本發(fā)明屬于醫(yī)藥研究開發(fā)利用領(lǐng)域，具體涉及一種CPT-Ⅱ在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是除酒精和其他明確的損肝因素外，所致的以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主、肝臟脂質(zhì)蓄積過多的臨床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝及演變的脂肪性肝炎和肝硬化，按肝脂肪超過肝重程度分為輕度、中度和重度脂肪肝。NAFLD已是歐、美、日等國慢性肝病的首要病因，也是我國除乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染外，肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，國內(nèi)外有關(guān)研究學(xué)說眾多，主要有胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞因子過表達(dá)、脂質(zhì)代謝紊亂和鐵超載等，除此，遺傳、環(huán)境、免疫和藥物等對(duì)NAFLD的發(fā)生均有影響，NAFLD主要表現(xiàn)為脂代謝紊亂。

在正常脂代謝過程中，體內(nèi)脂肪酸活化生成?；鵆oA，通過肉毒堿運(yùn)載進(jìn)入線粒體才能氧化供能。位于線粒體內(nèi)膜肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ（Carnitine palmitoyltransferase-II，CPT-II）是脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化的關(guān)鍵酶。在線粒體外膜脂肪酸與CoA借助線粒體外膜肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-I（CPT-Ⅰ），將脂酰和肉毒堿轉(zhuǎn)變?yōu)橹Ｈ舛緣A，經(jīng)內(nèi)膜CPT-II作用進(jìn)入基質(zhì)轉(zhuǎn)換為脂酰CoA進(jìn)行β-氧化供能，而肉毒堿則再穿過線粒體內(nèi)膜，與內(nèi)源性或外源性酰基CoA結(jié)合，防止后者堆積造成細(xì)胞中毒。

目前已有研究，體內(nèi)長鏈脂肪酸須肉毒堿轉(zhuǎn)運(yùn)通過線粒體內(nèi)膜進(jìn)入基質(zhì)氧化，足量肉毒堿對(duì)脂肪酸氧化供能極為重要。肝炎病毒感染后需要內(nèi)源性代謝物與肉毒堿競爭結(jié)合，抑制CPT-II表達(dá)或減低酶活性，出現(xiàn)肉毒堿缺乏、?；鵆oA和脂肪酸積聚，損傷線粒體，導(dǎo)致能量代謝障礙，在此過程中，如肉毒堿缺乏，血游離脂肪酸就會(huì)增多，導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪積滯，生成異常的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物二羧酸，加重線粒體損傷。

近年來，NAFLD與HCC之間的關(guān)聯(lián)已引起臨床的高度重視，有文獻(xiàn)報(bào)道以先天性肉毒堿缺乏鼠（Juvenile Visceral Steatosis，JVS）制作動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)無論是雜合子（jvs/wt）或純合子（jvs/jvs）鼠，均出現(xiàn)嚴(yán)重的肝脂肪積聚。肝細(xì)胞發(fā)生脂肪積聚是多因素、多階段的動(dòng)態(tài)變化過程，肝脂肪積聚與位于線粒體膜內(nèi)側(cè)的CPT-II活性密切相關(guān)，CPT-II控制脂肪進(jìn)入線粒體氧化，該酶對(duì)熱敏感，受過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）家族調(diào)控，且存多種變異。酶的催化功能是否正常，直接影響到脂肪氧化供能。然而，CPT-II活性高低與脂肪積聚關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報(bào)道過，在脂肪積聚狀態(tài)下肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)與改變尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種CPT-II在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用，動(dòng)態(tài)觀察了肝組織CPT-II表達(dá)與改變，從新角度探討脂代謝異常與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種CPT-Ⅱ在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用。

其中，CPT-Ⅱ在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用，包括如下步驟：

（1）動(dòng)物分組：任挑10只雄性Sprague-Dawley大鼠為對(duì)照組，然后以6只雄性Sprague-Dawley大鼠為一組，隨機(jī)分配成至少8組脂肪肝組和至少8組誘癌組；

