專利名稱：一種植物誘抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)，特別提供了一種通過(guò)微生物發(fā)酵結(jié)合一定條件下的酶法降解獲得具有寡糖等生物活性成分的植物誘抗劑，并應(yīng)用于大豆、棉花等作物病害防治技術(shù)。
活性寡聚糖是一類由2-15個(gè)單糖組成，具一定結(jié)構(gòu)和生物活性的聚合體，一般認(rèn)為活性寡聚糖具有調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、防病和抗病等方面的功能，能夠刺激植物的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，每種活性寡聚糖可發(fā)出調(diào)節(jié)特定功能的信息，激活防御反應(yīng)和調(diào)控植物生長(zhǎng)，產(chǎn)生具有抗病害的活性物質(zhì)，抑制病害的形成，特別是不同來(lái)源的寡聚糖可針對(duì)不同的病原菌(包括生態(tài)小種)，從而可開(kāi)發(fā)出針對(duì)各類病害的系列寡聚糖農(nóng)藥，解決基因工程遺傳育種也很難解決的病原菌生態(tài)變異小種的問(wèn)題。國(guó)際上研究較多的是植物及微生物細(xì)胞壁多糖降解的寡糖片斷。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物細(xì)胞壁不僅起到防御的結(jié)構(gòu)屏障作用，而且受到病菌感染時(shí)能起到積極防御反應(yīng)。在植物與病原相互作用中，一方面分泌β-1,3葡萄糖酶，殼聚糖酶和幾丁質(zhì)酶直接抑制真菌的生長(zhǎng)；另一方面又分泌多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶和內(nèi)切果膠酶降解植物的細(xì)胞壁。用裂解酶能在植物與病原的界面得到這些寡聚糖素證實(shí)了這些片段的確在活體中起著作用。在體外這些糖苷鍵裂解酶能將植物及真菌的細(xì)胞壁降解成活性的寡聚糖素，因而植物的調(diào)節(jié)機(jī)制肯定涉及到了抑制這些酶部分活性使之能在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生寡聚糖素以利于植物的抗病反應(yīng)。所以糖苷鍵裂解酶的抑制劑在寡聚糖誘導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)制中可能起著一定的作用。此過(guò)程中所釋放的酶解片段-病原菌及植物的細(xì)胞壁寡聚糖，很可能就是寡聚糖素在活體中的生成機(jī)制。當(dāng)誘導(dǎo)物被寄主植物識(shí)別后，植物必須產(chǎn)生第二信使來(lái)傳遞膜受體上的信號(hào)至細(xì)胞核內(nèi)，以導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄?？共』蚋胁≈参锲贩N之間的差異并不在它們保衛(wèi)系統(tǒng)的差異，而在于最初的識(shí)別及其后信號(hào)分子產(chǎn)生的質(zhì)或量上的不同，寡聚糖素將能縮小此差異。
現(xiàn)有的含有活性寡聚糖植物誘抗劑的制備，通常采用植物提取或植物組織培養(yǎng)提取的技術(shù)，由于受到土地面積、一年四季、生長(zhǎng)緩慢等因素的限制，大規(guī)模批量化生產(chǎn)幾乎是不可能的。
本發(fā)明的目的是提供一種植物誘抗劑，其具有較高的誘導(dǎo)植物抗性及促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的活性，并且生產(chǎn)成本低廉，污染小，適合于規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種植物誘抗劑，其特征在于該植物誘抗劑主要含有寡聚糖，是通過(guò)下述方法得到的(1)以禾谷鐮孢菌(F.graminearum Schw)為菌種微生物發(fā)酵獲得大量的菌絲體；(2)將發(fā)酵菌絲體在MgSO4鹽溶液中用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、菠蘿蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、殼聚糖酶之一種或多種進(jìn)行酶降解，酶用量0.5-3.0％重量，鹽溶液的濃度為0.01-0.5％,pH3.0-7.0，反應(yīng)溫度15-60℃，反應(yīng)時(shí)間1-10小時(shí)；(3)升溫至80-110℃，熱水抽提5-20小時(shí)。
