一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培 養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】：
[0002] 三葉青（Tetrastigma hemsleyanum)，又名三葉對（《浙江民間常用草藥》），蛇附 子（《植物名實(shí)圖考》）等，屬于葡萄科崖爬藤屬多年生草質(zhì)藤本植物。三葉青產(chǎn)江蘇、浙 江、福建、江西、臺灣、廣西、湖北、廣東、湖南、貴州、四川、云南、西藏。生于山坡灌叢、溪邊林 下巖石縫中，海拔300-1300米。三葉青以塊根或全草入藥，研宄表明三葉青中的化學(xué)成分 黃酮在其發(fā)揮藥效方面起到重要作用，其對多種腫瘤具有促凋亡的作用。三葉青黃酮抗腫 瘤的機(jī)制主要有促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高免疫力和抗氧化作用。目前，三葉青黃酮的抗癌作用正 逐漸受到關(guān)注。
[0003] 近些年，由于不合理的狂采濫挖加之對生長環(huán)境要求苛刻，三葉青野生資源瀕臨 滅絕，人工栽培難度大，市場供需矛盾凸顯。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn) 物，是未來利用此資源的一個途徑，但三葉青組織培養(yǎng)研宄中會出現(xiàn)愈傷組織中總黃酮含 量較低的問題，因此獲得一種能顯著促進(jìn)三葉青愈傷組織中總黃酮合成的培養(yǎng)基，是能滿 足市場需求，降低生產(chǎn)成本的有效途徑。
[0004] 稀土元素一般指元素周期表中的鑭系和鈧、釔共17中元素的總稱。稀土元素對植 物生長相關(guān)方面的促進(jìn)作用引起了研宄人員把稀土元素應(yīng)用到植物組織培養(yǎng)體系中的興 趣。文獻(xiàn)表明，低濃度的稀土元素應(yīng)用于組培體系后會促使愈傷組織的增殖和相關(guān)代謝產(chǎn) 物的合成，稀土的這種效應(yīng)可能是通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣信號的變化來調(diào)控相關(guān)次生代謝產(chǎn)物 合成的。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基，以提高愈傷 組織總黃酮的含量。該培養(yǎng)基的組成包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和稀土元素。
[0006] 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及含量為：
[0007] KNO3 80-2900mg/L，NH4NO3 105-1520mg/L，KH2PO4 19-410mg/L，MgSO4 ? 7H20 240-750mg/L，CaCl2 ? 2H20 145-460mg/L，KCl0-67mg/L，KI0? 7-1.7mg/L，H3BO3 0? 7-6. 3mg/L，MnSO4 ? 4H20 4_25mg/L，ZnSO4 ? 7H20I. 5-8. 6mg/L，Na2MoO4 ? 2H20 〇-〇? 28mg/ L，CuSO4 ? 5H20 0-0? 35mg/L，CoCl2 ? 6H20 0-0? 03mg/L，Na2-EDTA0-38mg/L，F(xiàn)eSO4 ? 7H20 24-29mg/L，肌醇0-100mg/L，甘氨酸0-2. 5mg/L，Vbi 0? 1-11.Omg/L，Vb6 0? 4-1. 2mg/L， 煙酸0? 3-1. 5mg/L，6-芐基腺嘌呤（以下簡稱6-BA) 2. 0-3.Omg/L，萘乙酸（以下簡稱 NAA)0. 2-0. 5mg/L，蔗糖20-30g/L，瓊脂4. 0-7. 0g/L。
[0008] 所述的稀土元素為釹、鈰或二者組成的混合物，總濃度為0. 01-0. 2mM，加入形式為 其鹽溶液，混合稀土的摩爾比為釹：鈰= 1-35 : 1-45。
[0009] 本發(fā)明一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基定為A培養(yǎng)基，其配制為現(xiàn) 有配制方法，其中稀土元素亦是配成母液后，吸取相應(yīng)的體積。
[0010] 三葉青愈傷組織中總黃酮的測定方法為：取稀土處理30d的愈傷組織，除去瓊脂， 稱重，把愈傷組織切成小塊，置于50°C烘箱中，烘至恒重，記錄恒重值。把干燥至恒重的愈 傷組織粉粹，稱取0.1 g的粉末，記錄實(shí)際稱取量，放入IOmL dorf管中，加入5. OOmL 50% 乙醇，超聲提取3h，離心，4000rpm，IOmin留取上清液即得供試品溶液。測定總黃酮含量時 精密量取供試品溶液3. OOmL至25mL的容量瓶中，加入50 %乙醇至6. OOmL，然后分別加入 1.0 OmL 5% NaNO2,1. OOmL 10% Al (NO3)3,10.0 OmLlO % NaOH，每次間隔 6min，最后用 50 % 乙 醇定容，搖勻后放置20min，即可用紫外分光光度計測定500nm處的吸光值。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線時，以蘆丁為對照品，所得到的回歸方程為Y = 11. 648C-0. 0018, R2= 0. 9992。其中，Y 代表總黃酮的吸光值，C代表總黃酮的濃度（mg/mL)。
[0011] 三葉青愈傷組織中總黃酮的含量S = (CNV/W) X 100% ;