（2）模型制備：脂肪肝組大鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)，誘癌組大鼠予以高脂飼料加0.05%的2-乙基氨基芴顆粒飼料喂養(yǎng)，每兩周取1只正常鼠、一組脂肪肝鼠和一組誘癌鼠，細(xì)分成對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組，各組大鼠以乙醚麻醉，經(jīng)鼠腹心臟抽取全部血液，分離出血清置-18～-25℃保存；

摘取對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的鼠肝組織，都分成至少3份備用；

（3）血液酶學(xué)及脂質(zhì)檢測：定量測定步驟（2）中對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠血液分離出的鼠血清中總膽固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的吸光度值（A），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量；

（4）肝組織脂肪染色：步驟（2）中對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的鼠肝組織各取一份于液氮速凍后-80℃保存，冰凍切片，然后以油紅O試劑進(jìn)行脂肪染色，在光鏡下進(jìn)行觀察、攝片，通過圖像分析系統(tǒng)，測定每個(gè)視野的紅色區(qū)域的面積與該視野總面積的比值，以代表每個(gè)肝組織中脂肪的相對(duì)含量，進(jìn)行圖像分析半定量研究；

（5）肝組織蛋白制備與濃度測定：分別稱取步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織，剪碎，加入磷酸鹽緩沖液在冰浴中充分勻漿，勻漿后在冰浴中靜置，轉(zhuǎn)移至EP管中，利用4℃離心機(jī)分離上清，通過BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在分光光度計(jì)上562 nm處測吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出肝組織總蛋白濃度；

（6）肝CPT-II濃度定量分析：根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法檢測肝CPT-II濃度，設(shè)空白孔校零，向微孔板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和肝組織勻漿上清液，孵育；棄去液體加入生物素化的CPT-II抗體，二次孵育；洗板后加入HRP標(biāo)記的親和素，三次孵育；徹底洗滌后加入TMB底物避光顯色，加入稀硫酸終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀上，于450nm波長下測定吸光度A，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每一樣品的CPT-II蛋白濃度，再以肝組織勻漿上清液中CPT-II蛋白濃度與總蛋白濃度之比，計(jì)算肝組織CPT-II比濃度；

（7）病理組織學(xué)分析：步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織各取一份置于9～12%中性福爾馬林中固定，然后取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、常規(guī)切片后經(jīng)蘇木素-伊紅染色，光鏡觀察、攝片，進(jìn)行病理組織學(xué)分析；

（8）肝CPT-Ⅱ免疫組織化學(xué)染色：免疫組織化學(xué)采用非生物素檢測，石蠟切片脫蠟、水化，自來水沖洗；抗原修復(fù)；步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織各取一份加過氧化物酶阻斷劑室溫孵育8～12min，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗；加入兔抗鼠CPT-Ⅱ單克隆抗體3～5℃過夜，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20～40min，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗；加酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育20～40min，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗；加新鮮配置的DAB顯色試劑顯色；自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，磷酸鹽緩沖液PBS返藍(lán)，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察、攝片，通過圖像分析系統(tǒng)測定每個(gè)視野的累積積分光密度值及有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積，計(jì)算光密度平均值，取其平均值代表肝組織中CPT-II表達(dá)的相對(duì)水平，進(jìn)行圖像分析半定量研究。

上述的CPT-Ⅱ在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用，還包括步驟（8）之后的步驟（9）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M ± SD)表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)，以 P<0.05表示差異。

優(yōu)選的，步驟（5）的具體操作如下：（5）肝組織蛋白制備與濃度測定：步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織，各稱取濕重80～100mg，剪碎，加入8～1.0ml磷酸鹽緩沖液在冰浴中充分勻漿，勻漿后在冰浴中靜置20～40 min，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，利用4℃離心機(jī)離心5000×g，5 min，分離上清，通過BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在分光光度計(jì)上562nm處測吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出肝組織總蛋白濃度。

