一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品領域,具體涉及一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法。
【背景技術】
[0002] 霍山石斛是我國瀕臨滅絕的珍稀物種,被譽為"中華仙草"之首,是霍山縣獨有的、 擁有原產(chǎn)地地理標志的名貴中藥材,具有極高的藥用保健價值,具有生津益明、清熱養(yǎng)陰、 消炎止痛、清音明目功能及抗癌、抗衰老、抗輻射和增強免疫力等功效,尤其霍山石斛多糖 具有極高的保健和醫(yī)療作用。但由于其生境狹窄,繁殖困難,植株數(shù)量極少,因此人工種植 霍山霍山石斛具有廣闊的前景,但缺乏優(yōu)質(zhì)種苗是霍山霍山石斛種植業(yè)的瓶頸之一。雖然 國內(nèi)早有關于霍山霍山石斛種苗生產(chǎn)的專利和文獻報道,但是卻沒有見到利用試管開花授 粉結果的方法來繁殖霍山霍山石斛的。
[0003] 由于野外的種種環(huán)境因素制約,受氣候影響較大,且病蟲害嚴重且難以防治,野生 的霍山石斛瀕臨滅絕,屬于國家級珍惜名貴中藥材,野外養(yǎng)殖繁殖率低,且成本較高。
[0004] 用霍山石斛種子培養(yǎng)出來的苗,一般稱為實生苗,其特點是變異度比較大,植株形 狀不太穩(wěn)定,成本低,產(chǎn)量大,周期短。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn): 一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法,其特征在于包括以下內(nèi)容: (1) 果莢選擇:霍山石斛的花期在每年的四月中旬到五月中旬,這一段時期對霍山石斛 進行授粉,花授粉后,花梗下面會膨大,然后結果,等果實長到九月底,果莢就可采摘下來進 行播種繁殖,所述果莢選擇原則:果實飽滿,無病蟲害,沒有破裂的;在晴天中午或下午選 摘果莢,在雨天、陰天或露水未干時不宜采摘; (2) 外植體消毒:將霍山石斛果莢采回來后,先將果莢的首尾多余的部分用刀片去掉, 用75%的酒精棉擦拭果莢的表面及溝紋,將污垢和塵土擦拭干凈后,把沒有裂開果莢放到 消毒好的燒杯中,先放稀釋10倍的次氯酸鈉消毒液沒過果莢,加一滴展著劑,充分搖蕩,消 毒10分鐘,再以無菌水沖洗三到四次,備用; (3) 接種培養(yǎng):將備用好的果莢放入母液培養(yǎng)基中進行培養(yǎng); (4) 繼代培養(yǎng):霍山石斛種子播種后7-14天,胚即吸水膨大,逐漸漲破種皮,形成淡黃 色的圓球體;30天后頂端分生組織突出,慢慢變綠,下半部有散射狀的吸收毛分布;播種40 天,第一片擬葉形成,播種90天左右,由莖頂基部分化長出根;此時就可繼代培養(yǎng),轉入繼 代培養(yǎng)基中培養(yǎng); (5) 壯苗培養(yǎng):經(jīng)過2-3個月的培養(yǎng)后,小苗長成具有2厘米長的莖時,再換入促進小 苗生長的壯苗培養(yǎng)基中,每瓶45-50株,在經(jīng)過3-4個月的培養(yǎng)待新芽長到3-5厘米時就可 出瓶種植,霍山石斛從播種到出瓶種植約8-10個月; (6) 培養(yǎng)室管理:無菌培養(yǎng)室使用前一個星期,先把培養(yǎng)室的衛(wèi)生打掃干凈,用農(nóng)藥進 行熏蒸,關閉三天后開門通風,再用臭氧機消毒6小時,次天就可擺苗進去,培養(yǎng)室的溫度 常年在24-26度,冷熱都由空調(diào)控制,光照在1800-20001ux,有燈光控制,無菌培養(yǎng)室要時 刻保持干凈衛(wèi)生,定期打掃,消毒; (7) 不定芽誘導,增殖技術: T培養(yǎng)基的準備: 選擇適合的培養(yǎng)基配方進行配置,調(diào)PH值在5. 