一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品領域，具體涉及一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法。
【背景技術】
[0002] 霍山石斛是我國瀕臨滅絕的珍稀物種，被譽為"中華仙草"之首，是霍山縣獨有的、 擁有原產(chǎn)地地理標志的名貴中藥材，具有極高的藥用保健價值，具有生津益明、清熱養(yǎng)陰、 消炎止痛、清音明目功能及抗癌、抗衰老、抗輻射和增強免疫力等功效，尤其霍山石斛多糖 具有極高的保健和醫(yī)療作用。但由于其生境狹窄，繁殖困難，植株數(shù)量極少，因此人工種植 霍山霍山石斛具有廣闊的前景，但缺乏優(yōu)質(zhì)種苗是霍山霍山石斛種植業(yè)的瓶頸之一。雖然 國內(nèi)早有關于霍山霍山石斛種苗生產(chǎn)的專利和文獻報道，但是卻沒有見到利用試管開花授 粉結果的方法來繁殖霍山霍山石斛的。
[0003] 由于野外的種種環(huán)境因素制約，受氣候影響較大，且病蟲害嚴重且難以防治，野生 的霍山石斛瀕臨滅絕，屬于國家級珍惜名貴中藥材，野外養(yǎng)殖繁殖率低，且成本較高。
[0004] 用霍山石斛種子培養(yǎng)出來的苗，一般稱為實生苗，其特點是變異度比較大，植株形 狀不太穩(wěn)定，成本低，產(chǎn)量大，周期短。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)： 一種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于包括以下內(nèi)容： (1) 果莢選擇：霍山石斛的花期在每年的四月中旬到五月中旬，這一段時期對霍山石斛 進行授粉，花授粉后，花梗下面會膨大，然后結果，等果實長到九月底，果莢就可采摘下來進 行播種繁殖，所述果莢選擇原則：果實飽滿，無病蟲害，沒有破裂的；在晴天中午或下午選 摘果莢，在雨天、陰天或露水未干時不宜采摘； (2) 外植體消毒：將霍山石斛果莢采回來后，先將果莢的首尾多余的部分用刀片去掉， 用75%的酒精棉擦拭果莢的表面及溝紋，將污垢和塵土擦拭干凈后，把沒有裂開果莢放到 消毒好的燒杯中，先放稀釋10倍的次氯酸鈉消毒液沒過果莢，加一滴展著劑，充分搖蕩，消 毒10分鐘，再以無菌水沖洗三到四次，備用； (3) 接種培養(yǎng)：將備用好的果莢放入母液培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； (4) 繼代培養(yǎng)：霍山石斛種子播種后7-14天，胚即吸水膨大，逐漸漲破種皮，形成淡黃 色的圓球體；30天后頂端分生組織突出，慢慢變綠，下半部有散射狀的吸收毛分布；播種40 天，第一片擬葉形成，播種90天左右，由莖頂基部分化長出根；此時就可繼代培養(yǎng)，轉入繼 代培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (5) 壯苗培養(yǎng)：經(jīng)過2-3個月的培養(yǎng)后，小苗長成具有2厘米長的莖時，再換入促進小 苗生長的壯苗培養(yǎng)基中，每瓶45-50株，在經(jīng)過3-4個月的培養(yǎng)待新芽長到3-5厘米時就可 出瓶種植，霍山石斛從播種到出瓶種植約8-10個月； (6) 培養(yǎng)室管理：無菌培養(yǎng)室使用前一個星期，先把培養(yǎng)室的衛(wèi)生打掃干凈，用農(nóng)藥進 行熏蒸，關閉三天后開門通風，再用臭氧機消毒6小時，次天就可擺苗進去，培養(yǎng)室的溫度 常年在24-26度，冷熱都由空調(diào)控制，光照在1800-20001ux，有燈光控制，無菌培養(yǎng)室要時 刻保持干凈衛(wèi)生，定期打掃，消毒； (7) 不定芽誘導，增殖技術： T培養(yǎng)基的準備： 選擇適合的培養(yǎng)基配方進行配置，調(diào)PH值在5. 