一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，是一種利用細胞培養(yǎng)反應器懸浮培養(yǎng)霍山石斛細胞來生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法。包括以下步驟：(1)單細胞制備,(2)單細胞系培養(yǎng),(3)細胞群放大培養(yǎng)，(4)提取霍山石斛多糖：當細胞密度達到60000?80000個/ml收集霍山石斛細胞，提取霍山石斛多糖。本發(fā)明能夠大幅度縮短細胞培養(yǎng)周期，提高霍山石斛多糖產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及霍山石斛技術領域，尤其涉及一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法。
【背景技術】
[0002]霍山石斛多糖類是霍山石斛的主要成分之一，霍山石斛多糖的藥理作用主要表現(xiàn)在免疫、強壯、抗衰老、抗腫瘤等作用。隨著社會發(fā)展，人們對健康的關注越來越高，其需求量也會越來越大，但傳統(tǒng)霍山石斛多糖的提取方法是用霍山石斛屬植物的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來市場對霍山石斛精深加工的需求。
[0003]隨著植物細胞工程技術的發(fā)展，用細胞進行人工培養(yǎng)擴增提取植物的代謝產(chǎn)物，可以不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細胞工程技術生產(chǎn)霍山石斛多糖的技術，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過程中存在很多難題問題，如工藝復雜、生物量增速低、目標產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長等。關于利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)霍山石斛細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的研究還沒有報道，因此開發(fā)一種高效生產(chǎn)霍山石斛多糖類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術手段去解決上述技術問題的:一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，包括以下步驟:
[0006](I)單細胞制備:取霍山石斛蒴果消毒后用固體培養(yǎng)基進行無菌播種，待萌發(fā)成原球莖后取出，采用酶解法分離制備單細胞，并離心過濾除雜，收集單細胞；
[0007](2)單細胞系培養(yǎng):將收集到的單細胞接種到第一 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0008](3)細胞群放大培養(yǎng):將培養(yǎng)好的單細胞系接種于第二 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);所述第二 MS液體培養(yǎng)基中的P元素含量為MS液體培養(yǎng)基的2-3倍，所述第二 MS液體培養(yǎng)基中還添加有l(wèi)-2mg//L的鍺元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值為5.8 土
0.4。
[0009]使用本發(fā)明的第二MS液體培養(yǎng)基，相對于MS液體培養(yǎng)基能延長分批培養(yǎng)細胞生長時間2倍以上，提高細胞密度2倍以上。鍺元素、砸元素、酸水解酪蛋白能夠顯著增加霍山石斛懸浮細胞的鮮重、提高蛋白質和葉綠素的含量，使細胞抗氧化活性明顯升高。
[0010](4)提取霍山石斛多糖:當細胞密度達到60000-80000個/ml，采用離心收集霍山石斛細胞;再提取霍山石斛多糖。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟(I)播種采用的培養(yǎng)基為適合蘭科植物生長的固體培養(yǎng)基。
[0012]優(yōu)選地，所述固體培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。1/2MS培養(yǎng)基中大量元素減半，適合蘭科植物種子萌發(fā)。
[0013]優(yōu)選地，所述步驟(2)中單細胞接種量為25 土 2g/L，光強度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，溫度22 ± 2 °C，當細胞密度達到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)。該光強度范圍有助于細胞的形態(tài)建成和活力提升，過高則浪費電能，過低則達不到效果。該色溫為暖光，藍紫光較為均衡，有利于代謝產(chǎn)物的合成。該溫度范圍為霍山石斛生長和代謝最為均衡的溫度。該密度下，細胞的群體生長處于指對數(shù)時期，即活力最旺盛的時期。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(3)中單細胞系接種量為30 土 2g/L，光強度為2000_40001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30 %。
[0015]優(yōu)選地，所述第二MS液體培養(yǎng)基中還添加有0.1-2mg/L ΝΑΑ、0.l_2mg/L 6_BA、50_lOOmg/L果膠酶、10-50mg/L纖維素酶，pH值為5.8 ± 0.4。添加植物生長調節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細胞分裂生長，并防止細胞聚集結塊，保證營養(yǎng)和溶氧和二氧化碳供應均勾、充分。
[0016]優(yōu)選地，所述第一MS液體培養(yǎng)基中的P元素含量為MS液體培養(yǎng)基的2-3倍，pH值為5.8±0.4。
[0017]優(yōu)選地，所述鍺元素來源于GeO2或有機鍺。
[0018]優(yōu)選地，所述砸元素來源于Na2SeO3或有機砸
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明首先對霍山石斛種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細胞，進一步培養(yǎng)成單細胞系，最后進行細胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長調節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細胞分裂生長，并防止細胞聚集結塊，保證營養(yǎng)和溶氧和二氧化碳供應均勻、充分。本發(fā)明能夠大幅度縮短細胞培養(yǎng)周期，提高產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。另外，在細胞群放大培養(yǎng)階段，使用本發(fā)明的第二 MS液體培養(yǎng)基，相對于MS液體培養(yǎng)基能延長分批培養(yǎng)細胞生長時間2倍以上，提高細胞密度2倍以上。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明多糖含量的檢測方法
[0021]1、參照2010版藥典中鐵皮石斛質量標準，對實施例提取的霍山石斛多糖進行分析，具體分析方法如下。
[0022]對照品溶液的制備:取105°C干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量制成每Iml中含I OOyg的溶液，即得。
[0023]標準曲線的繪制:吸取葡萄糖對照品溶液(濃度為0.1g/L) 0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5ml于1mL試管中，分別補加蒸饋水到1.0ml，加5%苯酸溶液Iml，搖勾，再加硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，放入冰浴中冷卻5min，以相應的試劑為空白，在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。以吸收度A為縱坐標，葡萄糖濃度C為橫坐標，作對照曲線，得回歸方程為A = 0.0367C+0.0412，r = 0.9998，線性范圍4.36?21.8yg/mL。
[0024]樣品的測定:稱取本實驗制得的霍山石斛多糖樣品50mg，稀釋至溶液吸光值在標準曲線范圍內(nèi)(10-100倍)稀釋后，按上述方法進行測定。每個樣品測試10次，取線性范圍內(nèi)的值求均值。
[0025]實施例1
