本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種風(fēng)蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
風(fēng)蘭(Neofinetia falcate)是蘭科風(fēng)蘭屬(Neofinetia spp)的多年生附生蘭，株型小巧玲瓏，葉片革質(zhì)青翠，肥厚肉質(zhì)，花型奇特，花瓣反卷，猶如迎風(fēng)而來的玉精靈，花色潔白無瑕，花香迷人，陣陣幽香，發(fā)達(dá)的氣生根也惹人矚目；風(fēng)蘭的根、莖、葉和花均具有較高的觀賞價值，并能吸收環(huán)境中的污染物質(zhì)，凈化空氣，味道清幽，聞起來舒適宜人，風(fēng)韻高雅別致，也被稱為“軒蘭”“富貴蘭”，也有一定的藥用價值。
風(fēng)蘭在日本、韓國等有大量栽培，我國栽培較少，但是越來越受到人們的青睞和矚目，市場潛力巨大，前景廣闊。若沿用傳統(tǒng)的分株繁殖方法，繁殖系數(shù)低，增殖速度慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需要；若用種子播種，種子又存在發(fā)育不完全，難以萌發(fā)，變異變化大，難以保存親本的優(yōu)良性狀；風(fēng)蘭的繁殖系數(shù)低，成為制約其研究開發(fā)的瓶頸。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明針對風(fēng)蘭的繁殖系數(shù)低、增殖速度慢的問題，提供了一種風(fēng)蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，建立風(fēng)蘭的高效再生體系，可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化規(guī)?；a(chǎn)。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種風(fēng)蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，選取風(fēng)蘭的葉片作為組培用的外植體；對葉片進行珠芽誘導(dǎo)培養(yǎng)形成類原球莖；對類原球莖進行增殖培養(yǎng)，類原球莖通過循環(huán)發(fā)生和重復(fù)發(fā)生進行有效增殖，并逐漸分化形成不定芽；不定芽和類原球莖生根培養(yǎng)形成不定根后進行馴化移栽，然后正常培養(yǎng)。
進一步地，具體包括以下步驟：
步驟1，外植體的選擇及處理
選取風(fēng)蘭的葉片為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；
步驟2，類原球莖的誘導(dǎo)
將經(jīng)過消毒的外植體接種于類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ5.0mg/L上進行培養(yǎng)，葉片基部逐漸形成胚性愈傷組織，胚性愈傷組織逐漸形成類原球莖；
步驟3，類原球莖的增殖
將步驟2形成的類原球莖轉(zhuǎn)接到類原球莖增殖培養(yǎng)基MS+6BA2.0mg/L上進行培養(yǎng)，類原球莖通過重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生實現(xiàn)有效增殖，并逐漸形成不定芽；
步驟4，生根成苗及馴化移栽
將誘導(dǎo)出的不定芽和類原球莖轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L上進行培養(yǎng)，20～30天后，長出多條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)。
進一步地，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12～14h/d，光照強度為40～60u.Mol.m-2.s-1。
進一步地，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20～40g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6～7g/L，活性炭2g/L，椰子汁添加量為10％，培養(yǎng)基pH為5.8。
進一步地，所述煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。
進一步地，所述培養(yǎng)基質(zhì)為苔蘚。
進一步地，所述培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度80～90％，遮光50％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
(1)本發(fā)明通過選取風(fēng)蘭的葉片作為組培用的外植體；對葉片進行珠芽誘導(dǎo)培養(yǎng)形成類原球莖；類原球莖通過循環(huán)發(fā)生和重復(fù)發(fā)生進行有效增殖，并逐漸分化形成不定芽；不定芽和類原球莖生根培養(yǎng)形成不定根后進行馴化移栽，然后正常培養(yǎng)，解決了風(fēng)蘭的繁殖系數(shù)低、增殖速度慢的問題，建立了風(fēng)蘭的高效再生體系；
(2)通過葉片組織培養(yǎng)進行風(fēng)蘭快繁，不受地區(qū)、季節(jié)、氣候限制，可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化規(guī)?；a(chǎn)，而且遺傳性狀相對穩(wěn)定一致；
(3)為完善風(fēng)蘭的遺傳轉(zhuǎn)化體系，建立分子育種的平臺，從分子水平對其進行遺傳改良，深入研究開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。
當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
附圖說明
此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
圖1是本發(fā)明實施例風(fēng)蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖過程對比圖；圖中，A為風(fēng)蘭葉片基部誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織和類原球莖，B為類原球莖的增殖，C為類原球莖長出葉片和不定芽，D為類原球莖長出肉質(zhì)根，E為風(fēng)蘭生根成苗，F(xiàn)為風(fēng)蘭盆栽。
具體實施方式
以下將配合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
本發(fā)明一種風(fēng)蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，具體包括以下步驟：
步驟1，外植體的選擇及處理