4-5. 8之間,在121°C,內(nèi)室壓力在 0. 115MPa下滅菌20分鐘,備用; f外植體的滅菌: 選擇高為3-5厘米的健康植株,用刀片小心取出石斛的幼莖剝?nèi)ネ饷婀?jié)上的幾張葉片 和包衣,放到洗滌劑中清洗,在清水清洗,放在10%次氯酸鈉溶液中加兩滴吐溫20,清洗15 分鐘,然后用蒸餾水沖洗3-4次; f接種: 把滅菌好的莖尖種在預先準備好的初始培養(yǎng)基上,一個試管接一個莖尖,培養(yǎng)30天左 右,存活的莖尖轉接到其他的培養(yǎng)基中; I不定芽誘導: 取滅菌以后的莖尖接種到一誘導培養(yǎng)基中,進行誘導不定芽,培養(yǎng)50天左右; I不定芽增殖: 不定芽轉接到增殖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2個月,倍數(shù)達到3倍以上繼代培養(yǎng); I原球莖誘導不定芽: 原球莖達到一定量后,可以轉接到催芽培養(yǎng)基中催芽,生長2個月后,芽長到1厘米時 轉接于生根培養(yǎng)基中; _::生根培養(yǎng): 苗生長到株高1厘米時,再將小苗轉接到生根培養(yǎng)基中,進行生根培養(yǎng),待株高漲到 3-5厘米,有5片以上葉,3-5條根時,就可移出瓶外種植。
[0007] 2.根據(jù)權利要求1所述的霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法,其特征在于:培養(yǎng)基制 備: 母液和培養(yǎng)基的配制,在實驗中常用的培養(yǎng)基,可將其中的各種成分配成10倍、100倍 的母液,放入冰箱中保存; a. 大量兀素混合母液:指濃度大于0. 5mmol/L的兀素,即含隊?、1(、〇3、]\%、3六種 鹽類的混合溶液,配成10倍母液,用時每配1000 ml取100mL母液,配時要注意以下幾點: a.各化合物必須充分溶解后才能混合;b.混合時注意先后順序,特別要將鈣離子與硫酸根 離子,磷酸根離子錯開,以免產(chǎn)生硫酸鈣、磷酸鈣等不溶性化合物沉淀;c.混合時要慢,邊 攪拌邊混合; b. 微量元素混合母液:指小于0. 5mmol/L的元素即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、 Cl鹽類的混合溶液,因含量低,配成100倍甚至1000倍,用時每配1000ml取IOml或lml, 配時也要注意順次溶解后再混合,以免沉淀; c. 鐵鹽母液:鐵鹽必須單獨配制,若同其他無機元素混合配成母液,易造成沉淀,配法 是將5. 57gFeS04. 7H20水溶液緩慢加入到7. 45gNa2 -EDTA微沸水溶液中,并不斷攪拌, 最后定容到1000ml,用時每配1000 ml培養(yǎng)基取5ml; d. 有機化合物母液:含有維生素和氨基酸類物質(zhì),分別配成單獨的母液,其濃度有每 ml含 0? 1、1.OUOmg化合物; e.植物激素:每種激素必須單獨配制成母液,濃度為每ml含0. 1、0. 5、I.Omg激素,配 法如下:IAAIBAGA3先溶與少量95%酒精,再加水定容到一定濃度;NAA溶于熱水或少量 95%的酒精中,再加水定溶到一定濃度;2,4 一D不溶于水,用Imol的NaOH溶解后,再加水 定容至一定濃度;KIN和BA先溶于少量Imol的HCl中,再加水定容;玉米素先溶于少量 95 %酒精中,再加水至一定濃度, f. 培養(yǎng)基的配置 I混合培養(yǎng)基中的各成分。先量取大量元素母液,再依次加入微量元素母液、鐵鹽母 液、有機成分,然后加入植物激素及其他附加成分; +€溶化瓊脂。稱取應加的瓊脂和蔗糖,將瓊脂浸泡到透明后,用蒸餾水加熱燒開熔化瓊 月旨,待瓊脂完全溶化后,把1加入,用pH試紙測pH值,并用0.Imol的NaOH或HCl調(diào)pH為 5. 6-5. 8; f分裝到600ml的蘭花瓶中,120ml/瓶; I在121 °C,壓力在0. 1-0. 115MPa下滅菌20分鐘,取出來放儲藏室,備用。
