本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體指一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(dendrobiumcandidumwall.exlindl.)為蘭科(orchidaceae)石斛屬(dendrobium)多年生附生草本植物，因老莖莖節(jié)處呈褐色，又名黑節(jié)草，是一種集觀賞和藥用于一身的名貴珍稀草本植物，具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，為石斛之極品。石斛是我國(guó)古文獻(xiàn)中最早記載的蘭科植物之一，其性味甘淡、微咸，性屬清潤(rùn)，清中有補(bǔ)，補(bǔ)中有清。早在東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》中已記載石斛“主傷中、除痹、下氣、補(bǔ)五臟虛勞羸瘦、強(qiáng)陰、久服厚腸胃”。成書(shū)于一千多年前的道家醫(yī)學(xué)經(jīng)典《道藏》將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首，為歷代帝王夢(mèng)寐以求的寶物，素有“千金草”之稱，馳名中外，被國(guó)際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”，民間稱其為“救命仙草”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛多糖具有增強(qiáng)t細(xì)胞及巨噬細(xì)胞免疫活性的作用，是一種前景可喜的中藥免疫增強(qiáng)劑，并具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗誘變等作用，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。
鐵皮石斛常附生于樹(shù)木或巖石上，植株比較矮小，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，葉片面積小、光合面積小、強(qiáng)度低，尤其是種子極小，胚具后熟現(xiàn)象，因此自然條件下種子難以萌發(fā)(萌發(fā)率低于5％)。在通常的栽培條件下，鐵皮石斛由種子到開(kāi)花需要3～4年，常需與某些真菌共生才能萌發(fā)，很難有實(shí)生苗栽培。而傳統(tǒng)的分株扦插等無(wú)性繁殖方式的成活率低、生長(zhǎng)速度慢、繁殖率低，加之近年來(lái)人們對(duì)野生鐵皮石斛資源的掠奪式采挖，其生境被嚴(yán)重破壞，致使野生鐵皮石斛瀕臨滅絕。
國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了對(duì)野生鐵皮石斛全面的研究，包括化學(xué)成分，藥理活性，人工種植等方面的研究。而鐵皮石斛的培養(yǎng)主要集中在愈傷組織誘導(dǎo)、基本培養(yǎng)條件篩選和理化因子的考查等方面。鐵皮石斛試管苗的繁殖一般要經(jīng)過(guò)類原球莖(protocorm-likebodies，即plbs)階段，而類原球莖實(shí)質(zhì)上是正在生長(zhǎng)分化的體細(xì)胞胚胎，具有與原植株相同的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能。鑒于此，人們提出用類原球莖代替原植株成為新藥源的可能性。然而，已有的研究結(jié)果表明，從鐵皮石斛不同部位誘導(dǎo)出類原球莖的研究還存在誘導(dǎo)率低、分化快和褐變等問(wèn)題尚沒(méi)有解決，目前還沒(méi)有找到一個(gè)切實(shí)有效地培養(yǎng)技術(shù)用以解決鐵皮石斛類原球莖誘導(dǎo)和增殖以及代謝產(chǎn)物控制中存在的疑點(diǎn)和難點(diǎn)，從而影響了鐵皮石斛的深入研究和開(kāi)發(fā)。
天然鐵皮石斛已作為瀕臨滅絕的植物種受到世界以及我國(guó)政府的重點(diǎn)保護(hù)，嚴(yán)禁采摘。為此研究鐵皮石斛類原球莖的培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化顯得十分重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提出一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，繁殖速度快，石斛多糖含量高。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入40～100g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為0.5cc/min～2.0cc/min。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d取出原培養(yǎng)液，并添加新鮮的培養(yǎng)液。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d向反應(yīng)器內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)液。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；所述的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
本發(fā)明具有以下的特點(diǎn)和有益效果：
采用上述技術(shù)方案，該方法容易操作，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。通過(guò)在反應(yīng)器內(nèi)接入合適的鐵皮石斛plbs、向培養(yǎng)液通入合適的通氣量、以及增加新鮮培養(yǎng)液，和野生鐵皮石斛比較石斛多糖含量提高大大提高。通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)鐵皮石斛類原球莖，不變性，產(chǎn)量大，成本低，周期短，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步說(shuō)明。在此需要說(shuō)明的是，對(duì)于這些實(shí)施方式的說(shuō)明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
實(shí)施例1
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入40g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
進(jìn)一步的，步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
實(shí)施例3
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入100g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
綜合實(shí)施例1至實(shí)施例3，
試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：相同的條件下，接種量為80g/l時(shí)多糖含量最高。
實(shí)施例4
本實(shí)施例與實(shí)施例2的區(qū)別在于，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為0.5cc/min。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
實(shí)施例5
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為1.0cc/min。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
實(shí)施例6
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為2.0cc/min。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
綜合實(shí)施例4至實(shí)施例6，
試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：相同的條件下，培養(yǎng)期間，通氣量保持在2.0cc/min時(shí)多糖含量最高。
實(shí)施例7
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為2.0cc/min。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d取出原培養(yǎng)液，并添加新鮮的培養(yǎng)液。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
實(shí)施例8
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無(wú)菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時(shí)間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為2.0cc/min。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d向反應(yīng)器內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)液。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時(shí)間：8～20小時(shí)/天，光照強(qiáng)度：50～80μmol/m2·s。
綜合實(shí)施例4至實(shí)施例6，
試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：相同的條件下，培養(yǎng)期間，每18d加1l培養(yǎng)液時(shí)多糖含量最高。
以上結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于所描述的實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。