選取風(fēng)蘭的葉片為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；
具體地，所述消毒具體為：將風(fēng)蘭葉片用洗潔精溶液清洗30min，期間不斷輕輕攪拌，然后流水沖洗30～60min，在已經(jīng)消毒的超凈工作臺上將上述清洗過的風(fēng)蘭葉片轉(zhuǎn)移至無菌燒杯中，用體積濃度為75％的酒精浸泡30～60s，期間不斷晃動燒杯，倒出酒精，再用質(zhì)量濃度0.1％的升汞浸泡3～5min，浸泡期間不斷輕輕晃動，倒出升汞后，用無菌水清洗經(jīng)過消毒的葉片3次以上。
步驟2，類原球莖的誘導(dǎo)
在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ：噻苯隆)上進行培養(yǎng)，20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織，再過20d后，胚性愈傷組織由黃變綠，形成小綠球，類原球莖形成，如圖1(A)所示；
培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12～14h/d，光照強度為40～60u.Mol.m-2.s-1。
類原球莖(Protocorm-like body,PLB)是胚胎發(fā)生與器官發(fā)育的整合體，是一種復(fù)合組織，是非常有效的再生繁殖方式，類原球莖可以進行增殖，以及重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生，類原球莖具有明顯的“兩極性”，可以同時“上面長芽，下面生根”，形成完整的植株。
步驟3，類原球莖的增殖
將步驟2形成的類原球莖轉(zhuǎn)接到類原球莖增殖培養(yǎng)基MS+6BA2.0mg/L(6BA：芐氨基嘌呤)上進行培養(yǎng)，類原球莖通過重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生實現(xiàn)有效增殖，如圖1(B)所示，并逐漸長出葉片和不定芽，如圖1(C)所示；
培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12～14h/d，光照強度為40～60u.Mol.m-2.s-1。
步驟4，生根成苗及馴化移栽
將誘導(dǎo)出的不定芽和類原球莖轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L(IBA：吲哚丁酸)上進行培養(yǎng)，20～30天后，長出多條肉質(zhì)不定根，如圖1(D)所示，生根成苗成為新的植株，如圖1(E)所示，煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)，如圖1(F)所示。
培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12～14h/d，光照強度為40～60u.Mol.m-2.s-1。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20～40g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6～7g/L，活性炭2g/L，椰子汁添加量為10％，培養(yǎng)基pH為5.8。
進一步地，所述煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。
優(yōu)選的，培養(yǎng)基質(zhì)為苔蘚，培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度80～90％，遮光50％。
本發(fā)明利用風(fēng)蘭葉片基部在高濃度的細(xì)胞分裂素下產(chǎn)生類原球莖，類原球莖既可以重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生的特點，又因其具有兩極性可誘導(dǎo)成為根深葉茂的優(yōu)質(zhì)種苗，以類原球莖為核心，類原球莖成為調(diào)控的靶標(biāo)，通過調(diào)控類原球莖的生長、分化和發(fā)育而實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模化生產(chǎn)，而且遺傳性狀相對穩(wěn)定一致。
實施例1
步驟1，外植體的選擇及處理
選取風(fēng)蘭的葉片為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；
步驟2，類原球莖的誘導(dǎo)
在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ：噻苯隆)上進行培養(yǎng)，20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織，再過20d后，由黃變綠，形成小綠球，類原球莖形成；
步驟3，類原球莖的增殖
將步驟2形成的類原球莖轉(zhuǎn)接到類原球莖增殖培養(yǎng)基MS+6BA2.0mg/L(6BA：芐氨基嘌呤)上進行培養(yǎng)，類原球莖通過重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生實現(xiàn)增殖，逐漸長出葉片和不定芽；
步驟4，生根成苗及馴化移栽
將誘導(dǎo)出的不定芽和類原球莖轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L(IBA：吲哚丁酸)上進行培養(yǎng)，逐漸長出多條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，將植株先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)(苔蘚)中，培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％，空氣相對濕度80％，遮光50％，進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12h/d，光照強度為60u.Mol.m-2.s-1。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6g/L，活性炭2g/L，椰子汁添加量為10％，培養(yǎng)基pH為5.8。
實施例2
步驟1，外植體的選擇及處理
選取風(fēng)蘭的葉片為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；
步驟2，類原球莖的誘導(dǎo)
在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ：噻苯隆)上進行培養(yǎng)，20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織，再過20d后，由黃變綠，形成小綠球，類原球莖形成；
步驟3，類原球莖的增殖
