廣東崖豆藤的組培育苗方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種廣東崖豆藤的組培育苗方法。本發(fā)明的方法包括種子消毒與催芽、選萌發(fā)的無菌胚軸為外植體、不定芽增殖、生根培養(yǎng)、煉苗和移栽，獲得廣東崖豆藤種苗。其中，繼代增殖培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基+6-BA 0.3～0.5mg/L+TDZ 0.06～0.1mg/L+NAA 0.15～0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.5～5.8。利用本發(fā)明的方法培育廣東崖豆藤種苗具有遺傳穩(wěn)定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作簡便的特征；且實驗設施要求不高，操作過程簡單，實現(xiàn)了規(guī)?；敝硰V東崖豆藤種苗，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
【專利說明】廣東崖豆藤的組培育苗方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于應用生物學、農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領域】，特別涉及一種廣東崖豆藤的組培育苗方法。

【背景技術(shù)】
[0002]廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)產(chǎn)于廣東、廣西，生于海拔500米左右的山谷疏林中。藤本；羽狀復葉；總狀花序通常腋生；莢果線形；種子褐色，卵形，長約7毫米，寬約6毫米，光滑；花期9?10月，果期11月。
[0003]民間認為廣東崖豆藤具有潤肺止咳、健脾補虛、壯陽補腎等功效。因此，在廣西梧州地區(qū)和廣州帽峰山一帶，盛行用廣東崖豆藤的根與豬骨配伍煲湯。由于人工無序采挖，導致野外資源日漸減少，市場價格逐年升高。廣州市大有玉鉉農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司為緩解市場的緊缺需求，決定建立廣東崖豆藤的規(guī)?；斯しN植基地。但因廣東崖豆藤目前仍屬野生狀態(tài)，種子來源極少，扦插繁殖速度慢，急需解決種苗的供應問題。
[0004]植物的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)具有占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制，投資少，經(jīng)濟效益高等優(yōu)勢，通過無菌操作，在人工控制條件下短時間大量繁殖目標植物，獲得再生的完整植株。迫切需要研宄開發(fā)廣東崖豆藤的組織培養(yǎng)技術(shù)，通過組培技術(shù)實現(xiàn)廣東崖豆藤種苗的規(guī)?；敝?，解決廣東崖豆藤種子少、制約生產(chǎn)發(fā)展的難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有繁殖技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種廣東崖豆藤的組培育苗方法。利用該方法培育廣東崖豆藤種苗具有遺傳穩(wěn)定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作簡便的特征；且實現(xiàn)了規(guī)?；敝硰V東崖豆藤種苗，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種廣東崖豆藤的組培育苗方法，包括種子消毒與催芽、不定芽增殖、生根培養(yǎng)和試管苗移栽步驟:將均勻飽滿的廣東崖豆藤種子用體積濃度為75%的酒精和lg/L的氯化汞消毒后，播入無菌的濕潤紗布或MS培養(yǎng)基中；以萌芽種子的胚軸為外植體，在MS+6BA+TDZ+NAA培養(yǎng)基上進行不定芽分化、增殖，在1/2MS+IBA培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，生根苗煉苗后移栽，形成完成的植株再生體系。
[0007]所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，包括如下步驟:
[0008](I)種子消毒與催芽:選擇均勻飽滿的廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子，先用自來水沖洗，再在無菌室消毒后，進行催芽；
[0009](2)選擇外植體:選擇步驟⑴催芽后萌發(fā)的無菌胚軸為外植體；
[0010](3)不定芽增殖:將步驟(2)的外植體接種于繼代增殖培養(yǎng)基上，進行增殖培養(yǎng)，獲得不定芽；
[0011](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上誘導生根，獲得生根苗；
[0012](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗，煉苗后移栽，獲得廣東崖豆藤種苗。
[0013]步驟(I)中所述的消毒的條件優(yōu)選為用75% (v/v)酒精消毒8?15min，用無菌水沖洗2?3次；再用lg/L氯化汞消毒4?8min，用無菌水沖洗4?6次；
[0014]步驟(I)中所述的催芽的條件優(yōu)選為將消毒后的種子接種到無菌的濕潤紗布或MS培養(yǎng)基中，催芽20?30天，溫度20?25 °C，光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux ；