步驟（6）的具體操作如下：（6）肝CPT-II濃度定量分析：根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法檢測肝CPT-II濃度，設(shè)空白孔校零，向微孔板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和肝組織勻漿上清液80～100μL，35～40℃孵育2～3h；棄去液體加入生物素化的CPT-II抗體，35～40℃孵育0.8～1.5h；洗板后加入HRP標(biāo)記的親和素，35～40℃孵育20～40 min；徹底洗滌后加入TMB底物35～40℃避光顯色8～12min，加入稀硫酸終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀上，于450nm波長下測定吸光度A，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每一樣品的CPT-II蛋白濃度，再以肝組織勻漿上清液中CPT-II蛋白濃度與總蛋白濃度之比，計(jì)算肝組織CPT-II比濃度。

其中，步驟（1）中選用清潔級(jí)、4~6周齡、體量100~120g的雄性Sprague-Dawley大鼠。

其中，步驟（2）中，所述高脂飼料由以下組分按重量百分比組成：豬油10～15%，蛋黃粉10～15%，膽固醇3～5%，膽酸1～3%和普通飼料62～76%。

優(yōu)選的，所述步驟（4）和（8）中的圖像分析系統(tǒng)選用Image Pro Plus 6.0軟件。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下：本發(fā)明通過建立脂肪肝和肝癌動(dòng)態(tài)發(fā)生模型，首次觀察了肝組織脂肪積累狀態(tài)下，以二乙基氨基芴（2-FAA）誘發(fā)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，在此過程中動(dòng)態(tài)觀察了肝組織CPT-II的表達(dá)與改變，從新角度探討脂代謝異常與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系。

附圖說明

圖1A~圖1E分別為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織示意圖；

圖1A₁~圖1E₁分別為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織H&E染色（×200）時(shí)的鏡下觀察圖；

圖2A~圖2E為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織經(jīng)油紅O染色后放大200倍時(shí)的鏡下觀察圖；

圖2A₁~圖2E₁為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織經(jīng)油紅O染色后放大400倍時(shí)的鏡下觀察圖；

圖3為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的鼠肝組織中脂肪含量對(duì)比圖；

圖4為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝CPT-Ⅱ比濃度的對(duì)比圖；

圖5為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組平均吸光度值對(duì)比示意圖；

圖6A~圖6E為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織放大200倍時(shí)的CPT-II的免疫組織化學(xué)分析圖；

圖6A₁~圖6E₁為對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織放大400倍時(shí)的CPT-II的免疫組織化學(xué)分析圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。

一種CPT-Ⅱ在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用，包括如下步驟：

（1）動(dòng)物分組：清潔級(jí)、4~6周齡，體量100~120g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，任挑10只為對(duì)照組，然后以6只雄性Sprague-Dawley大鼠為一組，隨機(jī)分配成8組脂肪肝組和8組誘癌組；

（2）模型制備：脂肪肝組大鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)，誘癌組大鼠予以高脂飼料加0.05%的2-乙基氨基芴（2-fluorenyl acetamide，2-FAA, Sigma，USA）顆粒飼料喂養(yǎng)，每兩周取1只正常鼠、一組脂肪肝鼠和一組誘癌鼠，細(xì)分成對(duì)照組（正常肝細(xì)胞組）、脂肪肝組、變性組（肝細(xì)胞變性組）、癌前組（肝細(xì)胞癌前病變組）和癌變組（肝細(xì)胞癌變組），各組大鼠以乙醚麻醉，經(jīng)鼠腹心臟抽取全部血液，分離出血清置-20℃保存；

摘取對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的鼠肝組織，都分成至少3份備用；

其中，高脂飼料由以下組分按重量百分比組成：豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇4%，膽酸1%和普通飼料75%。

