1.一種蕨類孢子的消毒及接種方法,其特征在于該方法先收集蕨類孢子,把蕨類孢子葉裝入硫酸紙袋中,標(biāo)記代號后置于通風(fēng)干燥處,待孢子自由脫落;把DNA純化柱,規(guī)格:吸附柱1ml、收集管2ml、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用;用對折過的硫酸紙收集脫落在紙袋中的孢子,簡單的去除雜質(zhì)碎葉、環(huán)帶、鱗毛后沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中,蓋好蓋子,放入收集管中,并做好標(biāo)記,放置于離心管架上;在無菌條件下,加入600μl 75%乙醇,倒立純化柱1-2次,之后200-1200rpm離心20s;從加乙醇開始,直到完成離心,整個操作過程控制在25-35s內(nèi);倒棄收集管中廢液,在無菌條件下加入600μl無菌水,反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁,充分漂洗孢子,然后200-1200rpm離心20s,重復(fù)1-2次,洗脫乙醇;倒棄收集管中廢液,在無菌條件下加入600μl 0.1-0.2%氯化汞滅菌2-4min或2%次氯酸鈉消毒6-8min,反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌,然后200-1200rpm離心20s;倒棄收集管中廢液,在無菌條件下加入600μl無菌水,反復(fù)吸打使孢子懸濁,充分漂洗孢子,然后200-1200rpm離心20s,此操作重復(fù)3-4次,使消毒液徹底洗脫;再向離心之后的吸附柱中添加600μl無菌水,反復(fù)吸打使之呈孢子懸濁液,吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上,實(shí)現(xiàn)接種。
2.一種蕨類孢子的消毒及接種方法,其特征在于該方法包括下述步驟:
步驟1:收集孢子,把蕨類孢子葉片裝入硫酸紙袋中,標(biāo)記代號后置于通風(fēng)干燥處,等孢子自由脫落;
步驟2:把DNA純化柱,規(guī)格:吸附柱1ml,收集管2ml、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用;
步驟3:在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙,把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上,輕微抖動擦鏡紙進(jìn)行簡單的過濾,孢子可以通過擦鏡紙的孔隙,而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質(zhì)會留在擦鏡紙上達(dá)到簡單過濾的目的,然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中,蓋好蓋子,放入收集管中,做好標(biāo)記,放置于離心管架上;
步驟4:在無菌操作臺上,打開吸附柱蓋,用1ml移液槍加入600μl 75%乙醇,蓋好蓋子消毒30s,期間倒立純化柱1-2次,在孢子消毒的同時,吸附柱內(nèi)部也得到滅菌,然后200-1200rpm離心20s,加乙醇,倒立純化柱,離心完成盡量控制在30s內(nèi);
步驟5:取出吸附柱,倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中,放置于離心管架上。在無菌操作臺中,打開吸附柱蓋,用1ml移液槍加入600μl無菌水,反復(fù)吸打溶液充分漂洗孢子,然后200-1200rpm離心20s,重復(fù)1-2次;
步驟6:取出吸附柱,倒棄收集管中廢液,吸附柱放回收集管中,放置于離心管架,在無菌操作臺中,打開吸附柱蓋,用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2%氯化汞滅菌2-4min或2%次氯酸鈉消毒6-8min,反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌,然后200-1200rpm離心20s;
步驟7:取出吸附柱,倒棄收集管中廢液,吸附柱放回收集管中,放置于離心管架上,在無菌操作臺中,打開吸附柱蓋,此時吸附柱及孢子已經(jīng)過乙醇,氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài),用1ml移液槍加入600μl無菌水,反復(fù)吸打使孢子懸濁,充分漂洗孢子,然后200-1200rpm離心20s;
步驟8:重復(fù)步驟7,3-4次;
步驟9:用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中,反復(fù)吸打使之呈孢子懸濁液,吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上;
步驟10:把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天,再移至光照條件培養(yǎng)2周后孢子萌發(fā)。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種蕨類孢子的消毒及接種方法在蕨類離體保存過程中的應(yīng)用。