[0026]本實施例公開一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，包括以下步驟:
[0027]1、培養(yǎng)階段
[0028](I)單細胞制備
[0029]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0030](2)單細胞系培養(yǎng)
[0031 ]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為23g/L，光強度為20001ux，色溫為4000K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為5.4，溫度20°C，當細胞密度達到10000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0032](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0033]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+0.lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.lmg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+50mg/L中性果膠酶+10mg/L中性纖維素酶+lmg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.02mg/L砸元素(來源于Na2Se03)+0.1g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為28g/L，光強度為20001ux，色溫為4000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.4;補料液為2倍濃度的第二 MS液體培養(yǎng)基;
[0034](4)當細胞密度達到60000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.55g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.1mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.18mg/g，每克鮮細胞中SOD活性302U/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0035]2、提取階段:
[0036](I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0037](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95%乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0038](3)干燥:對第二沉淀在100 0C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為7.66g，收率為15.32%。
[0039]本發(fā)明消毒具體采用的方式是75%酒精消毒Imin，0.1 ^HgCl2消毒15min，無菌水洗滌3次。以下實施例均采用該方法進行消毒。
[0040]本發(fā)明的酶解法分離采用的是現(xiàn)有技術，具體是在20uM蔗糖，1uM MgC12，20uMPH 7.8Tris—HCL緩沖液中，使用果膠酶、纖維素酶對細胞團室溫處理4-8h。并在500rpm、1min條件下離心、清洗后收集單細胞。以下實施例均采用該方法進進行分離。
[0041 ] 實施例2
[0042]1、培養(yǎng)階段
[0043](I)單細胞制備
[0044]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0045](2)單細胞系培養(yǎng)
[0046]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為25g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為5.8，溫度22 °C，當細胞密度達到15000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0047](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0048]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的3倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ lmg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+1.5mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.05mg/L砸元素(來源于Na2SeO3 )+0.13g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0049](4)當細胞密度達到70000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.58g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.0mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.18mg/g，每克鮮細胞中SOD活性317U/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0050]2、提取階段:
[0051 ] (I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0052 ] (2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至I /5體積，加入3倍體積的95 %乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0053](3)干燥:對第二沉淀在100 0C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為8.14g，收率為16.28%。
[0054]實施例3
[0055]1、培養(yǎng)階段
[0056](I)單細胞制備
[0057]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0058](2)單細胞系培養(yǎng)
[0059]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為27g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為6.2，溫度24°C，當細胞密度達到20000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0060](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0061]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+ 2mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 2mg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤) + 100mg/L中性果膠酶+50mg/L中性纖維素酶+2mg/L的鍺元素(來源于有機鍺)+0.lmg/L砸元素(來源于125603)+0.2g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為32g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在6.2;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0062](4)當細胞密度達到80000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.59g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量11.8mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.20mg/g，每克鮮細胞中SOD活性323U/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆?。細胞達到該密度后，就不能繼續(xù)增加了密度了，達到30L氣升式發(fā)酵罐的攪動極限。