4-5. 8之間，在121°C，內(nèi)室壓力在 0. 115MPa下滅菌20分鐘，備用； f外植體的滅菌： 選擇高為3-5厘米的健康植株，用刀片小心取出石斛的幼莖剝?nèi)ネ饷婀?jié)上的幾張葉片 和包衣，放到洗滌劑中清洗，在清水清洗，放在10%次氯酸鈉溶液中加兩滴吐溫20,清洗15 分鐘，然后用蒸餾水沖洗3-4次； f接種： 把滅菌好的莖尖種在預先準備好的初始培養(yǎng)基上，一個試管接一個莖尖，培養(yǎng)30天左 右，存活的莖尖轉接到其他的培養(yǎng)基中； I不定芽誘導： 取滅菌以后的莖尖接種到一誘導培養(yǎng)基中，進行誘導不定芽，培養(yǎng)50天左右； I不定芽增殖： 不定芽轉接到增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2個月，倍數(shù)達到3倍以上繼代培養(yǎng)； I原球莖誘導不定芽： 原球莖達到一定量后，可以轉接到催芽培養(yǎng)基中催芽，生長2個月后，芽長到1厘米時 轉接于生根培養(yǎng)基中； _：：生根培養(yǎng)： 苗生長到株高1厘米時，再將小苗轉接到生根培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)，待株高漲到 3-5厘米，有5片以上葉，3-5條根時，就可移出瓶外種植。
[0007] 2.根據(jù)權利要求1所述的霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于：培養(yǎng)基制 備： 母液和培養(yǎng)基的配制，在實驗中常用的培養(yǎng)基，可將其中的各種成分配成10倍、100倍 的母液，放入冰箱中保存； a. 大量兀素混合母液：指濃度大于0. 5mmol/L的兀素，即含隊？、1(、〇3、]\%、3六種 鹽類的混合溶液，配成10倍母液，用時每配1000 ml取100mL母液，配時要注意以下幾點： a.各化合物必須充分溶解后才能混合；b.混合時注意先后順序，特別要將鈣離子與硫酸根 離子，磷酸根離子錯開，以免產(chǎn)生硫酸鈣、磷酸鈣等不溶性化合物沉淀；c.混合時要慢，邊 攪拌邊混合； b. 微量元素混合母液：指小于0. 5mmol/L的元素即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、 Cl鹽類的混合溶液，因含量低，配成100倍甚至1000倍，用時每配1000ml取IOml或lml， 配時也要注意順次溶解后再混合，以免沉淀； c. 鐵鹽母液：鐵鹽必須單獨配制，若同其他無機元素混合配成母液，易造成沉淀，配法 是將5. 57gFeS04. 7H20水溶液緩慢加入到7. 45gNa2 -EDTA微沸水溶液中，并不斷攪拌， 最后定容到1000ml，用時每配1000 ml培養(yǎng)基取5ml; d. 有機化合物母液：含有維生素和氨基酸類物質(zhì)，分別配成單獨的母液，其濃度有每 ml含 0? 1、1.OUOmg化合物； e.植物激素：每種激素必須單獨配制成母液，濃度為每ml含0. 1、0. 5、I.Omg激素，配 法如下：IAAIBAGA3先溶與少量95%酒精，再加水定容到一定濃度；NAA溶于熱水或少量 95%的酒精中，再加水定溶到一定濃度；2,4 一D不溶于水，用Imol的NaOH溶解后，再加水 定容至一定濃度；KIN和BA先溶于少量Imol的HCl中，再加水定容；玉米素先溶于少量 95 %酒精中，再加水至一定濃度， f. 培養(yǎng)基的配置 I混合培養(yǎng)基中的各成分。先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、鐵鹽母 液、有機成分，然后加入植物激素及其他附加成分； +€溶化瓊脂。稱取應加的瓊脂和蔗糖，將瓊脂浸泡到透明后，用蒸餾水加熱燒開熔化瓊 月旨，待瓊脂完全溶化后，把1加入，用pH試紙測pH值，并用0.Imol的NaOH或HCl調(diào)pH為 5. 6-5. 8; f分裝到600ml的蘭花瓶中，120ml/瓶； I在121 °C，壓力在0. 1-0. 115MPa下滅菌20分鐘，取出來放儲藏室，備用。