[0015]步驟(3)中所述的繼代增殖培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+6-BA 0.3?0.5mg/L+TDZ 0.06 ?0.lmg/L+NAA 0.15 ?0.3mg/L+蔗糖 30g/L+卡拉膠 5.8g/L，pH值 5.5 ?5.8 ；所述的6-BA指6-芐基腺嘌呤；所述的NAA，指a-萘乙酸；所述的TDZ指噻重氮苯基脲，商品名噻苯隆(Thidiazuron，N-Phenyl_N，-l，2, 3-thiadiazol_5-ylurea，N-苯基-N-1, 2, 3-噻二唑-5-脲，TDZ)；
[0016]步驟(3)中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為溫度24?30°C，培養(yǎng)24?30天、相對濕度60%?70%、光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux ；
[0017]步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為1/2MS培養(yǎng)基+IBA 0.3?0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.5?5.8 ;所述的IBA，指吲哚丁酸；所述的1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基的大量元素減半；
[0018]步驟(4)中所述的誘導生根的條件優(yōu)選為溫度28?32°C，相對濕度75%?90%，光照條件為接種后先暗培養(yǎng)5天、隨后用自然散射光培養(yǎng)25?30天，光照時間12h/d ;
[0019]步驟(5)中所述的煉苗的條件優(yōu)選為將生根苗轉(zhuǎn)入薄膜大棚后，煉苗25?30天；
[0020]步驟(5)中所述的移栽的條件優(yōu)選為煉苗后移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網(wǎng)，移栽7?10天后，噴施0.1 % (m/m)的殺菌藥一次，30?40天后掀去薄膜和遮陽網(wǎng)；
[0021]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0022](I)通過本發(fā)明的方法獲得的種苗遺傳性狀好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。本發(fā)明采用的材料為優(yōu)良種子，依據(jù)植物細胞的全能性，每個種子繁育的后代遺傳性非常一致，能夠保持原有品種的優(yōu)良性狀。
[0023](2)實驗設施要求不高，操作過程簡單。采用本發(fā)明培育廣東崖豆藤種苗，所需的儀器和藥品均為組培常規(guī)設備和常用藥品，所涉及的外植體選擇與消毒、不定芽增殖、生根培養(yǎng)和試管苗移栽等操作過程，一般人員經(jīng)過培訓均可達到技術(shù)要求，一般的組培廠均能依照本發(fā)明開展廣東崖豆藤的組培生產(chǎn)。
[0024](3)本發(fā)明的方法具有繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉的特點。
[0025](4)繁殖系數(shù)高，可規(guī)模化生產(chǎn)廣東崖豆藤種苗。本發(fā)明的廣東崖豆藤組培育苗技術(shù)，是在人工控制條件下的進行生產(chǎn)，受自然環(huán)境中影響較??；只需截取種子胚軸作為繁殖材料，25天增殖一次，增殖倍數(shù)達到4.2，30天可完成生根培養(yǎng)，生根率達到60%以上；利用本發(fā)明可以周年開展、工廠化大量繁殖廣東崖豆藤種苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是實施例1中接種到繼代增殖培養(yǎng)基10天后不定芽增殖的示意圖。
[0027]圖2是實施例1中接種到繼代增殖培養(yǎng)基25天后不定芽增殖的示意圖。
[0028]圖3是實施例1中接種到生根培養(yǎng)基20天后生根苗的示意圖。
[0029]圖4是實施例1中接種到生根培養(yǎng)基30天后生根苗的示意圖。
[0030]圖5是實施例1中移栽以黃心土為基質(zhì)的育苗袋中15天后生根苗的示意圖。
[0031]圖6是實施例1中移栽以黃心土為基質(zhì)的育苗袋中30天后生根苗的示意圖。
[0032]圖7是實施例2中接種到繼代增殖培養(yǎng)基13天后不定芽增殖的示意圖。
[0033]圖8是實施例2中接種到繼代增殖培養(yǎng)基28天后不定芽增殖的示意圖。
[0034]圖9是實施例2中接種到生根培養(yǎng)基20天后生根苗的示意圖。
[0035]圖10是實施例2中接種到生根培養(yǎng)基30天后生根苗的示意圖。
[0036]圖11是實施例2中移栽以黃心土為基質(zhì)的育苗袋中10天后生根苗的示意圖。
[0037]圖12是實施例2中移栽以黃心土為基質(zhì)的育苗袋中25天后生根苗的示意圖。
[0038]圖13是實施例3中接種到繼代增殖培養(yǎng)基15天后不定芽增殖的示意圖。
[0039]圖14是實施例3中接種到繼代增殖培養(yǎng)基25天后不定芽增殖的示意圖。
[0040]圖15是實施例3中接種到生根培養(yǎng)基15天后生根苗的示意圖。
[0041]圖16是實施例3中接種到生根培養(yǎng)基30天后生根苗的示意圖。
[0042]圖17是實施例3中移栽以黃心土為基質(zhì)的育苗袋中12天后生根苗的示意圖。
[0043]圖18是實施例3中移栽以黃心土為基質(zhì)的育苗袋中30天后生根苗的示意圖。

【具體實施方式】
[0044]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0045]實施例1