本發(fā)明中所述菌種禾谷鐮孢菌(F.graminearum Schw)是一種常見(jiàn)的小麥真菌病菌，屬子囊菌，該菌大分生孢子生于單生的近球形側(cè)生瓶狀小梗上或生于繁復(fù)分支的瓶狀小梗上，小梗10-14um×3.5-4.5um.。大分生孢子鐮刀形，腹背明顯。分生孢子無(wú)色，聚集時(shí)粉紅色。培養(yǎng)基表面有時(shí)產(chǎn)生淺紅色至橙色的粘物質(zhì)(粘分生孢子團(tuán))。本發(fā)明所用菌種為普通的已知菌種，如實(shí)施例中采用的菌種分別來(lái)源于江蘇省農(nóng)科院植保所保藏菌株F23禾谷鐮孢菌；中國(guó)菌種保藏中心ACCC30213禾谷鐮孢菌株(F.graminearum Schw)；陜西省農(nóng)科院植保所的GF禾谷鐮孢菌。本發(fā)明所用菌株可在一般的真菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如PDA培養(yǎng)基(去皮切片土豆200g，小火煮沸30分鐘，過(guò)濾，收集濾液，加2.0％葡萄糖及水1000ml)察氏培養(yǎng)基(蔗糖2％,KH2PO40.1％,KCl 0.05％,MgSO40.05％,FeSO40.001％,NaNO30.3％,PH6.7)，只是不同的培養(yǎng)基條件下，其生物量有差異。
為了提高生物量，本發(fā)明優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基如下蛋白胨 0.3-2.0％，黃豆粉 0.5-3.5％，酵母粉 0.2-1.5％，玉米漿 0.2-2.0％，蔗糖 0.5-2.0％，KH2PO40.6-1.5％，MgSO40.1-1.0％，NaCl 0.01-0.5％。
本發(fā)明植物誘抗劑用于防治大豆、煙草、棉花、茄子植物病害時(shí)，可以將該產(chǎn)物浸種、葉面噴施或灌根處理，使用濃度為10-2000ppm。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1．采用具有一定細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的微生物，通過(guò)發(fā)酵過(guò)程可穩(wěn)定地獲得制備活性的寡聚糖原料。
2．利用生物酶解反應(yīng)可獲得較高生物活性的寡聚糖片段。
3．應(yīng)用于農(nóng)作物的病害防治具有高效、無(wú)毒、不污染環(huán)境及不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。
4．在一定程度上能解決病毒病、黃萎病等尚無(wú)有效農(nóng)藥防治的農(nóng)作物病害。
5．原料來(lái)源豐富，生產(chǎn)成本較底，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1 ACCC30213禾谷鐮孢菌在不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵PDA去皮土豆20％，(w/v)成條，小火煮沸30分鐘，八層紗布過(guò)濾，收集濾液，加2.0％葡萄糖即可。F1蛋白胨0.3％，黃豆粉2.0％，酵母粉0.2％，玉米漿0.2％，蔗糖2.0％，玉米淀粉1.5％,KH2PO4 0.6％,MgSO40.1％,NaCl 0.01％。F2蛋白胨0.3％，黃豆粉3.5％，酵母粉0.2％，玉米漿0.2％，蔗糖2.0％,KH2PO40.6％,MgS40.1％,NaCl 0.01％。培養(yǎng)10天，25℃,80rpm其培養(yǎng)結(jié)果為在培養(yǎng)基PDA、F1、F2中培養(yǎng)的生物量(菌絲干重/發(fā)酵液)分別為0.57 1.70 2.13。
實(shí)施例2 GF禾谷鐮孢菌在不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵F2培養(yǎng)基蛋白胨0.3％，黃豆粉3.5％，酵母粉0.2％，玉米漿0.2％，蔗糖2.0％, KH2PO40.6％,MgSO40.1％,NaCl 0.01％。F3培養(yǎng)基蛋白胨0.3％，黃豆粉0.5％，酵母粉0.2％，玉米漿0.2％，蔗糖2.0％，玉米淀粉3.0％，KH2PO40.6％,MgSO40.1％,NaCl 0.01％。F4培養(yǎng)基蛋白胨0.3％，黃豆粉0％，酵母粉0.2％，玉米漿0.2％，蔗糖3.5％，玉米淀粉1.0％,KH2PO40.6％,MgSO40.1％,NaCl 0.01％。培養(yǎng)10天，25℃,80rpm。發(fā)酵結(jié)果表明F2培養(yǎng)基生物量高于培養(yǎng)基F3及F4。