[0008] 本發(fā)明的有益效果：能徹底改變了野生米斛結實率低的問題，同時解決野外的種 種環(huán)境因素制約，受氣候影響較大，且病蟲害嚴重且難以防治，保護了野生米斛，同時提高 了米斛繁殖率，保護了米斛的繁殖；用原球莖和不定芽培養(yǎng)出來的苗為克隆苗，其特點是能 保持親本的優(yōu)良特性，植株整齊一致，成本高，產(chǎn)量低，周期長，數(shù)代之后會退化，原球莖繼 代要控制在6-8代，不定芽繼代次數(shù)要控制在8-10代。
【具體實施方式】
[0009] -種霍山石斛組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于包括以下內(nèi)容： (1) 果莢選擇：霍山石斛的花期在每年的四月中旬到五月中旬，這一段時期對霍山石斛 進行授粉，花授粉后，花梗下面會膨大，然后結果，等果實長到九月底，果莢就可采摘下來進 行播種繁殖，所述果莢選擇原則：果實飽滿，無病蟲害，沒有破裂的；在晴天中午或下午選 摘果莢，在雨天、陰天或露水未干時不宜采摘； (2) 外植體消毒：將霍山石斛果莢采回來后，先將果莢的首尾多余的部分用刀片去掉， 用75%的酒精棉擦拭果莢的表面及溝紋，將污垢和塵土擦拭干凈后，把沒有裂開果莢放到 消毒好的燒杯中，先放稀釋10倍的次氯酸鈉消毒液沒過果莢，加一滴展著劑，充分搖蕩，消 毒10分鐘，再以無菌水沖洗三到四次，備用； (3) 接種培養(yǎng)：將備用好的果莢放入母液培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； (4) 繼代培養(yǎng)：霍山石斛種子播種后10天，胚即吸水膨大，逐漸漲破種皮，形成淡黃色 的圓球體；30天后頂端分生組織突出，慢慢變綠，下半部有散射狀的吸收毛分布；播種40 天，第一片擬葉形成，播種90天左右，由莖頂基部分化長出根；此時就可繼代培養(yǎng)，轉入繼 代培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (5) 壯苗培養(yǎng)：經(jīng)過3個月的培養(yǎng)后，小苗長成具有2厘米長的莖時，再換入促進小苗 生長的壯苗培養(yǎng)基中，每瓶45株，在經(jīng)過3個月的培養(yǎng)待新芽長到4厘米時就可出瓶種植， 霍山石斛從播種到出瓶種植約9個月； (6) 培養(yǎng)室管理：無菌培養(yǎng)室使用前一個星期，先把培養(yǎng)室的衛(wèi)生打掃干凈，用農(nóng)藥進 行熏蒸，關閉三天后開門通風，再用臭氧機消毒6小時，次天就可擺苗進去，培養(yǎng)室的溫度 常年在25度，冷熱都由空調(diào)控制，光照在20001uX，有燈光控制，無菌培養(yǎng)室要時刻保持干 凈衛(wèi)生，定期打掃，消毒； (7) 不定芽誘導，增殖技術： _；；培養(yǎng)基的準備： 選擇適合的培養(yǎng)基配方進行配置，調(diào)PH值在5. 6之間，在121 °C，內(nèi)室壓力在0. 115MPa下滅菌20分鐘，備用； S外植體的滅菌： 選擇高為4厘米的健康植株，用刀片小心取出石斛的幼莖剝?nèi)ネ饷婀?jié)上的幾張葉片和 包衣，放到洗滌劑中清洗，在清水清洗，放在10%次氯酸鈉溶液中加兩滴吐溫20,清洗15分 鐘，然后用蒸餾水沖洗3次； +f接種： 把滅菌好的莖尖種在預先準備好的初始培養(yǎng)基上，一個試管接一個莖尖，培養(yǎng)30天左 右，存活的莖尖轉