將步驟2形成的類原球莖轉(zhuǎn)接到類原球莖增殖培養(yǎng)基MS+6BA2.0mg/L(6BA：芐氨基嘌呤)上進行培養(yǎng)，類原球莖通過重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生實現(xiàn)增殖，逐漸長出葉片和不定芽；
步驟4，生根成苗及馴化移栽
將誘導(dǎo)出的不定芽和類原球莖轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L(IBA：吲哚丁酸)上進行培養(yǎng)，20～30天后，長出多條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，將植株先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)(苔蘚)中，培養(yǎng)基質(zhì)含水量23％，空氣相對濕度85％，遮光50％，進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為14h/d，光照強度為40u.Mol.m-2.s-1。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為30g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6.5g/L，活性炭2g/L，椰子汁添加量為10％，培養(yǎng)基pH為5.8。
實施例3
步驟1，外植體的選擇及處理
選取風(fēng)蘭的葉片為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；
步驟2，類原球莖的誘導(dǎo)
在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ：噻苯隆)上進行培養(yǎng)，20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織，再過20d后，由黃變綠，形成小綠球，類原球莖形成；
步驟3，類原球莖的增殖
將步驟2形成的類原球莖轉(zhuǎn)接到類原球莖增殖培養(yǎng)基MS+6BA2.0mg/L(6BA：芐氨基嘌呤)上進行培養(yǎng)，類原球莖通過重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生實現(xiàn)增殖，逐漸長出葉片和不定芽；
步驟4，生根成苗及馴化移栽
將誘導(dǎo)出的不定芽和類原球莖轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L(IBA：吲哚丁酸)上進行培養(yǎng)，20～30天后，長出多條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)(苔蘚)中，培養(yǎng)基質(zhì)含水量20％，空氣相對濕度90％，遮光50％，進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為13h/d，光照強度為50u.Mol.m-2.s-1。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為40g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為7g/L，活性炭2g/L，椰子汁添加量為10％，培養(yǎng)基pH為5.8。
實施例4
步驟1，外植體的選擇及處理
選取風(fēng)蘭的葉片為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；
步驟2，類原球莖的誘導(dǎo)
在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的剪刀將葉片基部向下插入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ5.0mg/L(TDZ：噻苯隆)上進行培養(yǎng)，20d后葉片基部形成黃色的胚性愈傷組織，再過20d后，由黃變綠，形成小綠球，類原球莖形成；
步驟3，類原球莖的增殖
將步驟2形成的類原球莖轉(zhuǎn)接到類原球莖增殖培養(yǎng)基MS+6BA2.0mg/L(6BA：芐氨基嘌呤)上進行培養(yǎng)，類原球莖通過重復(fù)發(fā)生和循環(huán)發(fā)生實現(xiàn)增殖，逐漸長出葉片和不定芽；
步驟4，生根成苗及馴化移栽
將誘導(dǎo)出的不定芽和類原球莖轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA1.0mg/L(IBA：吲哚丁酸)上進行培養(yǎng)，20～30天后，長出多條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)(苔蘚)中，培養(yǎng)基質(zhì)含水量18％，空氣相對濕度85％，遮光50％，進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為13h/d，光照強度為55u.Mol.m-2.s-1。
其中，類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、類原球莖增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為25g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6.8g/L，活性炭2g/L，椰子汁添加量為10％，培養(yǎng)基pH為5.8。
采用本發(fā)明類原球莖的繁殖方法對風(fēng)蘭葉片組織培養(yǎng)繁殖與采用傳統(tǒng)的分株繁殖方法對風(fēng)蘭繁殖的繁殖系數(shù)的數(shù)據(jù)對比見表1：
表1本發(fā)明繁殖方法與傳統(tǒng)繁殖方法對風(fēng)蘭增殖系數(shù)的影響
由表1可以看出，采用本發(fā)明的繁殖方法對風(fēng)蘭進行繁殖，其增殖系數(shù)呈現(xiàn)幾何基數(shù)式增長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的分株繁殖方式，采用上述方法通過葉片組織培養(yǎng)進行風(fēng)蘭快繁，繁殖系數(shù)高，增殖速度快，且不受地區(qū)、季節(jié)、氣候限制，可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化規(guī)?；a(chǎn)。
如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權(quán)利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開放式用語，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還存在另外的相同要素。
上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。