[0046](I)種子消毒與催芽:廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子購自廣州市大有玉鉉農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；挑選成熟、飽滿、均勻的種子，用自來水仔細清洗表皮后，放置于超凈工作臺上；在消毒瓶中倒入75%的酒精，左右晃動，消毒8min，用無菌水沖洗2次；再倒入lg/L的氯化汞消毒4min，最后用無菌水沖洗4次；放置在無菌的濕潤紗布中，用紗布把種子覆蓋。消毒后種子的無污染率可達70.6%。
[0047](2)選擇外植體:種子接種15天后，開始萌芽；30天時，萌芽長至3cm高，挑選無污染的健壯的萌芽條，切掉胚根和子葉后，取胚軸作為外植體?？偘l(fā)芽率達85.0%。
[0048](3)不定芽增殖:將步驟(2)獲得的外植體接種于繼代增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+6-BA 0.3mg/L+TDZ 0.lmg/L+NAA 0.15mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.5)上，進行增殖培養(yǎng)，獲得不定芽；培養(yǎng)條件:溫度24°C、相對濕度60%、光照時間12h/d、光強強度3，OOOlux，每25天將增殖的不定芽轉(zhuǎn)接一次，試驗結(jié)果見圖1和圖2 ;繼代增殖倍數(shù)可達
3.2。
[0049](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的不定芽，在超凈工作臺上切成2?2.5cm長，接種于生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+IBA 0.3mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.5)上培養(yǎng)，獲得生根苗；培養(yǎng)條件:溫度28°C、相對濕度75%、光照條件為接種后先暗培養(yǎng)5天、隨后用自然散射光培養(yǎng)25天，光照時間12h/d，試驗結(jié)果見圖3和圖4 ;生根率達62%。
[0050](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗轉(zhuǎn)入薄膜大棚后，煉苗30天、待根系長至I?2cm后，取出瓶苗，洗掉培養(yǎng)基后移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網(wǎng)，移栽7天后，噴0.1% (m/m)的殺菌藥一次，30天后掀去薄膜和遮陽網(wǎng)，獲得廣東崖豆藤種苗，用苗圃的常規(guī)方法進行管理，試驗結(jié)果見圖5和圖6。
[0051]實施例2
[0052](I)種子消毒與催芽:廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子購自廣州市大有玉鉉農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；挑選成熟、飽滿、均勻的種子，用自來水仔細清洗表皮后，放置于超凈工作臺上；在消毒瓶中倒入75%的酒精，左右晃動，消毒12min，用無菌水沖洗2次；再倒入lg/L的氯化未消毒6min，最后用無菌水沖洗4次；放置在無菌的濕潤紗布中，用紗布把種子覆蓋。消毒后種子的無污染率可達73%。
[0053](2)選擇外植體:種子接種15天后，開始萌芽；30天時，萌芽長至3cm高，挑選無污染的健壯的萌芽條，切掉胚根和子葉后，取胚軸作為外植體?？偘l(fā)芽率達85.2%。
[0054](3)不定芽增殖:將步驟(2)獲得的外植體接種于繼代增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.08mg/L+NAA 0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.6)上，進行增殖培養(yǎng)，獲得不定芽；培養(yǎng)條件:溫度28°C、相對濕度65%、光照時間12h/d、光強強度2，5001ux,每25天將增殖的不定芽轉(zhuǎn)接一次，試驗結(jié)果見圖7和圖8 ;繼代增殖倍數(shù)可達
3.8。
[0055](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+IBA0.35mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.7)上培養(yǎng)，獲得生根苗；培養(yǎng)條件:溫度30°C、相對濕度80%、光照條件為接種后先暗培養(yǎng)5天、隨后用自然散射光培養(yǎng)25天，光照時間12h/d，試驗結(jié)果見圖9和圖10 ;生根率達64%。
[0056](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗轉(zhuǎn)入薄膜大棚后，煉苗30天、待根系長至I?2cm后，取出瓶苗，洗掉培養(yǎng)基后移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網(wǎng)，移栽8天后，噴0.1% (m/m)的殺菌藥一次，35天后掀去薄膜和遮陽網(wǎng)，獲得廣東崖豆藤種苗，用苗圃的常規(guī)方法進行管理，試驗結(jié)果見圖11和圖12。
[0057]實施例3
[0058](I)種子消毒與催芽:廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子購自廣州市大有玉鉉農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；挑選成熟、飽滿、均勻的種子，用自來水仔細清洗表皮后，放置于超凈工作臺上；在消毒瓶中倒入75%的酒精，左右晃動，消毒15min，用無菌水沖洗2次；再倒入lg/L的氯化汞消毒8min，最后用無菌水沖洗4次；放置在無菌的濕潤紗布中，用紗布把種子覆蓋。消毒后種子的無污染率可達90%。