（3）血液酶學(xué)及脂質(zhì)檢測：定量測定步驟（2）中對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠血液分離出的鼠血清中總膽固醇Tch、甘油三酯TG、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT及谷草轉(zhuǎn)氨酶AST的吸光度值A(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量；

（4）肝組織脂肪染色：步驟（2）中對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的鼠肝組織各取一份于液氮速凍后切片，然后以油紅O試劑按試劑盒（南京建成公司）使用說明操作進(jìn)行脂肪染色，在OLYMPUS IX71光鏡下進(jìn)行觀察、攝片，通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測定每個(gè)視野的紅色區(qū)域的面積與該視野總面積的比值，以代表每個(gè)肝組織中脂肪的相對(duì)含量，進(jìn)行圖像分析半定量研究；

（5）肝組織蛋白制備與濃度測定：步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織，各稱取濕重100mg，剪碎，加入1.0ml磷酸鹽緩沖液（PBS）在冰浴中充分勻漿，勻漿后在冰浴中靜置30 min，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，利用4℃離心機(jī)（Thermo Biofuge Primo R）離心5000×g，5 min，分離上清，通過BCA試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）進(jìn)行蛋白濃度測定，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在分光光度計(jì)上562 nm處測吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出肝組織總蛋白濃度；

（6）肝CPT-II濃度定量分析：根據(jù)CPT-II試劑盒(美國CLOUD-CLONE公司)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）說明書上的步驟檢測肝CPT-II濃度，設(shè)空白孔校零，向微孔板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和肝組織勻漿上清液100μL，37℃孵育2 h；棄去液體加入生物素化的CPT-II抗體，37℃孵育1 h；洗板后加入HRP標(biāo)記的親和素，37℃孵育30 min；徹底洗滌后加入TMB底物37℃避光顯色10 min，加入稀硫酸終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀（BioTek Synergy HT）上，于450nm波長下測定吸光度（A），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每一樣品的CPT-II蛋白濃度，再以肝組織勻漿上清液中CPT-II蛋白濃度與總蛋白濃度之比，計(jì)算肝組織CPT-II比濃度；

（7）病理組織學(xué)分析：步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織各取一份置于10%中性福爾馬林中固定，然后取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、常規(guī)切片后經(jīng)蘇木素-伊紅（H&E）染色，光鏡（OLYMPUS BX51）觀察、攝片，進(jìn)行病理組織學(xué)分析；

（8）肝CPT-Ⅱ免疫組織化學(xué)染色：免疫組織化學(xué)采用非生物素檢測，石蠟切片脫蠟、水化，自來水沖洗；抗原修復(fù)；步驟（2）對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組的鼠肝組織各取一份加過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；加入兔抗鼠CPT-Ⅱ單克隆抗體（美國Abcam公司，1:80）4℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；加酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；加新鮮配置的DAB顯色試劑顯色；自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，磷酸鹽緩沖液（PBS）返藍(lán)，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡（OLYMPUS MX53）觀察、攝片，通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定每個(gè)視野的累積積分光密度值及有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積，計(jì)算光密度平均值，取其平均值代表肝組織中CPT-II表達(dá)的相對(duì)水平，進(jìn)行圖像分析半定量研究。

（9）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M ± SD）表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)，以 P<0.05表示差異。

通過上述各步驟，分析CPT-II在脂肪積聚肝細(xì)胞誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用，分析結(jié)果如下：

