 核催化劑）。該些成核劑促使被稱作異相成核化eterogeneousnucleation)或促進成 核（facilitatednucleation)的現(xiàn)象發(fā)生。實例包括艦化銀的晶體、細菌了香假單胞 桿菌（Pseudomonassyringeae)和膽固醇的晶體。將該成核劑加入到樣品中，然后將樣 品冷卻。當在樣品內(nèi)部達到充分水平的過度冷卻時，就會發(fā)生冰成核。該種過程使得大 量的樣品經(jīng)過處理，但也存在有關其毒性或潛在毒性或其細菌源性化acterialorigin) 或動物源性的缺點。已知的成核劑不太可能與細胞一起使用于臨床應用。當大量的該 些成核劑在較高的零下溫度下誘導冰形成時，它們在藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范（GMP)的 標準下被制造是不太可能的并且它們會具有毒性（SaridakisE等（2008),Trendsin Biotechnology. 27:99-106) 〇
[0016] 一些細菌菌株能夠在高達-2°C的溫度下使冰成核（ValiG. (1995).Principles oficenucleation.BiologicalicenucleationandItsApplication.R.E.Lee,G. Warren和L.Gusta.St.Paul,Minnesota,APS出版社）。然而，細菌的冰成核活性對于環(huán) 境生長條件高度敏感并且所得的蛋白是熱敏感的。該種對于環(huán)境條件的敏感性使得其 不適于該一應用。存在其他（非細菌）生物學材料在高的零下溫度下使冰成核的報道 化enderson-BeggSK.等（2009).AtmosphericScienceLetters10:215-219)。然而，在 加熱下冰核往往不穩(wěn)定并且仍具有非常差的特性。艦化銀已經(jīng)顯示出在非常高的溫度下對 冰形成的催化作用（VonnegutB等（1984),J.Appl.Meteor. 23(3) :486-490)，但不能與樣 品一起用于臨床應用。
[0017] 礦物粉塵被認為是相對低效的冰核?？偨Y了浸于水滴中的固體顆粒的冰成核 數(shù)據(jù)的綜述性文章引述了礦物粉塵的最高冷凍溫度（約-15°C)0tooseC和0M加ler口012),AtmosphericChemistiTand曲ysics. 12:9817 - 9854;和MurrayB.J等 (2012),QiemicalSocietyReviews. 41:6519-6554)。
[001引刮板式換熱器（scrapedsurfaceheatexchanger)被用于冷凍較大體積的水、 糖、乳制品、色素、風味劑和其他添加劑的混合物W形成冰洪淋或冰沙飲料。該刮板式換熱 器在高壓和恒定攬拌下冷卻混合物。成核通常在較少數(shù)量的位置中自發(fā)地發(fā)生。冰晶持續(xù) 生長并且被機械打碎W使最終產(chǎn)品中存在的冰晶的尺寸最小。小的冰晶被認為是合乎需求 的，因為相比于含有較大冰晶的冰洪淋，其賦予冰洪淋更加順滑的質感。然而由于冰洪淋的 高糖含量，當在-l0°C至-2(TC之間的溫度下儲存時，其往往會部分融化和再結冰，該導致 較大的冰晶生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明設及通過采用冰的控制成核用的礦物來改善含水產(chǎn)品的冷凍處理。
[0020] 因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了用于冷凍生物實體或制劑的含水質的方法，包 括：
[0021] (A)使所述含水質與礦物成核劑在容器中接觸；W及
[0022] 做冷卻所述含水質，W使所述礦物成核劑起到促進冰的非自發(fā)形成的作用。
[0023] 通過促進冰的非自發(fā)形成，所述礦物成核劑有利地提供了在冰成核過程中的控制 元素，所述冰成核有助于保持所述生物實體或