[0012] 其中，S為三葉青總黃酮含量)，N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積（mL)，W為愈傷 組織干重（mg)。
[0013] 本發(fā)明的有益之處：采用此培養(yǎng)基能使三葉青愈傷組織總黃酮含量增加，可為工 業(yè)化生產(chǎn)三葉青黃酮提供原料而且可保護(hù)三葉青野生資源。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1
[0015] 取三葉青的葉片，用洗衣粉溶液浸泡5min，流水沖lh，于無菌超凈工作臺上用 75 %酒精消毒30s，無菌水洗3次，再于0. 15 %氯化采中消毒6min，無菌水洗6次，用解剖刀 將已消毒后的葉片切成1平方厘米的小片，接種于1/2MS培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基中含有2. Omg/ L的6-BA和0. 2mg/L的NAA，培養(yǎng)溫度為25± 1°C，暗培養(yǎng)，20-25d后長出三葉青愈傷組織。
[0016] 把獲得的三葉青愈傷組織繼代于上述培養(yǎng)基中生長20d進(jìn)行后續(xù)研宄，培養(yǎng)溫度 為25±1°C，暗培養(yǎng)。
[0017] 將繼代培養(yǎng)20d的三葉青愈傷組織接種至A培養(yǎng)基中生長，A培養(yǎng)基的組成為：
[0018] KNO3 80mg/L，NH4NO3 105mg/L，KH2PO4 19mg/L，MgSO4?7H20 240mg/L，CaCl2?2H20 145mg/L，KI 0? 7mg/L，H3BO3 0? 7mg/L，MnSO4 ? 4H20 4mg/L，ZnSO4 ? 7H20 I. 5mg/L， Na2MoO4 ? 2H20 0? 12mg/L，CuSO4 ? 5H20 0? 13mg/L，CoCl2 ? 6H20 0? 01mg/L，Na2-EDTA25mg/L， FeSO4 ? 7H20 24mg/L，肌醇 20mg/L，甘氨酸 0? 5mg/L，VB1 0? lmg/L，VB6 0? 4mg/L，煙酸 0? 3mg/ L，6-芐基腺嘌呤2. 0mg/L，萘乙酸0. 2mg/L，蔗糖20g/L，瓊脂4. 2g/L，所加稀土元素為釹 (Nd3+用量如下表），培養(yǎng)溫度25± 1°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為30d。
[0019] 培養(yǎng)結(jié)束后測定三葉青愈傷組織中總黃酮的含量，結(jié)果見表1。
[0020] 表1不同濃度的Nd3+對三葉青愈傷組織總黃酮含量的影響
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基的組成包括： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和稀土元素。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基，其特征在于， 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及含量為： KNO3 80-2900mg/L，NH4NO3 105-1520mg/L，KH2PO4 19-410mg/L，MgSO4 ? 7H20240-750mg/ L，CaCl2 ? 2H20 145-460mg/L，KCl 0-67mg/L，KI 0? 7-1. 7mg/L，H3BO3 0? 7-6. 3mg/L， MnSO4 ? 4H20 4-25mg/L，ZnSO4 ? 7H20 I. 5-8. 6mg/L，Na2MoO4 ? 2H20 0-0? 28mg/L，CuSO4 ? 5H20 0-0? 35mg/L，CoCl2 ? 6H20 0-0? 03mg/L，Na2-EDTA 0-38mg/L，F(xiàn)eSO4 ? 7H20 24-29mg/L，肌醇 0-100mg/L，甘氨酸0-2. 5mg/L，VB1 0? 1-11. Omg/L，VB6 0? 4-1. 2mg/L，煙酸0? 3-1. 5mg/L， 6_芐基腺嘌呤2. 0-3. Omg/L，萘乙酸0? 2-0. 5mg/L，蔗糖20-30g/L，瓊脂4. 0-7. Og/L。
3. 如權(quán)利要求I所述的一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基，其特征在于， 所述的稀土元素為釹、鈰或二者組成的混合物，總濃度為〇. 01-0. 2mM，加入形式為其鹽溶 液，混合稀土的摩爾比為釹：鈰= 1-35 : 1-45。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮合成的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和稀土元素組成，使用該培養(yǎng)基可明顯促進(jìn)三葉青愈傷組織總黃酮的合成。本發(fā)明不僅可為工業(yè)化利用三葉青黃酮提供原料，也有利于三葉青野生資源的保護(hù)。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104756875
【申請?zhí)枴緾N201510226422
【發(fā)明人】余伯陽, 張劍, 張騰騰, 彭昕
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年5月4日