Ⅰ、鼠肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病理組織學(xué)分析

鼠肝組織及對(duì)應(yīng)的肝組織病理學(xué)H&E染色檢查見圖1，病理組織學(xué)檢查將對(duì)照組、脂肪肝組、變性組、癌前組和癌變組各組大鼠的肝組織分為正常肝細(xì)胞組、脂肪肝組、肝細(xì)胞變性組，癌前病變組和癌變組（圖１A~E）。正常對(duì)照組鼠肝組織呈紅褐色，質(zhì)軟而脆；鏡下肝細(xì)胞呈索狀排列，核仁明顯，核膜清楚，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏，染色較淺，如圖1 A₁所示。脂肪肝組肝臟大體外觀體積略增大，包膜緊張光滑，質(zhì)地柔軟，色黃，有油膩感；鏡下可見胞漿中出現(xiàn)許多大小不等的空泡（脂肪滴），邊界清晰，將細(xì)胞核擠向一側(cè)；肝細(xì)胞體積增大、腫脹，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞與細(xì)胞之間界限不清如圖1B₁所示。變性組肝臟顏色偏黃鏡下肝細(xì)胞核周圍可見許多圓形空泡，可融合為一個(gè)大空泡，可見輕度肝纖維化如圖1C₁所示。癌前組肝臟表面出現(xiàn)少量小結(jié)節(jié)，鏡下發(fā)現(xiàn)假小葉形成，肝細(xì)胞核多形性、核深染、明顯的核仁、多核，不典型增生如圖1D₁所示。癌變組肝臟表面大量大小不一的結(jié)節(jié)彌漫性分布，鏡下腫瘤細(xì)胞排列紊亂成巢狀，細(xì)胞大小不一，核大深染，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形如圖1E₁所示。

Ⅱ、鼠肝細(xì)胞惡化過程中肝脂肪含量的變化

肝組織切片經(jīng)油紅O染色，肝組織切片中脂肪著色的結(jié)果見圖2，對(duì)照組肝組織中未見明顯的油紅O著色，見圖2A和圖2A₁；其余各組鼠肝組織經(jīng)油紅O染色后，均見鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的脂肪積聚，見圖2B~圖2E和圖2B₁~圖2E₁。通過Image-Pro-Plus軟件定量分析，顯示正常鼠肝組織脂肪含量明顯低于脂肪肝組（t=-11.556，P<0.001）、肝細(xì)胞變性組（t=-4.847，P=0.04）、肝細(xì)胞癌前病變組（t=-13.652，P=0.005）和肝細(xì)胞發(fā)生癌變組（t=-10.896，P=0.008），如圖3所示。肝組織中脂肪的相對(duì)定量分析顯示，正常鼠肝中脂肪無明顯染色，而在脂肪肝組，肝細(xì)胞脂肪積聚程度最高，油紅O染色著色最深；誘癌后肝細(xì)胞中脂肪含量估計(jì)僅占脂肪肝組的50%左右，差異十分明顯（P<0.05）。

Ⅲ、肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中血酯變化

在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，SD鼠血脂水平與循環(huán)血肝酶活性變化如表1所示。血清TG，Tch水平明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），血Tch濃度比正常對(duì)照鼠升高2 ~ 3倍，TG升高1.5 ~ 4.53倍。經(jīng)2-FAA誘癌后肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為肝細(xì)胞發(fā)生變性、癌前病變和癌變的發(fā)展過程，伴有肝細(xì)胞損傷，AST及ALT活性顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）的4~8倍。表1中數(shù)據(jù)顯示，除正常對(duì)照鼠外，鼠肝脂肪積聚嚴(yán)重，伴有肝細(xì)胞損傷。

表1肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中血脂水平與肝酶活性變化

*P <0.05,與對(duì)照組相比。

Ⅳ、肝組織CPT-Ⅱ比濃度變化

觀察肝組織CPT-II變化，定量分析了各組大鼠的肝組織CPT-II比濃度，見圖4，即肝組織勻漿上清液中每mg總蛋白中CPT-II蛋白濃度（ng/mg P）。肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中CPT-II的動(dòng)態(tài)變化如圖4所示。CPT-II在對(duì)照組為124.08±26.73ng/mg P、脂肪肝組為92.84±11.18ng/mg P、變性組為39.29±6.33ng/mg P、癌前組為50.49±18.92ng/mg P和癌變組為38.73±14.95ng/mg P。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組肝CPT-II比濃度明顯高于脂肪肝組（t=2.641, P=0.035）、肝細(xì)胞變性組（t=7.559，P<0.001）、癌前病變組（t=5.504，P<0.001）和肝細(xì)胞癌變組（t=6.825，P<0.001）；脂肪肝組CPT-II比濃度明顯高于變性組（t=10.210，P<0.001)、癌前組（t=4.721，P=0.001）和癌變組(t=7.100，P<0.001），顯示在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)展過程中肝組織CPT-II含量逐漸減少。