實(shí)施例3 F23禾谷鐮孢菌發(fā)酵放大培養(yǎng)試驗(yàn)在14L的氣升式發(fā)酵罐中，將800mL的該菌株接種于12L的F2培養(yǎng)基中恒溫25℃培養(yǎng)3天，當(dāng)培養(yǎng)到40小時(shí)，生物量可達(dá)到1.4％，尤以最初24小時(shí)菌的繁殖最快，40小時(shí)后增殖緩慢，培養(yǎng)3天比40小時(shí)生物量增加很小。這表明，獲得同樣生物量所需的時(shí)間，放大試驗(yàn)比搖床培養(yǎng)大為縮短。但放大試驗(yàn)所能達(dá)到的最大生物量卻小于搖床培養(yǎng)。這可能是由于供氧情況的不同所致。放大試驗(yàn)連續(xù)培養(yǎng)了三批，結(jié)果基本重復(fù)，未發(fā)現(xiàn)有染菌，表明F23禾谷鐮孢菌具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)能力，且生長(zhǎng)迅速，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)施例4GF禾谷鐮孢菌及ACCC30213禾谷鐮孢菌酶解產(chǎn)物制備在250mL三角瓶中加入100mL培養(yǎng)液，分別將GF禾谷鐮孢菌及ACCC30213禾谷鐮孢菌的液體菌種接種到F2培養(yǎng)基中，接種量10mL，在25℃下，80rpm搖床培養(yǎng)10天，分別離心、收集菌絲體，用水沖洗干凈，然后真空抽濾，烘干后粉碎過(guò)篩，獲得菌粉。將所得菌粉分別加入0.6M的硫酸鎂中，按1.0％(對(duì)底物)加入幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶、纖維素酶復(fù)合酶酶，40℃下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在100℃的水浴中加熱10分鐘滅活，70℃浸提，4000rpm離心去沉淀，分別得到GF禾谷鐮孢菌和ACCC30213禾谷鐮孢菌的酶解產(chǎn)物。
實(shí)施例5 F23禾谷鐮孢菌發(fā)酵菌粉酶降解放大試驗(yàn)在25L的攪拌式反應(yīng)釜中，投發(fā)酵菌粉260克，幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶、纖維素酶、菠蘿蛋白酶、脂肪酶的復(fù)合酶26克和適量的0.6M硫酸鎂，攪拌速度100rpm，溫度37℃，酶解3小時(shí)。發(fā)現(xiàn)放大試驗(yàn)所得酶解液誘導(dǎo)小麥PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性(表征植物抗病性指標(biāo))與100mL反應(yīng)瓶中一致(表1)，這表明F23禾谷鐮孢菌粉酶解反應(yīng)的放大效應(yīng)較小。
表1酶解放大試驗(yàn)與搖瓶反應(yīng)的PAL活性
實(shí)施例6 F23禾谷鐮孢菌酶降解物對(duì)植物PAL抗性酶生物活性的影響將小麥、大豆種子清洗干凈后，加8％NaClO消毒10min，無(wú)菌水沖洗3遍后待用。棉花種子用濃硫酸脫絨后，用水清洗干凈8％NaClO消毒30min，無(wú)菌水沖洗3遍后，55℃溫水中浸泡30min，晾干備用。
取酶提液0.4ml于干凈的試管中，加2ml冷的0.1M硼酸緩沖液(PH8.8，內(nèi)含巰基乙醇5mmol/L)。提取液加1ml 20mM的L-苯丙氨酸，對(duì)照加1ml水，充分混合后，在35℃的水浴中反應(yīng)45分鐘后滅活測(cè)定，以反應(yīng)產(chǎn)物-反式-肉桂酸(t-cinnamic acid)每小時(shí)的OD290為0.01為一個(gè)活性單位(U)。
不同濃度處理小麥、大豆、棉花種子催芽生長(zhǎng)后，其幼苗體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性與對(duì)照相比有了不同程度的提高。F23禾谷鐮孢菌酶降解物六個(gè)濃度處理小麥PAL活性均比對(duì)照高，其中以20ug/ml和40ug/ml濃度效果最好。F23禾谷鐮孢菌酶降解物三種濃度處理大豆PAL，以50ug/ml效果最佳，所以PAL活性與對(duì)照相比增幅不大，但是活性濃度范圍應(yīng)在10-100ug/ml之間。
實(shí)施例7 GF禾谷鐮孢菌酶解產(chǎn)物在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)每處理種量800g，加1600ml藥液浸泡棉種24小時(shí)，對(duì)照用清水浸種24小時(shí)，浸種期間攪拌2次，以便處理均勻。處理后撈出種子瀝盡水，播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，每缽3粒種子，每處理1000個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽，按5個(gè)處理設(shè)置小區(qū)，調(diào)查各處理的出苗情況。將營(yíng)養(yǎng)缽苗移至棉花黃萎病重發(fā)田內(nèi)，每處理小區(qū)面積為50平方米，4次重復(fù)，隨機(jī)排列。4月中旬調(diào)查出苗和對(duì)苗病的防治情況，9月上旬調(diào)查黃萎病發(fā)病情況。