[0059](2)選擇外植體:種子接種15天后，開始萌芽；30天時，萌芽長至3cm高，挑選無污染的健壯的萌芽條，切掉胚根和子葉后，取胚軸作為外植體?？偘l(fā)芽率達86%。
[0060](3)不定芽增殖:將步驟(2)獲得的外植體接種于繼代增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+6-BA 0.5mg/L+TDZ 0.lmg/L+NAA 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.8)上，進行增殖培養(yǎng)，獲得不定芽；培養(yǎng)條件:溫度30°C、相對濕度70%、光照時間12h/d、光強強度2，OOOlux，每25天將增殖的不定芽轉(zhuǎn)接一次，試驗結(jié)果見圖13和圖14 ;繼代增殖倍數(shù)可達
4.2。
[0061](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+IBA0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.8)上培養(yǎng)，獲得生根苗；培養(yǎng)條件:溫度32°C、相對濕度90%、光照條件為接種后先暗培養(yǎng)5天、隨后用自然散射光培養(yǎng)25天，光照時間12h/d，試驗結(jié)果見圖15和圖16 ;生根率達64.6%。
[0062](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗轉(zhuǎn)入薄膜大棚后，煉苗30天、待根系長至I?2cm后，取出瓶苗，洗掉培養(yǎng)基后移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網(wǎng)，移栽10天后，噴0.1% (m/m)的殺菌藥一次，40天后掀去薄膜和遮陽網(wǎng)，獲得廣東崖豆藤種苗，用苗圃的常規(guī)方法進行管理，試驗結(jié)果見圖17和圖18。
[0063]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于包括如下步驟: (1)種子消毒與催芽:選擇均勾飽滿的廣東崖豆藤(Millettiafordii Dunn)種子，先用自來水沖洗，再在無菌室消毒后，進行催芽； (2)選擇外植體:選擇步驟(I)催芽后萌發(fā)的無菌胚軸為外植體； (3)不定芽增殖:將步驟(2)的外植體接種于繼代增殖培養(yǎng)基上，進行增殖培養(yǎng)，獲得不定芽； (4)生根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上誘導生根，獲得生根苗； (5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗，煉苗后移栽，獲得廣東崖豆藤種苗； 步驟(3)中所述的繼代增殖培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基+6-BA 0.3?0.5mg/L+TDZ0.06 ?0.lmg/L+NAA 0.15 ?0.3mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.5 ?5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的消毒的條件為用體積分數(shù)75%酒精消毒8?15min，用無菌水沖洗2?3次；再用lg/L氯化未消毒4?8min，用無菌水沖洗4?6次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的催芽的條件為將消毒后的種子接種到無菌的濕潤紗布或MS培養(yǎng)基中，催芽20?30天，溫度20?25°C，光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的培養(yǎng)的條件為溫度24?30°C，培養(yǎng)24?30天、相對濕度60%?70%、光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟⑷中所述的生根培養(yǎng)基的組成為1/2MS培養(yǎng)基+IBA 0.3?0.4mg/L+蔗糖15g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.5 ?5.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的誘導生根的條件為溫度28?32°C，相對濕度75%?90%，光照條件為接種后先暗培養(yǎng)5天、隨后用自然散射光培養(yǎng)25?30天，光照時間12h/d。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟(5)中所述的煉苗的條件為將生根苗轉(zhuǎn)入薄膜大棚后，煉苗25?30天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特征在于: 步驟(5)中所述的移栽的條件為煉苗后移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網(wǎng)，移栽7?10天后，噴施質(zhì)量百分比0.1 %的殺菌藥一次，30?40天后掀去薄膜和遮陽網(wǎng)。
【文檔編號】A01H4/00GK104429971SQ201410798739
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】曾雷, 謝鑒能, 溫依嬌 申請人:曾雷, 謝鑒能