Ⅴ、肝CPT-II動(dòng)態(tài)表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析

通過Image Pro Plus軟件對(duì)肝組織CPT-II免疫組化進(jìn)行半定量分析，結(jié)果如圖6A~圖6E以及圖6A₁~圖6E₁所示。圖5顯示正常對(duì)照組平均吸光度值為（59.92±14.26）×10^-3，明顯高于脂肪肝組(40.06 ± 11.58)×10^-3;t=2.648,P=0.025)、變性組(6.74±1.66)×10^-3; t=9.071,P<0.001)、癌前組(9.94±3.02)×10^-3;t=8.397,P<0.001)和誘癌組(7.44±2.85)×10^-3;t=8.836, P<0.001)，且脂肪肝組平均吸光度值明顯高于變性組（t=6.976，P<0.001）、癌前組（t=6.166，P<0.001）和癌變組（t=6.698，P<0.001），顯示肝組織CPT-II含量隨肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而呈下調(diào)表達(dá)。

應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)參數(shù)的數(shù)值范圍并不是對(duì)本技術(shù)方案的限定，本發(fā)明的實(shí)施例1也只是一個(gè)最優(yōu)實(shí)施例，其實(shí)驗(yàn)過程中的各具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)值并不是對(duì)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)條件的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象、地理環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員自身?xiàng)l件等因素適當(dāng)?shù)淖儞Q實(shí)驗(yàn)條件，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本技術(shù)方案的啟發(fā)下，只是更改實(shí)驗(yàn)條件而未付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明成功制備了脂肪積聚狀態(tài)下的體內(nèi)模型，首次動(dòng)態(tài)觀察了經(jīng)化學(xué)誘癌肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程中CPT-II的表達(dá)與變化規(guī)律。攝入脂肪后SD鼠肝細(xì)胞見大量脂肪積聚，正常對(duì)照鼠脂肪含量明顯低于脂肪肝鼠、變性組、癌前病變組和癌變組。血清TG，Tch水平明顯高于正常對(duì)照組，TG和Tch升高。經(jīng)2-FAA誘癌后肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為肝細(xì)胞發(fā)生變性、癌前病變和癌變的發(fā)展過程，伴有肝細(xì)胞損傷，AST及ALT活性顯著高于正常對(duì)照組的4~8倍。提示在肝脂肪積聚過程中伴有肝細(xì)胞損傷，也影響到線粒體中脂肪的氧化。

本發(fā)明通過建立脂肪肝和肝臟的大鼠模型，檢測在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中CPT-II變化，發(fā)現(xiàn)脂肪肝模型中CPT-II含量明顯低于正常對(duì)照組，表明肝臟脂質(zhì)積累，脂肪變性會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞CPT-II減少，同時(shí)肝癌鼠CPT-II含量顯著低于脂肪肝，與肝細(xì)胞惡性程度呈負(fù)相關(guān)。肝CPT-Ⅱ比濃度與免疫組織化學(xué)證實(shí)，肝細(xì)胞癌變過程中呈進(jìn)行性降低，表明CPT-Ⅱ低表達(dá)或功能喪失加重肝細(xì)胞脂肪積聚，對(duì)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程起促進(jìn)作用。

綜上所述，CPT-II通過阻斷體內(nèi)脂肪酸的β氧化，造成肝臟脂質(zhì)的積累，而肝脂質(zhì)積累又進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞導(dǎo)致CPT-II含量減少，造成惡性循環(huán)，提示肝細(xì)胞脂肪積聚促進(jìn)了肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。