試驗(yàn)結(jié)果表明，GF禾谷鐮孢菌粉酶提液對(duì)棉花黃萎病有一定的防效，施藥方式及濃度不同，防治效果不同。噴藥的方式以50ug/ml處理苗期調(diào)查防效63.99％最高，甲基拖布津800倍藥液防效為43.98％。剖桿調(diào)查分別為65.82％和50％。浸種方式，苗期調(diào)查，以50ug/ml處理防效100％最高，甲基拖布津800倍藥液防效為55.5％。剖桿調(diào)查分別為81.8％和63.65％。浸種方式效果優(yōu)于噴藥方式的防效。
實(shí)施例8 禾谷鐮孢菌(ACCC30213)酶解液制劑對(duì)大豆花葉病的防治作用本實(shí)施例采用禾谷鐮孢菌(ACCC30213)為發(fā)酵菌株，按F23禾谷鐮孢菌的發(fā)酵條件，所獲得的菌絲體的酶解液制劑在黑龍江省植保站進(jìn)行了大豆花葉病的標(biāo)準(zhǔn)化田間實(shí)驗(yàn)，其防效達(dá)70％，增產(chǎn)13％。
實(shí)施例9 F23禾谷鐮孢菌酶降解物對(duì)植物內(nèi)生菌的影響將經(jīng)過(guò)硫酸脫絨的棉種，播于直徑15厘米的營(yíng)養(yǎng)缽中，待棉花出苗后用F23禾谷鐮孢菌酶降解物(稀釋200倍)噴霧，每隔3天噴一次。連續(xù)噴5次。最后一次噴完后，分不同時(shí)間取棉莖分離。待對(duì)照出現(xiàn)大量死苗后調(diào)查。以噴清水為對(duì)照。選用牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，采用梯度稀釋平板法進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下F23禾谷鐮孢菌酶降解物對(duì)棉莖體內(nèi)細(xì)菌群落的影響
由表可知，噴寡聚糖后棉莖體內(nèi)細(xì)菌群落數(shù)量顯著下降，等到后期又有回升。
權(quán)利要求
1.一種植物誘抗劑，其特征在于該植物誘抗劑主要含有活性寡聚糖，是通過(guò)下述方法得到的(1)以禾谷鐮孢(F.graminearum Schw)為菌種微生物發(fā)酵獲得大量的菌絲體；(2)將發(fā)酵菌絲體在MgSO4鹽溶液中用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、菠蘿蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、殼聚糖酶之一種或多種復(fù)合(每種酶所占比例為1％-51％)進(jìn)行酶降解，酶用量0.5-3.0％重量，鹽溶液的濃度為0.01-0.5％,pH3.0-7.0，反應(yīng)溫度15-60℃，反應(yīng)時(shí)間1-10小時(shí)；(3)升溫至80-110℃，熱水抽提5-20小時(shí)。
2.按照權(quán)利1所述植物誘抗劑，其特征在于所述菌株接種于如下配方的發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨 0.3-2.0％，黃豆粉 0.5-3.5％，酵母粉 0.2-1.5％，玉米漿 0.2-2.0％，蔗糖 0.5-2.0％，KH2PO40.6-1.5％，MgSO40.1-1.0％，NaCl 0.01-0.5％。
3.權(quán)利要求1所述植物誘抗劑用于防治大豆、煙草、棉花、茄子植物病害，其特征在于將該產(chǎn)物浸種、葉面噴施或灌根處理，使用濃度為10-2000ppm。
全文摘要
一種植物誘抗劑,其特征在于該植物誘抗劑主要含有寡聚糖,是通過(guò)下述方法得到的:以禾谷鐮孢(F.graminearum schw)為菌種微生物發(fā)酵獲得大量的菌絲體;將發(fā)酵菌絲體在鹽溶液中酶降解,酶用量0.5—3.0%重量,鹽溶液的濃度為0.01—0.5%,pH3.0—7.0,反應(yīng)溫度15—60℃,反應(yīng)時(shí)間1—10小時(shí);升溫,熱水抽提。本發(fā)明具有較高的誘導(dǎo)植物抗性及促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的活性,并且生產(chǎn)成本低廉,污染小,適合于規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1303602SQ9912258
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月1日
發(fā)明者杜昱光, 白雪芳, 余露, 張銘俊, 劉曉, 林曉蓉, 李曙光, 曲天明, 虞星炬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所