[0008] 本發(fā)明的有益效果:能徹底改變了野生米斛結實率低的問題,同時解決野外的種 種環(huán)境因素制約,受氣候影響較大,且病蟲害嚴重且難以防治,保護了野生米斛,同時提高 了米斛繁殖率,保護了米斛的繁殖;用原球莖和不定芽培養(yǎng)出來的苗為克隆苗,其特點是能 保持親本的優(yōu)良特性,植株整齊一致,成本高,產(chǎn)量低,周期長,數(shù)代之后會退化,原球莖繼 代要控制在6-8代,不定芽繼代次數(shù)要控制在8-10代。
【具體實施方式】
[0009] -種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法,其特征在于包括以下內(nèi)容: (1) 果莢選擇:霍山石斛的花期在每年的四月中旬到五月中旬,這一段時期對霍山石斛 進行授粉,花授粉后,花梗下面會膨大,然后結果,等果實長到九月底,果莢就可采摘下來進 行播種繁殖,所述果莢選擇原則:果實飽滿,無病蟲害,沒有破裂的;在晴天中午或下午選 摘果莢,在雨天、陰天或露水未干時不宜采摘; (2) 外植體消毒:將霍山石斛果莢采回來后,先將果莢的首尾多余的部分用刀片去掉, 用75%的酒精棉擦拭果莢的表面及溝紋,將污垢和塵土擦拭干凈后,把沒有裂開果莢放到 消毒好的燒杯中,先放稀釋10倍的次氯酸鈉消毒液沒過果莢,加一滴展著劑,充分搖蕩,消 毒10分鐘,再以無菌水沖洗三到四次,備用; (3) 接種培養(yǎng):將備用好的果莢放入母液培養(yǎng)基中進行培養(yǎng); (4) 繼代培養(yǎng):霍山石斛種子播種后10天,胚即吸水膨大,逐漸漲破種皮,形成淡黃色 的圓球體;30天后頂端分生組織突出,慢慢變綠,下半部有散射狀的吸收毛分布;播種40 天,第一片擬葉形成,播種90天左右,由莖頂基部分化長出根;此時就可繼代培養(yǎng),轉入繼 代培養(yǎng)基中培養(yǎng); (5) 壯苗培養(yǎng):經(jīng)過3個月的培養(yǎng)后,小苗長成具有2厘米長的莖時,再換入促進小苗 生長的壯苗培養(yǎng)基中,每瓶45株,在經(jīng)過3個月的培養(yǎng)待新芽長到4厘米時就可出瓶種植, 霍山石斛從播種到出瓶種植約9個月; (6) 培養(yǎng)室管理:無菌培養(yǎng)室使用前一個星期,先把培養(yǎng)室的衛(wèi)生打掃干凈,用農(nóng)藥進 行熏蒸,關閉三天后開門通風,再用臭氧機消毒6小時,次天就可擺苗進去,培養(yǎng)室的溫度 常年在25度,冷熱都由空調(diào)控制,光照在20001uX,有燈光控制,無菌培養(yǎng)室要時刻保持干 凈衛(wèi)生,定期打掃,消毒; (7) 不定芽誘導,增殖技術: _;;培養(yǎng)基的準備: 選擇適合的培養(yǎng)基配方進行配置,調(diào)PH值在5. 6之間,在121 °C,內(nèi)室壓力在0. 115MPa下滅菌20分鐘,備用; S外植體的滅菌: 選擇高為4厘米的健康植株,用刀片小心取出石斛的幼莖剝?nèi)ネ饷婀?jié)上的幾張葉片和 包衣,放到洗滌劑中清洗,在清水清洗,放在10%次氯酸鈉溶液中加兩滴吐溫20,清洗15分 鐘,然后用蒸餾水沖洗3次; +f接種: 把滅菌好的莖尖種在預先準備好的初始培養(yǎng)基上,一個試管接一個莖尖,培養(yǎng)30天左 右,存活的莖尖轉