[0063]2、提取階段
[0064](I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0065](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95%乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0066](3)干燥:對第二沉淀在100°C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為9.06g，收率為18.12%。
[0067]實施例4
[0068]丨、培養(yǎng)階段
[0069](I)單細胞制備
[0070]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0071](2)單細胞系培養(yǎng)
[0072]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為24g/L，光強度為25001ux，色溫為4500K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為5.6，溫度21°C，當細胞密度達到12000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0073](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0074]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+0.5mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.7mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+20mg/L中性纖維素酶+1.8mg/L的鍺元素(來源于有機鍺)+0.06mg/L砸元素(來源于有機砸)+0.16g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為29g/L，光強度為25001UX，色溫為4500K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30 %，溶⑶2在3 %，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.9;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0075](4)當細胞密度達到60000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.54g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.2mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細胞中SOD活性298U/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0076]2、提取階段:
[0077](I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0078](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95%乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0079](3)干燥:對第二沉淀在100 0C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為8.14g，收率為16.28%。
[0080]實施例5[0081 ]丨、培養(yǎng)階段
[0082](I)單細胞制備
[0083]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0084](2)單細胞系培養(yǎng)
[0085]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為25g/L，光強度為30001ux，色溫為4400K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為5.7，溫度22°C，當細胞密度達到18000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0086](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0087]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.2mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+60mg/L中性果膠酶+25mg/L中性纖維素酶+1.8mg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.08mg/L砸元素(來源于有機砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為20001ux，色溫為5200K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0088](4)當細胞密度達到60000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.58g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量11.9mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.18mg/g，每克鮮細胞中SOD活性33 lU/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0089]2、提取階段:[°09°] (I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0091](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95%乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0092](3)干燥:對第二沉淀在100°C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為8.35g，收率為16.70%。
[0093]實施例6
[0094]1、培養(yǎng)階段
[0095](I)單細胞制備
[0096]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0097](2)單細胞系培養(yǎng)
[0098]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為26g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為6.1，溫度20°C，當細胞密度達到12000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0099](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0100]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的3倍)+0.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸) + 1.4mg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+6 Omg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+2mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.05mg/L砸元素(來源于有機砸)+0.18g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基;
[0101](4)當細胞密度達到60000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.56g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.lmg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.18mg/g，每克鮮細胞中SOD活性317U/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0102]2、提取階段:
[0103](I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0104](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95%乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0105](3)干燥:對第二沉淀在100 0C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為8.llg，收率為16.22%。
[0106]實施例7
[0107]1、培養(yǎng)階段
[0108](I)單細胞制備
[0109]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0110](2)單細胞系培養(yǎng)
[0111]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為26g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調pH值為6.2，溫度23°C，當細胞密度達到13000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0112](3)細胞群放大培養(yǎng):
[0113]將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+ 1.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.8mg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+35mg/L中性纖維素酶+1.6mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.lmg/L砸元素(來源于有機砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節(jié)補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.6;補料液為2倍濃度的第二 MS液體培養(yǎng)基；
[0114](4)當細胞密度達到70000個/ml即停止培養(yǎng)，時間15天，采用100rpm低速離心，I Omin，收集霍山石斛細胞，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細胞鮮重0.50g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.2mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細胞中SOD活性314U/g，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0115]2、提取階段:
[0116](I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0117](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95 %乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0118](3)干燥:對第二沉淀在100 0C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的石斛多糖的重量為8.31g，收率為16.62%。
[0119]對比例I
[0120]選取播種生長8個月的霍山石斛組培苗，將組培苗洗凈瀝干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0121](I)水提:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末50g，加入10倍質量的水，沸水浸提2h，4000rpm/min，離心1min，獲得第一上清液和第一沉淀，收集第一上清液；
[0122](2)醇沉:將上述的第一上清液減壓濃縮至1/5體積，加入3倍體積的95%乙醇充分混合后靜置，4000rpm/min，離心1min，獲得第二上清液和第二沉淀；
[0123](3)干燥:對第二沉淀在100°C干燥至恒重，獲得可溶性霍山石斛多糖粉。稱量得到的霍山石斛多糖的重量為8.28g，收率為16.57%。
[0124]通過上述的培養(yǎng)和提取，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)法在細胞培養(yǎng)15天后生產(chǎn)的霍山石斛多糖在收率上可以接近甚至超過同期播種生長8個月的組培苗生產(chǎn)的霍山石斛多糖。
[0125]本發(fā)明的方法不限制霍山石斛多糖的生產(chǎn)，還適用于其他食用或藥用石斛屬植物多糖的生產(chǎn)。本發(fā)明的第一 MS液體培養(yǎng)基為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基或者P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基P兀素2-3倍的培養(yǎng)基。
[0126]以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)單細胞制備:取霍山石斛蒴果消毒后用固體培養(yǎng)基進行無菌播種，待萌發(fā)成原球莖后取出，采用酶解法分離制備單細胞，并離心過濾除雜，收集單細胞； (2)單細胞系培養(yǎng):將收集到的單細胞接種到第一MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (3)細胞群放大培養(yǎng):將培養(yǎng)好的單細胞系接種于第二MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);所述第二MS液體培養(yǎng)基中的磷兀素含量為MS液體培養(yǎng)基的2-3倍，所述第二 MS液體培養(yǎng)基中還添加有l(wèi)-2mg/L的鍺元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值為5.8 土0.4； (4)提取霍山石斛多糖:當細胞密度達到60000-80000個/ml，采用離心收集霍山石斛細胞;再提取霍山石解多糖。2.根據(jù)權利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述步驟(I)播種采用的培養(yǎng)基為適合蘭科植物生長的固體培養(yǎng)基。3.根據(jù)權利要求2所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基。4.根據(jù)權利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述步驟(2)中單細胞接種量為25 土 2g/L，光強度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，溫度22 ± 2 °C，當細胞密度達到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)。5.根據(jù)權利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述步驟(3)中單細胞系接種量為30 土 2g/L，光強度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，溫度22±2°C，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%。6.根據(jù)權利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述第二液體MS培養(yǎng)基中還添加有0.l-2mg/L NAA、0.l_2mg/L 6-BA、50_100mg/L果膠酶、10-50mg/L纖維素酶，pH值為5.8 ± 0.4。7.根據(jù)權利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述鍺元素來源于GeO2或有機鍺。8.根據(jù)權利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)霍山石斛多糖的方法，其特征在于，所述砸元素來源于冗25603或有機砸。
【文檔編號】C12P19/04GK105861589SQ201610353014
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】鄧輝, 陳乃富, 陳存武, 韓邦興, 王廣林
【申請人】皖西學院